王麗艷，張 敏，趙曉麗，郭彥青，曹 穎，于公元，康英姿

（1.天津醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)教研室，天津300070；2.武警醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室，天津 300162）

目前運(yùn)動(dòng)療法普遍用于糖尿病和高血壓的治療，而且運(yùn)動(dòng)鍛煉可以延緩或逆轉(zhuǎn)由于衰老引起的神經(jīng)肌肉和運(yùn)動(dòng)功能的減退[1]?，F(xiàn)在人們也越來越重視運(yùn)動(dòng)在疾病預(yù)防中的作用。所以選擇何種運(yùn)動(dòng)方式及強(qiáng)度指導(dǎo)人們進(jìn)行鍛煉是個(gè)關(guān)鍵問題。本研究以健康雄性SD大鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，設(shè)計(jì)不同方式的跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)，檢測大鼠骨骼肌中糖有氧氧化關(guān)鍵酶—異檸檬酸脫氫酶（IDH）和糖酵解關(guān)鍵酶—磷酸果糖激酶-1（PFK）的活性變化，探討不同運(yùn)動(dòng)方式和運(yùn)動(dòng)時(shí)間限速酶的變化特點(diǎn)和規(guī)律,以期為人們運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練提供指導(dǎo)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠72只，體重175～225g，購自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部（許可證號(hào)：SCXK2002-0001)，按國家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動(dòng)物干燥飼料喂養(yǎng)。處死前進(jìn)行體重稱量。

1.2 動(dòng)物分組及運(yùn)動(dòng)模型制備 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，進(jìn)行3d適應(yīng)性跑臺(tái)訓(xùn)練（坡度為0度，速度8.2m/min，10min/d）后，將大鼠按體重（組間體重?zé)o顯著性差異）隨機(jī)分為3組，對(duì)照組（C），無氧運(yùn)動(dòng)組（E1），有氧運(yùn)動(dòng)組（E2）。其中每組的24只大鼠再隨機(jī)分為3組，分別為運(yùn)動(dòng)2周組，運(yùn)動(dòng)4周組，運(yùn)動(dòng)6周組，每周運(yùn)動(dòng)6d。參照Bedford標(biāo)準(zhǔn)[2]建立無氧運(yùn)動(dòng)組和有氧運(yùn)動(dòng)組模型。其中無氧運(yùn)動(dòng)組：50m/min跑5min，休息5min，如此反復(fù)3次。有氧運(yùn)動(dòng)組：起始速度為15m/min，每間隔5min速度遞增3m/min，至運(yùn)動(dòng)速度達(dá)20m/min后維持此速度并使跑臺(tái)坡度變?yōu)?%，持續(xù)60min。以上訓(xùn)練過程均使用毛刷刺激，維持大鼠在跑道前1/3位置，以保證訓(xùn)練強(qiáng)度的恒定。正常對(duì)照組養(yǎng)于籠內(nèi)，不進(jìn)行任何運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑 ST-200三通道大鼠跑步機(jī)（成都泰盟科技有限公司），電動(dòng)玻璃勻漿器（寧波新芝科技研究所），UV-2450紫外/可見分光光度計(jì)（島津）。所需試劑為ATP、NADH、NADP、6磷酸果糖、醛縮酶、磷酸烯醇式丙酮酸等均購自美國Sigma公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)取材的方法及操作過程 大鼠于運(yùn)動(dòng)結(jié)束后處死，取大腿骨骼肌1g左右的肌肉，用電子天平精確稱量，按1∶7比例加入蔗糖咪唑（300mmol/L蔗糖，10mmol/L咪唑，pH 7.4，4℃），冰上剪碎，勻漿器勻漿（冰上進(jìn)行）。勻漿液在4℃條件下差速離心，3000r/min離心10min后棄沉淀留上清，上清液10000r/min離心20min兩次，沉淀即為線粒體。其中上清液超速離心24000r/min，30min后棄沉淀留取上清液，上清及線粒體-70℃冷凍備用。應(yīng)用Folin酚法測定各組上清和線粒體液蛋白含量。

1.5 酶活性測定

1.5.1 異檸檬酸脫氫酶活性測定[3]反應(yīng)體系包含EDTA 0.33mmol/L，二硫蘇糖醇0.1mmol/L，Tris-HCl 33mmol/L，pH 7.0，MgSO41.4mmol/L，NADP 0.1mmol/L，異檸檬酸1.5mmol/L，線粒體原液做為啟動(dòng)液，30℃340nm處讀取吸光度的變化值。

