劉 燕，孫曼怡，馮 憑

（天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院代謝病科，天津300052）

糖尿病結(jié)腸動力障礙是糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）病人常見的并發(fā)癥，嚴(yán)重影響著患者的生活質(zhì)量，但目前對結(jié)腸動力障礙重視不夠，其發(fā)病機制尚不完全清楚。研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸動力障礙可能與微血管病變、胃腸激素分泌異常、自主神經(jīng)功能障礙、高血糖、平滑肌損害等因素有關(guān)，但平滑肌細胞凋亡在結(jié)腸動力障礙中的作用機制研究不多。目前研究發(fā)現(xiàn)細胞凋亡在DM及其部分并發(fā)癥的發(fā)生中起重要作用[1]。細胞凋亡是由基因控制的細胞有序性死亡。有兩類基因調(diào)節(jié)細胞凋亡：凋亡抑制基因和凋亡促進基因，其中Bcl-2是凋亡抑制基因，Bax是凋亡促進基因。本研究采用實時熒光定量PCR法，檢測平滑肌細胞中Bax、Bcl-2的表達，從mRNA水平研究平滑肌凋亡在糖尿病SD大鼠結(jié)腸動力障礙發(fā)病機制中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 雄性Sprague-Dawley大鼠25只，體重200～250g（中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心）。

1.1.2 主要試劑與儀器 鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）（聯(lián)星公司，天津）；活性炭（聯(lián)星公司，天津）；高純總RNA快速提取試劑盒（Bioteke公司，北京）；逆轉(zhuǎn)錄酶（TaKaRa，大連）；Bax、Bcl-2、β-actin基因引物（寶生物工程有限公司，大連）；SYBR Premix Ex TaqTM（TaKaRa，大連）；胰島素試劑盒（九鼎醫(yī)學(xué)生物工程有限公司，天津）；ABI 7500Real Time PCR擴增儀、順序檢測系統(tǒng)（AB公司，美國）；PCR擴增儀（Biometra，德國）；電泳儀（Bio-RAD，美國）；凝膠成像儀（Bio-RAD，美國）；分光光度計（Bio-RAD，美國）。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗分組和糖尿病模型建立 25只大鼠隨機分為正常對照組10只和糖尿病組15只。糖尿病組一次性鼠尾靜脈注射STZ 40mg/kg，對照組鼠尾靜脈注射等量0.1mol/L枸櫞酸緩沖液，72h后尾靜脈采血，測得血糖≥16.7mmol/L且能維持1周以上者為造模成功。結(jié)果有1只未成功，隨機選12只作為糖尿病組，兩組大鼠均給予普通飼料飼養(yǎng)，不使用胰島素及降糖藥，持續(xù)10周，每周鼠尾靜脈采血，用拜安捷血糖儀測空腹血糖。

1.2.2 胃腸推進率測定 成模10周末，禁食12h后，兩組大鼠給予100g/L活性炭（10ml/kg）灌胃。30min后鼠股靜脈取血，放入促凝管中，用于測胰島素水平。然后復(fù)合麻醉劑腹腔注射麻醉，剖腹測量幽門括約肌至肛門的長度及活性炭前端至幽門括約肌的距離。

胃腸推進率=活性炭前端至幽門括約肌的距離/幽門括約肌至肛門的長度×100%

1.2.3 標(biāo)本收集和處理 取結(jié)腸1.0g，DEPC水沖洗后，放入裝有0.3mL TRIzol的凍存管中，液氮中保存。另取結(jié)腸放入裝有10%的中性福爾馬林瓶中，石蠟包埋，HE染色觀察結(jié)腸平滑肌的變化。

1.2.4 高純總RNA提取與cDNA合成 利用高純總RNA提取試劑盒，根據(jù)說明書提取總RNA。經(jīng)凝膠電泳后，利用凝膠成像儀觀察RNA的完整性，利用分光光度計檢測RNA的濃度。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系：模板RNA 2μg，Oligo(dT)Primer（50μmol）4μL，無酶水18μL，70℃保溫10min，5×緩沖液8μL，dNTP混合液2μL，Rnase Inhibitor 1μL，Rnase M-MLV 1.2μL，加無酶水，至總量40μL。42℃保溫1h，70℃保溫15min，反應(yīng)結(jié)束后放入-20℃保存。

