周 慧，劉夢源，楊 冰，程先超，王潤玲

（1.天津醫(yī)科大學藥學院，天津300070；2.北京協(xié)和醫(yī)學院、中國醫(yī)學科學院放射醫(yī)學研究所，天津分子核醫(yī)學重點實驗室，天津 300192）

朊蛋白(prion protein,PrP)是一種不同于細菌、病毒或類病毒的在分類上尚未定論的病原因子[1-5]。其本質(zhì)為由正常宿主細胞基因編碼的、構象異常的蛋白質(zhì)，目前尚未檢出任何核酸成分，是人和動物的傳染性海綿狀腦病（transmissible spongiform encephalopathies,TSEs）的病原體。能造成哺乳動物腦部病變的是PrPSC（傳染型PrP），另一種是不具有侵染力的PrPC（細胞型PrP）。有觀點認為是由正常形式的蛋白錯誤折疊成致病蛋白而形成的，兩種結構異型的蛋白PrPC和PrPSC來源于同一基因，具有相同的氫基酸序列和共價修飾，但是其理化性質(zhì)和結構有很大的差異。目前研究表明，朊蛋白E200K突變會使PrPC轉變?yōu)镻rPSC[6-9]導致人和動物的傳染性海綿狀腦病，但其轉變機制尚不明確。本研究采用分子動力學的方法，進行長時間分子動力學模擬，研究E200K突變所導致的朊蛋白變構過程。

1 材料與方法

1.1 分子動力學模型構建 從布魯克海文蛋白數(shù)據(jù)庫（RCSB data bank,http://www.rcsb.org）下載人的野生型朊蛋白NMR結構（PDB ID:1QM0）和人的E200K突變型朊蛋白NMR結構（PDB ID:1QM2）。

利用Desmond 9.0分子動力學軟件包[10-11]向上述兩個人朊蛋白模型中加入溶劑分子，溶劑分子采用簡單點電荷水分子（SPC水分子），周期邊界條件中將生成的盒子形狀定為Cubic，盒子的Buffer值為10?。向體系中加入反離子，使模擬體系達到電中性，同時再向體系中加入0.15mol/L的氯化鈉，使整個體系與人體體液環(huán)境等滲。

1.2 分子動力學模擬條件 分子動力學模擬采用等溫等壓系綜，鍵長限制算法為SHAKE，溫度耦合方法為Nose-Hoover，模擬溫度為300K，弛豫時間為1ps。壓力耦合方法為Martyna-Tobias-Klein，弛豫時間為2ps，模擬壓力為1.01325bar（1bar=100000Pa），Couplingstyle為Isotropic，可壓系數(shù)為4.5×10-5。短程靜電相互作用閾值為9?，長程靜電作用計算采用Smooth particle mesh Ewald（PME）[12-13]。為防止朊蛋白在分子動力學模擬過程中本身部分移出盒子外，給朊蛋白中心殘基的α碳原子施加2kcal/mol/ ?2的力。積分步長為2fs，首先平衡500ps，平衡采用Desmond默認的Relaxation protocol，再進行10ns的正式分子動力學模擬。在模擬過程中，每2ps記錄一次軌跡文件。

2 結果

2.1 人朊蛋白的二級結構 圖1為人朊蛋白二級結構模型緞帶圖，由圖可以看出人朊蛋白主要由3個α螺旋組成，其中α1螺旋包括144～152殘基，α2螺旋包括174～193殘基，α3螺旋包括200～228殘基。朊蛋白的N端主要包括一些loop結構，C端主要以α螺旋為主。

圖1 人朊蛋白二級結構圖Fig 1 The secondary structure of human prion protein

2.2 E200K突變對朊蛋白整體結構影響

2.2.1 野生型和E200K突變型朊蛋白Cα的均方根偏差（root mean square deviation,RMSD）隨時間變化比較 野生型（WT）朊蛋白在10ns的分子動力學模擬過程中RMSD值變化不大，從1?逐漸升高到2?，而E200K突變型朊蛋白RMSD變化非常明顯，在前4000ps內(nèi)，RMSD值從1?迅速升高到4.5?，此后基本在4～5?范圍內(nèi)波動，見圖2。

圖2 野生型和E200K突變型朊蛋白Cα的RMSD隨時間變化曲線Fig 2 RMSD of α-carbon atoms of wild type and E200K mutant prion protein

從RMSD隨時間變化曲線可以看出，野生型朊蛋白在10ns的分子動力學模擬過程中結構波動不大，但突變型朊蛋白RMSD波動很大，說明在分子動力學模擬過程中，結構發(fā)生了顯著變化。

2.2.2 野生型和E200K突變型朊蛋白Cα的均方根波動（root mean square fluction，RMSF）隨時間變化比較 野生型的朊蛋白RMSF在1～3?之間保持穩(wěn)定波動，突變型的朊蛋白RMSF在C端殘基RMSF值較大，在8?左右，見圖3。

圖3 野生型和E200K突變型朊蛋白Cα的RMSF變化曲線Fig 3 RMSF of α-carbon atoms of wild type and E200K mutant prion protein

