趙 紅，徐 梅，初桂蘭

（天津醫(yī)科大學總醫(yī)院兒科，天津300052）

缺氧缺血性腦損傷（hypoxic-ischemic brain damage，HIBD）大多源于胎兒宮內(nèi)窘迫及新生兒窒息，是新生兒期危害極大的常見病，也是新生兒死亡的主要原因。近年來研究發(fā)現(xiàn)在缺氧、缺血過程中心肌細胞除發(fā)生壞死外還發(fā)生凋亡，且在缺氧、缺血早期凋亡細胞數(shù)量多于壞死細胞[1]。鈣蛋白酶1（Calpain-1）與心肌細胞的凋亡關(guān)系密切，又由于其在心肌細胞中的特殊分布，從而引起廣泛的關(guān)注。本研究擬構(gòu)建新生大鼠HIBD模型，觀察Calpain-1在HIBD大鼠心肌中的表達，探討其在心肌細胞凋亡發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 新生7日齡Wistar大鼠64只，健康，雌雄不限，體質(zhì)量12～18g，由中國醫(yī)學科學院放射研究所實驗動物中心提供。隨機分為假手術(shù)對照組、HIBD后2、12、24h及2、3、5、7d各組，每組各8只大鼠。各組平均體質(zhì)量差別無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

1.1.2 主要儀器及試劑 在GenBank中查找到大鼠Calpain-1mRNA（NM-019152.2），Calpain-1、Rat Actin-bate（上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司設(shè)計并合成），Taq酶、dNTP Mixture、Ribonuclease inhibitor、Random Primer、cDNA合成試劑盒（Takara公司,中國），總RNA提取試劑（Invitrogen公司,美國），DEPC(Promega,美國)，Marker及兔抗大鼠calpain-1抗體、β-Actin、RIPA組織細胞裂解試劑盒(Santa cruz公司,美國)，HRP標記的羊抗鼠IgG(北京中山公司)，ECL試劑盒(Thermo公司,美國)，Bio-Rad DC protein assay試劑盒 (Bio-Rad公司)，PVDF膜(Millipore公司)，Bio-Rad電泳儀及電泳槽及凝膠成像系統(tǒng)Kodak 440CF(Kodak，美國)，熒光倒置相差顯微鏡（Olympus公司，日本）等。TUNEL試劑盒(KeyDEN公司)。

1.2 方法

1.2.1 HIBD模型的建立及組織制備 采用改良的Rice法[2]構(gòu)建新生大鼠HIBD模型，大鼠行頸正中切口，分離左側(cè)頸總動脈后雙重結(jié)扎，并從兩重結(jié)扎線中間剪斷血管。術(shù)后將HIBD組大鼠置于缺氧箱中，持續(xù)通入8%O2+92%N2的混合氣體2h，氣流量1L/min。蘇醒后返回母鼠身邊繼續(xù)喂養(yǎng)，代乳后飼養(yǎng)環(huán)境一致，假手術(shù)組頸總動脈僅分離不結(jié)扎不做缺氧處理。HIBD組在設(shè)定時點HIBD后2、12、24h及2、3、5、7d斷頭處死，迅速取出心臟分成2部分，一部分置于液氮中保存?zhèn)溆?，另一部分?jīng)10%甲醛固定、石蠟包埋后制成切片。假手術(shù)對照組與HIBD后2h組同時處死。

1.2.2 TUNEL檢測的操作步驟及結(jié)果判定 石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度乙醇水合，0.1mol/L PBS（pH7.4）浸浴15min×2次；封閉液室溫固定30min后PBS浸浴15min×2次；透膜液室溫浸浴3～5min；玻片在PBS緩沖液中浸浴5min×2次；加TUNEL標記反應(yīng)混合物20～25μL，濕盒內(nèi)37℃孵育1h，輕輕搖洗5min×3次；拋去PBS，每張蓋玻片加1：1000的HOCHEST染核，暗室內(nèi)室溫孵育10min；再經(jīng)PBS搖洗5min×3次拋去PBS,經(jīng)熒光顯微鏡觀察熒光，激發(fā)波長450～500nm，發(fā)射波長515～565nm，TUNEL混合液中不加TdT的切片作陰性對照，陽性的凋亡細胞核呈綠色，陰性細胞呈藍色。每切片隨機選擇10個視野，高倍鏡下計數(shù)500～1000個細胞中的陽性細胞數(shù)，其陽性細胞百分率即為凋亡指數(shù)（apoptosis index,AI）。