1.2.5 引物設(shè)計和合成 引物序列如下：Bcl-2：5′-TGAACCGGCATCTGCACAC-3′，5′-CGTCTTCAGA GACAGCCAGGAG-3′，預(yù)計擴增片段115bp；Bax：5′-aCACCTGAGCTGACCTTGGA-3′，5′-CCGTGTCCACGTCAGCAATC-3′，預(yù)計擴增片段133bp；βactin：5′-TCTTGCAGCTCCTCCGTCGC-3′，5′-CTTGCT CTGGGCCTCGTCGC-3′，預(yù)計擴增片段229bp。1.2.6熒光實時定量PCR定量檢測 反應(yīng)體系如下：SYBR Premix Ex Taq(2×)12.5μL，引物（10μmol）1μL，ROX Reference DyeⅡ（50×）0.5μL，cDNA模板2.0μL，滅菌蒸餾水9.0μL，總體積25μL。擴增標(biāo)準(zhǔn)程序：95℃預(yù)變性30s，95℃3s，60℃30s，40個循環(huán)。以前12個循環(huán)的熒光值作為熒光本底信號，第4～12個循環(huán)的標(biāo)準(zhǔn)差的10倍設(shè)定閾值，以β-actin為內(nèi)參，分別得出每個樣本的Bax、Bcl-2的CT值，相減后得出ΔCT值即是mRNA的相對表達量。ΔCT值越大，其表達量越少。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS16.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，各組計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。用One-Way ANOVA(單因素方差分析)進行各組間比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 體重、空腹血糖、胰島素水平 成模第10周時，糖尿病模型組體重明顯低于正常對照組；其空腹血糖水平顯著高于正常對照組；糖尿病組胰島素水平顯著低于正常對照組，兩組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，見表1。

2.2 胃腸推進率 成模第10周時，糖尿病模型組胃腸推進率低于正常對照組，見表1。

表1 兩組體重、空腹血糖、胰島素水平、胃腸推進率比較Tab 1 Comparison of weight,fasting blood glucose,insulin levels, gastrointestinal propulsion rate between two groups

2.3 結(jié)腸平滑肌HE染色結(jié)果 對照組結(jié)腸平滑肌包括縱行肌和環(huán)行肌，肌層厚；糖尿病組平滑肌肌層變薄，肌細胞數(shù)目減少，見圖1、2。

圖1 對照組結(jié)腸平滑肌（HE×200）Fig 1 Colonic smooth muscle in the normal group（HE×200）

圖2 糖尿病組結(jié)腸平滑?。℉E×200）Fig 2 Clonic smooth muscle in the diabetic group（HE×200）

2.4 結(jié)腸平滑肌細胞的總RNA抽提結(jié)果 提取的總RNA采用分光光度計測濃度，A260/A280值為1.8～2.0，0.8%瓊脂糖凝膠電泳后，在凝膠成像儀上觀察，結(jié)果顯示28s比18s亮，比例約為2:1，5s幾乎看不見，見圖3。

2.5 熒光實時定量PCR結(jié)果分析 成模第10周時，糖尿病組Bax表達量高于正常對照組（P＜0.05）；糖尿病組Bcl-2表達量低于正常對照組（P＜0.05），差異有統(tǒng)計學(xué)意義。見表2。

圖3 總RNA電泳結(jié)果Fig 3 The electrophoresis results of total RNA

表2 兩組Bax和Bcl-2的mRNA表達量比較Tab 2 Comparison of Bax and Bcl-2mRNA express quantity between two groups

溶解曲線圖顯示，擴增目的基因Bax、Bcl-2、βactin的溶解溫度（Tm）值分別為86.6℃、84.8℃、77.1℃，無非特異擴增。

3 討論

糖尿病是一種以血糖升高為主要表現(xiàn)的慢性疾病，胰島B細胞的凋亡是其發(fā)病的重要機制[2]。國外研究發(fā)現(xiàn)50%～60%的糖尿病患者合并有結(jié)腸動力障礙，該病主要表現(xiàn)為腹部不適、腹脹、腹瀉和便秘等，其病理生理特點為：結(jié)腸張力低下，收縮力下降，蠕動減慢，排空延遲。超聲檢查發(fā)現(xiàn)糖尿病病人結(jié)腸擴張，動力下降。本實驗發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠的胃腸推進率比對照組明顯減慢，提示結(jié)腸蠕動減慢。

1型糖尿病存在著胰島素絕對缺乏，血糖升高，高糖誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞、胰島細胞、神經(jīng)細胞、耳蝸細胞等細胞的凋亡。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病組胰島素水平明顯低于對照組，HE染色發(fā)現(xiàn)糖尿病組結(jié)腸平滑肌變薄，肌細胞數(shù)目減少，這說明高糖可能誘導(dǎo)平滑肌細胞的凋亡。