從RMSF曲線圖可以看出，相對于分子動力學模擬過程中的平均結構而言，突變型朊蛋白C端殘基骨架波動很大，說明在突變型的朊蛋白的C端蛋白結構發(fā)生了顯著變化。

2.2.3 分子動力學模擬10ns后人朊蛋白二級結構變化 圖4是10ns后的人朊蛋白二級結構圖，由此圖可以看出，E200K會導致α2和α3螺旋發(fā)生解旋，同時，在10ns分子動力學模擬后，相比野生型朊蛋白，E200K突變型朊蛋白的β折疊會延長，因此，需進一步分析造成上述結構變化的原因。

圖4 10ns后人朊蛋白二級結構圖Fig 4 The secondary structure of human prion protein after 10ns MD simulations

2.2.3.1 α2螺旋骨架氫鍵概率統(tǒng)計情況：由表1可以看出，E200K的突變會使朊蛋白α2螺旋大部分骨架氫鍵穩(wěn)定程度降低，從而導致突變體的α2螺旋在10ns的分子動力學模擬后出現(xiàn)解旋現(xiàn)象。

表1 α2螺旋骨架氫鍵概率統(tǒng)計情況Tab 1 Hydrogen bond occupancy of α2 helix backbone hydrogen bonds

2.2.3.2 α3螺旋骨架氫鍵概率統(tǒng)計情況：由表2可以看出，E200K的突變會使朊蛋白α3螺旋骨架中Ser222與Tyr226、Ala224與Arg228氫鍵穩(wěn)定程度降低，所以E200K會使C端的α3螺旋骨架氫鍵穩(wěn)定程度降低，從而導致突變體的α3螺旋在10ns的分子動力學模擬后出現(xiàn)解旋的現(xiàn)象。

表2 α3螺旋骨架氫鍵概率統(tǒng)計情況Tab 2 Hydrogen bond occupancy of α3helix backbone hydrogen bonds

2.2.3.3 β折疊氫鍵概率統(tǒng)計情況：由表3可見，野生型和E200K突變型朊蛋白β折疊區(qū)域殘基骨架氫鍵概率影響不是很大。除Gly131骨架的羰基與Val161骨架的氨基形成氫鍵的概率較低外，其它殘基骨架氫鍵概率非常高。因此可以看出，E200K突變對朊蛋白β折疊區(qū)域殘基骨架氫鍵穩(wěn)定性影響不是很大。

表3 β折疊氫鍵概率統(tǒng)計情況Tab 3 Hydrogen bond occupancy of β sheet backbone hydrogen bonds

3 討論

3.1 PrPC和PrPSC理化性質(zhì)差異（1）PrPC存在于正常組織及感染動物的組織中，是正?；虻漠a(chǎn)物，通常情況下是無害的，對蛋白酶K敏感。（2）PrPSC僅存在于感染動物的組織中，與致病和傳染有關，對蛋白酶K有抗性。這兩種朊蛋白的差異主要是后者β折疊所占比例較前者高。目前認為，PrPC轉變?yōu)镻rPSC是疾病發(fā)生的基本條件，PrPSC在中樞神經(jīng)系統(tǒng)細胞內(nèi)聚集而導致疾病的發(fā)生[14-18]。

3.2 關于分子動力學模擬條件選擇 在分子動力學模擬過程中，對于原子間非共價鍵靜電相互作用，包括短程靜電相互作用和長程靜電相互作用兩部分。Cut off算法只計算體系的短程靜電相互作用不計算長程靜電相互作用，體系的波動就會比較劇烈，體系的穩(wěn)定性會降低。PME是分子動力學計算長程靜電作用的常用計算方法，通過計算體系在分子動力學模擬過程中的長程靜電相互作用情況，可以更為精確地計算模擬過程的勢能情況，也可以防止體系在模擬過程中波動過于劇烈[19]。

目前，大量研究表明，人體內(nèi)正常朊蛋白中某些殘基的突變會導致其二級結構的變化，從而導致傳染性海綿狀腦病的發(fā)生，但迄今為止，對其致病機制尚無明確結論。

本研究中采用的分子動力學模擬是近些年來新興的分子模擬方法，是結合物理、數(shù)學和化學的綜合技術。分子動力學是一套分子模擬方法，該方法主要是依靠牛頓力學來模擬分子體系的運動，以在由分子體系的不同狀態(tài)構成的系綜中抽取樣本，從而計算體系的構型積分，并以構型積分的結果為基礎進一步計算體系的熱力學量和其他宏觀性質(zhì)。利用分子動力學方法可以從原子水平模擬出蛋白的變構過程，彌補實驗研究的不足。

因此，本研究采用分子動力學的模擬方法，分別對人野生型和E200K突變型朊蛋白進行了10ns分子動力學模擬。結果表明，E200K的突變會使朊蛋白二級結構發(fā)生顯著變化，使朊蛋白二級結構中的β折疊長度增加，使α2和α3螺旋解旋，其解旋的主要原因是由于突變體會導致α2和α3螺旋骨架氫鍵的穩(wěn)定性下降，這樣β折疊所占的比例就會升高，α螺旋由于解旋所占比例就會下降，而這一二級結構的變化最終可能會導致PrPC轉化為PrPSC。該研究成果會為今后傳染性海綿狀腦病致病機制的研究提供一定的理論依據(jù)。

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