1.2.3 RT-PCR法測定心肌組織Calpain-1mRNA表達量 按照Trizol試劑說明書在心肌組織中抽取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到cDNA后用于PCR擴增。以β-actin作為內(nèi)參，Rat Actin-bate引物序列：上游引物5′-GGA GATTACTGCCCT GGCTCCTA，下游引物5′-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG，擴增片段150bp；Calpain-1引物序列：上游引物5′-GGGGTG AAGTGGAGTGGA AAG，下游引物5′-TTA AGGGCGTCAGGT GTA AGG，擴增片段184bp，反應(yīng)條件：Rat Actin-bate預(yù)變性 94℃ 5min，變性94℃30s，退火54℃30s，延伸72℃30s，循環(huán)27次，結(jié)束循環(huán)后再延伸72℃8min；calpain-1預(yù)變性94℃5min，變性94℃30s，退火54℃30s，延伸72℃30s，循環(huán)35次，結(jié)束循環(huán)后再延伸72℃5min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖電泳，分別獲得 213bp、298bp和 749bp的條帶，應(yīng)用Bio-Rad凝膠成像及定量掃描儀分析，以目的片段/內(nèi)參照β-actin片段的條帶光密度比值作半定量比較。

1.2.4 Western blot檢測Calpain-1蛋白活性 按說明書配制細胞裂解液，以每1g心肌組織加3mL裂解液的比例制成組織勻漿，冰浴1h后4℃離心10min，取上清液。按照說明書配置BCA蛋白測定標準液，應(yīng)用酶標儀測出樣品的吸光度并計算出組織上清液的蛋白含量。蛋白質(zhì)樣品沸水加熱10min后置于冰水中冷卻，加入10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠中電泳，再將蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到PVDF膜上4℃封閉過夜。加入兔抗大鼠Calpain-1抗體37℃孵育2h，洗膜后再加入辣根酶標記羊抗鼠IgG，37℃孵育1h，加入ECL發(fā)光底物用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)的曝光，PVDF膜于分子量80kD和76kD處顯示特異的蛋白信號。應(yīng)用QuantityOne-4.1.0軟件對所得特異性蛋白質(zhì)條帶進行圖分析，蛋白質(zhì)條帶的含量以O(shè)D值表示，將Calpain活性片段的OD值與總片段的OD值比較即76kD/80kD比值代表Calpain-1蛋白的活性。比值越大，說明陽性反應(yīng)程度越高，目標蛋白活性越強，反之則表示目標蛋白活性越弱。

2 結(jié)果

2.1 大鼠心肌細胞凋亡情況 對照組偶見凋亡細胞，HIBD組凋亡細胞均有明顯增加（P<0.01）。與對照組相比，AI自HIBD后2h組開始有明顯增加（P<0.01），3d達高峰（P<0.001）后開始降低，7d仍明顯高于對照組（P<0.01）。如以對照組AI均數(shù)作為基數(shù)，HIBD組大鼠AI增加在2.5～19.1倍，尤以HIBD后3d組為著（19.1倍）。如圖1、2所示。