林琳等[3]對糖尿病大鼠模型研究發(fā)現(xiàn)，胰島素缺乏，Cajal間質(zhì)細胞(inte-rstitial cells of Cajal，ICC)的凋亡與結(jié)腸動力障礙發(fā)病機制有關(guān)。ICC是胃腸動力的“起搏”細胞，而平滑肌細胞是胃腸機械活動的基礎(chǔ)，平滑肌細胞的凋亡也可能會影響胃腸運動。細胞凋亡受基因調(diào)控，Bcl-2蛋白家族被認為是最重要的細胞凋亡調(diào)控基因之一，Bcl-2是一種凋亡抑制基因，而Bax是一種促凋亡基因，兩者間相互作用調(diào)控細胞凋亡[4]。Bcl-2是B淋巴細胞瘤／白血病-2基因的簡稱,是第一個被發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制基因，是線粒體上的一種跨膜蛋白[5]。Bcl-2廣泛存在于造血細胞、上皮細胞、淋巴細胞、神經(jīng)細胞及多種腫瘤細胞，其抗凋亡的機制目前認為主要有：（1）拮抗促凋亡基因Bax；（2）抑制促凋亡的蛋白質(zhì)細胞色素c自線粒體釋放到胞質(zhì)；（3）阻止胞質(zhì)中的細胞色素c激活caspase；（4）有抗氧化及維持細胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)等作用。Korsmeyer等發(fā)現(xiàn)促凋亡基因Bax屬于Bcl-2基因家族，與Bcl-2具有高度同源性，編碼的Bax蛋白可以與Bcl-2形成二聚體，對Bcl-2有抑制作用，促進細胞凋亡[6]；Bax的表達更為廣泛，它可出現(xiàn)在肝細胞、腎小管上皮細胞、呼吸系上皮細胞和支氣管平滑肌、血管平滑肌細胞中。近年研究發(fā)現(xiàn)Bax/Bcl-2兩蛋白之間的比例關(guān)系是決定對細胞凋亡抑制作用強弱的關(guān)鍵因素[7]，當(dāng)Bax蛋白表達比Bcl-2蛋白明顯增多時，所有的Bcl-2蛋白被結(jié)合而剩余的Bax蛋白誘導(dǎo)細胞凋亡，反之，Bcl-2多于Bax時，Bcl-2蛋白抑制細胞凋亡。糖尿病腎病、糖尿病微血管病變及糖尿病神經(jīng)病變等糖尿病并發(fā)癥均有Bcl-2凋亡基因家族的參與。在DM合并微血管疾病時Bax及Bcl-2對于內(nèi)皮細胞凋亡的發(fā)生起到重要作用從而加重微血管病變、延遲組織愈合及再生[8]。Jafari Anarkooli等[9]研究證實DM合并海馬病變時Bax表達增強、Bcl-2表達減弱導(dǎo)致了海馬部位的細胞發(fā)生凋亡。

本研究熒光實時定量PCR顯示糖尿病組大鼠結(jié)腸平滑肌組織Bcl-2的表達低于對照組，Bax的表達高于對照組。這些結(jié)果說明隨著Bax表達量上升，Bcl-2與Bax形成二聚體后，剩余的Bax誘導(dǎo)平滑肌細胞凋亡。體內(nèi)、體外實驗研究表明，Bcl-2和Bax參與了糖尿病中細胞凋亡的發(fā)生。另外，Horvtth等[10]研究發(fā)現(xiàn)胰島素缺乏可造成ICC缺失，以及電起搏受損，是糖尿病胃腸動力障礙發(fā)病的關(guān)鍵。Forster等[11]在糖尿病患者的活檢中發(fā)現(xiàn)胃中ICC數(shù)目減少。Takashi等[12]研究發(fā)現(xiàn)，平滑肌內(nèi)皮素受體介導(dǎo)的信號增強，與糖尿病胃病的發(fā)病機制有關(guān)。但是結(jié)腸平滑肌異常與結(jié)腸動力障礙之間究竟存在著怎樣的病理生理聯(lián)系、結(jié)腸平滑肌細胞的凋亡與ICC之間是否存在聯(lián)系等問題需要進一步研究闡明。

綜上所述，平滑肌細胞的凋亡及Bax、Bcl-2的異常表達可能參與了糖尿病結(jié)腸動力障礙的進展過程。

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