1.5.26 -磷酸果糖激酶-1測定[4]反應(yīng)體系包含50mmol/L Tris-HCl（pH7.5），5mmol/L MgCl2，0.5U醛縮酶，1U磷酸丙糖異構(gòu)酶，1U α-磷酸甘油脫氫酶，1mmol/L 6-磷酸果糖，0.15mmol/L NADH，0.5mmol/L ATP，上清液做為啟動(dòng)液，25℃讀取340nm吸光度的變化值。

2 結(jié)果

2.1 不同運(yùn)動(dòng)方式對(duì)異檸檬酸脫氫酶活性的影響 由表1可見，本實(shí)驗(yàn)在大鼠無氧運(yùn)動(dòng)2周組和4周組的IDH活性與對(duì)照組相比分別增加為59%和134%（P<0.05），有氧運(yùn)動(dòng)4周組IDH活性與對(duì)照組相比增加49%（P<0.05）。在運(yùn)動(dòng)6周各組中酶活性與對(duì)照組相比無差異。酶出現(xiàn)的活性高峰無氧運(yùn)動(dòng)組和有氧運(yùn)動(dòng)組均在4周。在運(yùn)動(dòng)2周和運(yùn)動(dòng)4周的實(shí)驗(yàn)中可見無氧組酶活性均高于有氧組酶活性（P<0.05）。

表1 各組大鼠異檸檬酸脫氫酶活性變化（U/mgpro）Tab 1 Changes of activity of IDH in groups（U/mgpro）

2.2 不同運(yùn)動(dòng)方式對(duì)磷酸果糖激酶-1活性的影響 由表2可見，本實(shí)驗(yàn)在無氧運(yùn)動(dòng)組中2周組、4周組、6周組酶活性與對(duì)照組相比增加分別為31%、28%、28%（P<0.05），不同的運(yùn)動(dòng)時(shí)間使酶活性增加的量差異不明顯（P>0.05）。有氧運(yùn)動(dòng)組酶活性在2周組、4周組與對(duì)照組相比分別降低28%、21%（P<0.05）。

表2 各組大鼠磷酸果糖激酶-1活性變化（U/mgpro）Tab 2 Changes of activity of PFK in groups（U/mgpro）

3 討論

運(yùn)動(dòng)對(duì)機(jī)體的影響是多方面的，規(guī)律的運(yùn)動(dòng)能降低心血管疾病和癌癥的發(fā)生率，然而不適當(dāng)?shù)氖湛s肌肉產(chǎn)生的大量自由基又會(huì)損傷細(xì)胞[5]，所以選擇合適的運(yùn)動(dòng)方式是非常必要的。運(yùn)動(dòng)的過程中需要?jiǎng)訂T大量的能量物質(zhì)進(jìn)入分解代謝為肌肉組織提供能量，葡萄糖是提供能量的主要物質(zhì)之一。葡萄糖的代謝主要為糖酵解和有氧氧化。在缺氧情況下，葡萄糖以糖酵解形式供能，其第一個(gè)階段是葡萄糖分解成丙酮酸。糖酵解途徑有3種關(guān)鍵酶，分別為PFK、丙酮酸激酶、已糖激酶。PFK以ATP作為磷酸基團(tuán)的供體，催化6-磷酸果糖（F-6-P）的1位磷酸化，生成1,6-二磷酸果糖（F-1，6-BP）；PFK是糖酵解途徑的關(guān)鍵酶，催化的反應(yīng)是不可逆的。PFK擁有四聚體結(jié)構(gòu)，由于糖酵解發(fā)生于胞漿中，必然受到多種變構(gòu)效應(yīng)劑的影響。目前普遍認(rèn)為調(diào)節(jié)酵解途徑最重要的是PFK[6]。在有氧條件下代謝物被充分氧化，最終匯聚的代謝途徑是三羧酸循環(huán)（又稱Krebs循環(huán)），是三大營養(yǎng)素的最終代謝的共同通路。三羧酸循環(huán)發(fā)生在線粒體中，三羧酸循環(huán)的調(diào)節(jié)點(diǎn)為IDH和α-酮戊二酸脫氫酶復(fù)合體[6]。其中IDH是限速酶之一，催化異檸檬酸氧化脫羧生成α-酮戊二酸。

