李 靜，孫保存，古 強(qiáng)，董學(xué)易，韓春榮，宗文康，趙 楠，劉艷榮，趙秀蘭

（1.天津醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)教研室，天津300070；2.天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院病理科，天津300060）

惡性黑色素瘤是起源于神經(jīng)嵴黑色素細(xì)胞的惡性腫瘤，其主要病變特點(diǎn)是發(fā)病年齡早、轉(zhuǎn)移率高、血液供應(yīng)豐富，具有多種血管生成模式[1]。目前在黑色素瘤中發(fā)現(xiàn)的微循環(huán)模式有內(nèi)皮依賴性血管、馬賽克血管和血管生成擬態(tài)（vasculogenic mimicry，VM），VM參與構(gòu)筑腫瘤組織的功能性微循環(huán)，與腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為有關(guān)。線形程序性壞死（linearly patterned programmed cell necrosis，LPPCN）是黑色素瘤組織中存在的一種特殊形式的程序性死亡現(xiàn)象，本課題組前期研究工作表明LPPCN可能為VM、內(nèi)皮依賴性血管形成提供一定的空間結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[2]，而血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）對(duì)血管生長(zhǎng)具有強(qiáng)誘導(dǎo)作用，是作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的重要生長(zhǎng)因子之一，并直接參與誘導(dǎo)腫瘤血管生成。因此，本實(shí)驗(yàn)對(duì)VEGF及其受體（Flt-1、Flk-1）是否參與LPPCN到VM的轉(zhuǎn)變及其在病人預(yù)后中的作用進(jìn)行初步探討。

1 材料與方法

1.1 材料 收集天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院1996年7月～2007年11月間經(jīng)手術(shù)切除、福爾馬林固定、常規(guī)石蠟包埋并經(jīng)兩位病理醫(yī)師診斷證實(shí)為黑色素瘤的石蠟標(biāo)本，共70例。所有病例均診斷明確，臨床資料及隨訪資料完整。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 石蠟標(biāo)本常規(guī)切片，分別作HE染色、CD31與PAS雙重染色以及免疫組織化學(xué)二步法進(jìn)行VEGF、Flt-1、Flk-1染色。兔抗人CD31多克隆抗體（Ab28464）稀釋度1∶50，購(gòu)自Abcam公司，兔抗人VEGF多克隆抗體稀釋度1∶100，購(gòu)自北京中杉生物技術(shù)有限公司，兔抗人Flt-1多克隆抗體(RB-1527-P0)稀釋度1∶100，購(gòu)自Thermo公司，鼠抗人Flk-1單克隆抗體（sc-6251）稀釋度1∶100，購(gòu)自SANTA CRUZ公司。用已知陽(yáng)性片和PBS代替一抗分別作陽(yáng)性和陰性對(duì)照。

1.3 結(jié)果判斷 VEGF免疫組化染色以細(xì)胞漿內(nèi)和(或)細(xì)胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒者為陽(yáng)性細(xì)胞。Flt-1和Flk-1表達(dá)定位于細(xì)胞漿內(nèi)和腫瘤間質(zhì)血管內(nèi)皮細(xì)胞胞漿內(nèi)，以出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞。分別選取典型的5個(gè)LPPCN及VM區(qū)域，在400倍光鏡下分別計(jì)數(shù)LPPCN及VM周圍腫瘤細(xì)胞1～3層、4～6層及7～9層中的陽(yáng)性率，取平均值。根據(jù)腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性率結(jié)合染色強(qiáng)度綜合評(píng)價(jià)染色指數(shù)。染色強(qiáng)度：腫瘤細(xì)胞無(wú)著色為0，染成淺黃色為1，棕黃色為2，深黃色為3；陽(yáng)性率的評(píng)定：0～19%陽(yáng)性細(xì)胞轉(zhuǎn)換數(shù)值為0，20%～39%陽(yáng)性細(xì)胞轉(zhuǎn)換數(shù)值為1，40% ～59%陽(yáng)性細(xì)胞轉(zhuǎn)換數(shù)值為2，>60%陽(yáng)性細(xì)胞轉(zhuǎn)換數(shù)值為3。染色指數(shù)為染色強(qiáng)度和染色陽(yáng)性細(xì)胞率轉(zhuǎn)換數(shù)值的總和，染色指數(shù)<1為陰性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS16.0for windows統(tǒng)計(jì)軟件包和Excel 2003進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布且方差齊性，采用ANOVA分析。采用Kaplan-Meier估計(jì)生存曲線法做出各組間的生存曲線，對(duì)數(shù)秩和檢驗(yàn)(Log-rank test)法比較各組間的生存曲線的差別。計(jì)數(shù)資料采用四格表的確切概率法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HE、CD31與PAS染色結(jié)果 顯微鏡下，HE染色的LPPCN細(xì)胞的胞核深染、細(xì)胞漿濃縮、細(xì)胞之間界限清楚。LPPCN呈線形、網(wǎng)狀、分支狀排列，穿插于周圍腫瘤組織之間（圖1）。隨機(jī)選取10個(gè)高倍視野（×200），分別計(jì)數(shù)100個(gè)腫瘤細(xì)胞，LPPCN的平均細(xì)胞數(shù)少于5%者記為陰性，70例黑色素瘤組織標(biāo)本中，LPPCN陽(yáng)性者占54.29%（38/70）。CD31/ PAS雙染切片出現(xiàn)CD31染色陰性，而由PAS陽(yáng)性物質(zhì)圍成的管腔結(jié)構(gòu)，管腔內(nèi)存在紅細(xì)胞，周圍沒(méi)有出血壞死和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，此為VM陽(yáng)性（圖2）。70例標(biāo)本中VM陽(yáng)性率為47.14%（33/70）。