圖1 對照組（×200）Fig 1 Control group（×200）

2.2 大鼠心肌細胞Calpain-1mRNA、蛋白活性變化 大鼠心肌中Calpain-1mRNA表達量自HIBD后12h增多（P<0.01），2d達高峰，表達量在3～5d仍維持在較高水平（P<0.001）；Calpain-1蛋白在分子量80kD處對照組信號最強，HIBD后逐漸減弱；76kD的信號在對照組最弱，HIBD后逐漸增強，2d時76kD信號強度超過80kD，3d時76kD的信號最強。Calpain-1蛋白活性在HIBD后2h增高（P<0.05），24h～2d顯著增高 (P<0.001)，3d達高峰；5d有所下降，7d與對照組相比無統(tǒng)計學差異（P>0.05）。見圖3、表1。

圖3 對照組及HIBD各時點組蛋白條帶Fig 3 Western blot analysis of calpain-1of control and HIBD groups

表1 大鼠心肌組織AI(%)與Calpain-1mRNA、蛋白活性變化（±s）Tab 1 Changes of apoptosis index and expressions of calpain-1gene and protein in myocardium of rats（±s）

表1 大鼠心肌組織AI(%)與Calpain-1mRNA、蛋白活性變化（±s）Tab 1 Changes of apoptosis index and expressions of calpain-1gene and protein in myocardium of rats（±s）

組別對照組HIBD后2h 12h 24h 2d 3d 5d 7d mRNA 0.0363±0.02920.0788±0.02850.1962±0.06500.3525±0.03370.5400±0.08480.3200±0.05150.1825±0.05770.0838±0.0306Calpain-1P 0.1040.0000.0000.0000.0000.0000.07076kD/80kD 0.1001±0.03200.1875±0.03730.1562±0.08870.7200±0.08810.8502±0.10001.0479±0.10930.6752±0.09710.1031±0.0157P 0.0300.1590.0000.0000.0000.0000.937細胞AI(%) 1.5250±0.22813.8500±1.11739.0374±1.420214.7125±2.242723.1750±2.726429.1625±5.14117.5500±2.51054.1125±0.1394P 0.0050.0000.0000.0000.0000.0000.003

2.3 心肌細胞AI與Calpain-1之間相互關(guān)系 Calpain-1mRNA、蛋白活性與AI之間呈直線正相關(guān)(r=0.786，P=0.000；r=0.853,P=0.000)

3 討論

細胞凋亡是主動性細胞死亡形式，在維持機體生理穩(wěn)態(tài)和生長發(fā)育中發(fā)揮著重要作用，同時也參與了眾多疾病的病理過程。既往認為心肌細胞、神經(jīng)細胞等終末細胞不會發(fā)生凋亡反應(yīng)，直到1989年，Nepomniashchikh等觀察饑餓性心肌萎縮超微結(jié)構(gòu)時發(fā)現(xiàn)，心肌細胞結(jié)構(gòu)蛋白合成降低，細胞數(shù)減少，由此初步提出饑餓性心肌萎縮是由細胞凋亡所致。隨后Gottlieb和Kawano等采用電鏡結(jié)合DNA凝膠電泳方法才取得了心肌細胞凋亡的直接證據(jù)，同時Tanaka等在培養(yǎng)的心肌細胞中也證實了凋亡的存在。心肌細胞的功能和代謝特點決定了心肌細胞對缺氧非常敏感，大量研究已證實，缺氧能誘導心肌細胞凋亡[3-5]。劉英等[4]采用TUNEL法證實了HIBD過程中心肌細胞凋亡的存在；李剛等[6]利用Annexin-V/PI雙染色流式方法證明新生大鼠HIBD發(fā)生后心肌細胞存在明顯凋亡。