隋波[7]研究結(jié)果顯示：經(jīng)過9周的跑臺(tái)訓(xùn)練，有氧訓(xùn)練組大鼠血清IDH和腓腸肌IDH活性與對(duì)照組相比都有不同程度的增加，而PFK活性無變化。無氧訓(xùn)練組血清和腓腸肌的PFK活性增加，而IDH活性無變化。本實(shí)驗(yàn)在有氧運(yùn)動(dòng)4周組IDH活性與對(duì)照組相比增加49%，而無氧運(yùn)動(dòng)2周組和4周組IDH活性與對(duì)照組相比增加分別為59%和134%，這一結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道并不完全一致，可能是由于運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度、訓(xùn)練時(shí)間及個(gè)體差異所造成的。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，有氧運(yùn)動(dòng)組和無氧運(yùn)動(dòng)組均能增加IDH的活性。IDH活性在運(yùn)動(dòng)2周組后明顯升高，4周時(shí)各組酶活性均升高到頂點(diǎn)，6周后各組酶活性逐步恢復(fù)正常。即無氧運(yùn)動(dòng)和有氧運(yùn)動(dòng)IDH的活性高峰均出現(xiàn)在運(yùn)動(dòng)4周組。PFK的酶活性在無氧組隨運(yùn)動(dòng)時(shí)間延長而增加，有氧組在2周和4周時(shí)降低，6周恢復(fù)正常。說明相同運(yùn)動(dòng)方式下酶活性與運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練時(shí)間的長短有關(guān)。由于細(xì)胞線粒體IDH活性增強(qiáng),組織氧利用能力提高,有利于骨骼肌的有氧代謝,保證了肌組織收縮時(shí)的能量供應(yīng),提高肌肉的工作效率和運(yùn)動(dòng)持久能力。在運(yùn)動(dòng)2周和運(yùn)動(dòng)4周的實(shí)驗(yàn)中可見無氧組酶活性均高于有氧組酶活性（P<0.05），這說明無氧運(yùn)動(dòng)組能動(dòng)員更多的ATP來維持運(yùn)動(dòng)。在運(yùn)動(dòng)2周組和4周組，隨著運(yùn)動(dòng)時(shí)間的延長，需要產(chǎn)生更多的能量，所以酶活性增加。而在運(yùn)動(dòng)6周組酶活性降至正常，可能的原因是由于時(shí)間的積累，酶發(fā)生了適應(yīng)性變化。

關(guān)于運(yùn)動(dòng)對(duì)PFK的影響，Gillespie等[8]的研究表明,在耐力訓(xùn)練后所有肌纖維的PFK的活性無變化。李開剛[9]通過設(shè)計(jì)不同運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度的有氧訓(xùn)練，發(fā)現(xiàn)長期耐力訓(xùn)練后PFK的活性除36m組外，其余均顯著低于對(duì)照組。Serrano等[10]對(duì)有氧耐力訓(xùn)練的馬進(jìn)行研究，訓(xùn)練8個(gè)月后酵解酶（磷酸果糖激酶和乳酸脫氫酶）活性降低。以前也有研究報(bào)道，無氧運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練增加PFK的活性[11-12]。本實(shí)驗(yàn)在無氧運(yùn)動(dòng)組中2周組、4周組、6周組PFK活性與對(duì)照組相比增加分別為31%、28%、28%（P<0.05）。無氧運(yùn)動(dòng)組PFK的活性增加的結(jié)果說明無氧運(yùn)動(dòng)增強(qiáng)了糖酵解的供能系統(tǒng)提供能量的能力，且隨著時(shí)間的延長，酶的活性持續(xù)增高。但是PFK活性的增高會(huì)持續(xù)幾周，還有待進(jìn)一步研究。有氧運(yùn)動(dòng)組酶活性在2周組、4周組分別降低28%、21%（P<0.05），6周組無明顯變化，這與之前的報(bào)道一致。

無氧運(yùn)動(dòng)組IDH活性高于有氧運(yùn)動(dòng)組（P<0.05），PFK活性也高于有氧運(yùn)動(dòng)組（P<0.05）。這說明無氧運(yùn)動(dòng)組在提高有氧氧化關(guān)鍵酶-IDH和糖酵解酶PFK的活性方面強(qiáng)于有氧運(yùn)動(dòng)組，而關(guān)鍵酶活性的提高加速了糖代謝的速度，因此能產(chǎn)生大量的ATP供機(jī)體利用。所以無氧運(yùn)動(dòng)是能提高酵解和有氧氧化能力的一種有效方式。本實(shí)驗(yàn)動(dòng)態(tài)的觀察了運(yùn)動(dòng)不同時(shí)間的大鼠糖代謝中IDH和PFK的酶活性，結(jié)果可以為疾病的預(yù)防和日常運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練提供理論參考。在以后人們的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練中除了有氧運(yùn)動(dòng)也可以考慮選擇進(jìn)行無氧運(yùn)動(dòng)即間歇性速度訓(xùn)練，來提高肌肉的運(yùn)動(dòng)效率。但是間歇性速度訓(xùn)練的合理強(qiáng)度尚需進(jìn)一步研究。

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