圖1 HE染色(×200)Fig 1 HE staining(×200)

圖2 CD31/PAS雙重染色(×400)Fig2CD31/PASdoublestaining（×400）

2.2 VEGF、Flt-1及Flk-1在LPPCN和VM周圍腫瘤細(xì)胞中的表達(dá) VEGF在LPPCN周圍腫瘤細(xì)胞1～3層中的表達(dá)強(qiáng)于其外圍腫瘤細(xì)胞（P<0.01），在外圍4～6層與7～9層之間的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（圖3）。Flk-1在LPPCN周圍腫瘤細(xì)胞1～3層中的表達(dá)強(qiáng)于其外圍腫瘤細(xì)胞（P<0.01），在外圍4～6層與7～9層之間的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（圖4）。而Flt-1在LPPCN周圍腫瘤細(xì)胞1～3層、4～6層及7～9層之間的表達(dá)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖5），VEGF、Flt-1、Flk-1在VM周圍的表達(dá)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（圖6～8），見(jiàn)表1。

圖3 VEGF免疫組化染色(×200)Fig 3 Immunohistochemical

圖4 Flk-1免疫組化染色(×200)Fig 4 Immunohistochemical staining of Flk-1(×200)

2.3 LPPCN周邊VEGF(+)組與VEGF（-）組的生存分析 在LPPCN周邊，VEGF（+）組共27例，VEGF（-）組共11例（圖9），LPPCN周邊VEGF（+）組的生存時(shí)間比LPPCN周邊VEGF（-）組短，其生存曲線的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.083，P=0.037）。生存曲線圖見(jiàn)圖10。

圖5 Flt-1免疫組化染色(×200)Fig 5 Immunohistochemical staining of Flt-1(×200)

圖6 VEGF免疫組化染色(×400)Fig 6 Immunohistochemical stainingofVEGF(×400)

圖7 Flt-1免疫組化染色(×400)Fig 7 Immunohistochemical staining of Flt-1(x400)

圖8 Flk-1免疫組化染色(×400)Fig 8 Immunohistochemical staining of Flk-1(×400)

圖9 VEGF免疫組化染色(×200)Fig 9 Immunohistochemical staining of VEGF(×200)

圖10 生存曲線圖Fig 10 Kaplan-Meier survive curves plot

2.4 LPPCN周邊VEGF(+)組與VEGF（-）組中VM的情況 在27例LPPCN周邊VEGF(+)組中，VM（+）組有23例，在11例LPPCN周邊VEGF(-)組中，VM（+）組有5例，LPPCN周邊VEGF(+)組中VM的陽(yáng)性率高于LPPCN周邊VEGF(-)組中VM的陽(yáng)性率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.049），見(jiàn)表2。

表1 VEGF、Flt-1、Flk-1在黑色素瘤LPPCN及VM周圍的表達(dá)（±s）Tab 1 Expression of VEGF,Flt-1and Flk-1surrounding LPPCN and VM in melanoma（±s）

表1 VEGF、Flt-1、Flk-1在黑色素瘤LPPCN及VM周圍的表達(dá)（±s）Tab 1 Expression of VEGF,Flt-1and Flk-1surrounding LPPCN and VM in melanoma（±s）

A1組:LPPCN周邊第1～3層腫瘤細(xì)胞染色指數(shù)；B1組:LPPCN周邊第4～6層腫瘤細(xì)胞染色指數(shù)；C1組:LPPCN周邊第7～9層腫瘤細(xì)胞染色指數(shù)；A2組:VM周邊第1～3層腫瘤細(xì)胞染色指數(shù)；B2組:VM周邊第4～6層腫瘤細(xì)胞染色指數(shù)；C2組: VM周邊第7～9層腫瘤細(xì)胞染色指數(shù)；*P<0.05