Calpains是鈣依賴性蛋白酶，屬于半胱氨酸蛋白水解酶超家族成員之一，廣泛分布于絕大多數(shù)哺乳動物組織中。Calpain-1是最早被發(fā)現(xiàn)也是研究較清楚的Calpain家族成員之一，胞內(nèi)Ca2+的濃度為微摩爾時即被激活，并隨著Ca2+濃度不同出現(xiàn)的結(jié)果也不同。Ca2+濃度逐步提高可導致Calpain-1構(gòu)象改變，使之具有了蛋白水解酶活性；Ca2+濃度進一步提高Calpain-1將發(fā)生自溶，其N端部分氨基酸序列被水解，使Calpain-1的80kD大亞基降解為76kD，此時酶原形式變?yōu)榛钚孕问?。生理狀態(tài)下，細胞內(nèi)的Ca2+濃度總是保持在極低的水平，心肌細胞在缺氧缺血時，鈣離子通道開放，鈣大量流入細胞，鈣泵功能下降，造成細胞內(nèi)鈣超載。對體內(nèi)及體外各種模型的研究顯示，當心肌細胞遇到缺氧、缺血等刺激時，Calpain-1因細胞內(nèi)鈣超負荷而被激活，活化后的Calpain-1作用于細胞骨架蛋白、膜蛋白、鈣影蛋白、ATP酶等，產(chǎn)生一系列能誘導細胞凋亡的“信號”載體，使其結(jié)構(gòu)破壞、功能喪失而導致細胞死亡[5，7]。Inserte等[8]發(fā)現(xiàn)，Calpain能夠在大鼠心臟缺血再灌注早期被激活，通過切割細胞骨架上的fordrin蛋白及ankyrin蛋白，致使錨定于細胞膜的Na+-K+-ATPase脫離，喪失功能，致使[Na+]i無法恢復(fù)，[Ca2+]i持續(xù)上升，進一步惡化細胞內(nèi)的離子環(huán)境，加重Ca2+超載的程度激活更多的Calpain，形成惡性循環(huán)，起始對細胞的損傷過程。陳運清等[9]對風濕性房顫患者研究發(fā)現(xiàn)，Calpain-1的含量與心房肌細胞凋亡呈明顯正相關(guān)，說明Calpain-1與心房肌細胞凋亡密切相關(guān)，呈并行關(guān)系。本研究應(yīng)用TUNEL法對HIBD大鼠心肌細胞凋亡進行了檢測，發(fā)現(xiàn)了不同程度的細胞凋亡，在HIBD后3d組中尤為明顯，其凋亡指數(shù)較正常心肌細胞增加了19.1倍，且HIBD后7d依然高于正常對照組2.7倍，此結(jié)果與劉英等[4]研究結(jié)果一致。HIBD后大鼠心肌Calpain-1mRNA及蛋白活性較對照組明顯增加，且隨著Calpain-1表達的上調(diào)，AI亦逐漸增多，兩者呈明顯正相關(guān)；本研究結(jié)果表明，缺氧缺血可誘導Calpain-1表達增強，而Calpain-1的過度激活參與了新生大鼠缺氧缺血性腦損傷后心肌細胞凋亡的發(fā)生。

Calpain-1的作用底物廣泛，它誘導細胞凋亡的途徑也是多方面的，主要表現(xiàn)在對凋亡途徑的調(diào)節(jié)。在對HL-1心肌細胞的研究中發(fā)現(xiàn)，Ca2+超載時，線粒體膜電位降低的同時伴隨著Calpain活性的上調(diào)，通過Calpain抗體標記染色發(fā)現(xiàn)Calpain出現(xiàn)在線粒體的位置，提示Calpain引起線粒體功能的異常[10]。在各種病理狀態(tài)下，Calpain被過度激活，一方面參與病理狀態(tài)的維持與加重；另一方面與內(nèi)外源性凋亡信號轉(zhuǎn)導途徑相互作用，最終導致心肌細胞的凋亡。心肌細胞內(nèi)Ca2+濃度的增加對Calpain-1的激活起著至關(guān)重要的作用，盡管Calpain-1參與了心肌細胞凋亡調(diào)節(jié)的確切機制尚不十分清楚，但可以肯定的是與缺氧導致的細胞內(nèi)Ca2+超載有關(guān)。細胞內(nèi)鈣超載及其所觸發(fā)的一系列有害代謝是導致心肌細胞死亡的“最后共同通路”，在細胞凋亡中有重要作用。因此，進一步研究Calpain在細胞凋亡中的作用有助于深入了解細胞凋亡的機制及其在疾病防治中的作用。

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