組別A1組B1組C1組A2組B2組C2組q A1:B1A1:C1B1:C1A2:B2A2:C2B2:C2n 383838333333VEGF 2.52±1.331.55±0.971.48±1.152.86±1.112.90±0.972.55±0.99Flt-13.45±0.622.19±0.401.71±0.462.80±0.953.15±0.813.00±0.80Flk-13.46±0.722.17±0.381.62±0.583.32±0.783.45±0.743.36±0.660.986* 1.046* 0.0610.0520.3140.3510.1920.4830.2910.3080.1580.1510.725* 0.683* 0.0420.1690.0780.091

表2 LPPCN周邊VEGF表達(dá)與VM陽(yáng)性率(%)的關(guān)系Tab 2 Relationship between the expression of VEGF surrounding LPPCN and the VM positive rate（%）

3 討論

1999年，Maniotis等[3]在研究高度惡性黑色素瘤時(shí)揭示了一種新的血管生成方式，即VM。VM是惡性黑色素瘤細(xì)胞通過(guò)自身變形和與細(xì)胞外基質(zhì)相互作用，模擬血管壁結(jié)構(gòu)形成的可輸送血液的管道系統(tǒng)。其特點(diǎn)是血管壁的內(nèi)側(cè)全部由腫瘤細(xì)胞襯覆，而非內(nèi)皮細(xì)胞，并且此通道中存在紅細(xì)胞。研究表明，有多種細(xì)胞因子影響和參與了其形成過(guò)程。如同血管生成過(guò)程中，血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增殖，在腫瘤組織中出芽，最終形成管道網(wǎng)絡(luò)[4]的過(guò)程一樣，VM形成中也存在管道的空間構(gòu)筑過(guò)程。那么，實(shí)體瘤組織中，細(xì)胞排列緊密，間質(zhì)液體壓力極高，腫瘤細(xì)胞是如何獲得形成VM所需的空間呢？LPPCN現(xiàn)象也許能夠在一定程度上解釋這個(gè)謎團(tuán)。

LPPCN是黑色素瘤組織中存在的一種特殊形式的程序性死亡現(xiàn)象，在HE染色切片中可觀察到大片實(shí)體的腫瘤組織內(nèi)出現(xiàn)條帶樣（線形分布）的一群胞核深染、胞漿濃縮且細(xì)胞間彼此分離的腫瘤細(xì)胞，此即是LPPCN。本課題組前期實(shí)驗(yàn)在人體黑色素瘤和小鼠黑色素瘤移植瘤中均觀察到當(dāng)腫瘤的血管生長(zhǎng)無(wú)法滿足腫瘤的快速生長(zhǎng)時(shí)，在腫瘤的中央部缺少血管的區(qū)域，由于嚴(yán)重缺氧并在高壓環(huán)境下腫瘤細(xì)胞便可能啟動(dòng)一系列機(jī)制形成LPPCN[5]。隨后這些條帶結(jié)構(gòu)內(nèi)的腫瘤細(xì)胞發(fā)生核碎裂、溶解，細(xì)胞解體，在腫瘤組織內(nèi)出現(xiàn)了一些分布呈網(wǎng)絡(luò)狀的線形空間結(jié)構(gòu)，并出現(xiàn)與內(nèi)皮依賴性血管相通的現(xiàn)象，有時(shí)在一個(gè)內(nèi)皮依賴性血管的周圍可見(jiàn)數(shù)個(gè)呈網(wǎng)絡(luò)狀分布的線形結(jié)構(gòu)。LPPCN和VM的空間分布呈網(wǎng)絡(luò)狀，類似于內(nèi)皮依賴性血管的空間分布。因此，推測(cè)這些發(fā)生LPPCN的腫瘤細(xì)胞死亡后殘留的空間可以作為VM形成的空間結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。而LPPCN周邊的腫瘤細(xì)胞與VM形成之間有什么關(guān)系呢？針對(duì)這一問(wèn)題，本實(shí)驗(yàn)研究了LPPCN周邊腫瘤細(xì)胞VEGF及其受體的表達(dá)和VM形成的關(guān)系。

眾所周知，缺氧是實(shí)體瘤物理微環(huán)境的基本特征之一。惡性黑色素瘤進(jìn)展區(qū)域乏氧，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子HIF-1α的表達(dá)增高，而HIF-1α刺激腫瘤細(xì)胞和宿主細(xì)胞合成分泌多種促血管生成因子，尤其是具有重要作用的VEGF。HIF-1α的功能不僅使其下游因子VEGF的mRNA穩(wěn)定性增加，而且能增加VEGF的轉(zhuǎn)錄活性[6]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，在LPPCN周邊的腫瘤細(xì)胞高表達(dá)VEGF，明顯強(qiáng)于遠(yuǎn)離LPPCN的腫瘤細(xì)胞，這可能是由于在LPPCN周邊的腫瘤細(xì)胞處于相對(duì)較嚴(yán)重的缺氧狀態(tài)，而遠(yuǎn)離LPPCN的腫瘤細(xì)胞缺氧較輕，這種由重到輕的缺氧梯度導(dǎo)致了VEGF表達(dá)的高低不同。而且已有研究表明，只有VEGF表達(dá)高的細(xì)胞才有形成VM的潛能[7]。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)對(duì)于VEGFR2（Flk-1）的研究結(jié)果顯示，在LPPCN周邊的腫瘤細(xì)胞Flk-1的表達(dá)強(qiáng)于遠(yuǎn)離LPPCN的腫瘤細(xì)胞，這可能是VEGF發(fā)揮刺激內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、增加血管的通透性和新血管的生成作用主要是通過(guò)結(jié)合和激活Flk-1來(lái)實(shí)現(xiàn)的。可見(jiàn)低氧不僅可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞VEGF的高表達(dá)，而且可以通過(guò)誘導(dǎo)VEGF受體表達(dá)上調(diào)來(lái)調(diào)節(jié)VEGF的功能。而對(duì)于VEGFR1（Flt-1），其與VEGF結(jié)合后所起的生理作用尚不明確，F(xiàn)lt-1可能是作為VEGF促血管生成的反向調(diào)節(jié)因子發(fā)揮作用[8]。在本實(shí)驗(yàn)中也觀察到Flt-1在LPPCN周圍的表達(dá)無(wú)差異。

相對(duì)于LPPCN周圍腫瘤細(xì)胞VEGF、Flt-1及Flk-1的表達(dá)情況，在VM周圍三者的表達(dá)沒(méi)有差異,這可能是因?yàn)閂M有助于腫瘤細(xì)胞獲得足量的血液供應(yīng)，氧氣充足，刺激腫瘤細(xì)胞表達(dá)VEGF及其受體的主要誘因缺氧減弱，因此腫瘤細(xì)胞表達(dá)VEGF降低。Sun等[9]的研究也表明，沒(méi)有缺氧的刺激，腫瘤細(xì)胞會(huì)下調(diào)對(duì)VEGF的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，LPPCN與VM周圍腫瘤細(xì)胞的促血管生成因子的表達(dá)差異或許可以間接地說(shuō)明VEGF主要在VM形成的早期起作用，當(dāng)VM形成后，有充足的血液供應(yīng)使缺氧減輕就會(huì)使VEGF的表達(dá)下調(diào)。

進(jìn)一步研究還發(fā)現(xiàn)，LPPCN周邊VEGF陽(yáng)性組的VM陽(yáng)性率高于LPPCN周邊VEGF陰性組的VM陽(yáng)性率，且LPPCN周邊VEGF陽(yáng)性組患者生存時(shí)間比LPPCN周邊VEGF陰性組患者短。推測(cè)在LPPCN殘留的空間結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，其周邊高表達(dá)VEGF的腫瘤細(xì)胞有更多機(jī)會(huì)形成VM。由于VM無(wú)血管內(nèi)皮細(xì)胞襯覆，腫瘤細(xì)胞直接與血液接觸，更易發(fā)生轉(zhuǎn)移，成為造成患者不良預(yù)后的一個(gè)影響因素。

綜上所述，在黑色素瘤組織中VM形成早期，VEGF及其受體Flk-1可能起一定的作用，且其高表達(dá)是患者不良臨床預(yù)后的一個(gè)影響因素，但不一定是獨(dú)立的關(guān)鍵影響因素。VM可能是由LPPCN周邊的腫瘤細(xì)胞通過(guò)一定的機(jī)制轉(zhuǎn)變而形成的。但是，VEGF及其受體具體是通過(guò)何種途徑影響VM的形成？它們與其他細(xì)胞因子在形成VM過(guò)程中的相互作用關(guān)系如何？通過(guò)抑制VEGF的表達(dá)是否能減少VM的形成，進(jìn)而達(dá)到治療黑色素瘤的目的？這些問(wèn)題需要進(jìn)一步研究VEGF及其受體在VM形成過(guò)程中發(fā)揮的具體作用及其詳盡機(jī)制來(lái)解決。

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