曾 熾，王靜雅，周志成，陳思洋，婁立起，吳永堯

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.湖南省煙草公司，湖南 長(zhǎng)沙 410007）

我國(guó)是世界上大豆生產(chǎn)加工大國(guó)，年產(chǎn)大豆均超過(guò)1 500萬(wàn)t，進(jìn)口大豆1 000萬(wàn)t以上，年產(chǎn)大豆粕1 600萬(wàn)t以上[1]。大豆粕是以大豆為原料，經(jīng)浸提法取油后的副產(chǎn)物[2]，大豆粕蛋白含量高達(dá)40%~47%，利用前景廣闊。但是，由于大分子特性與共存抗?fàn)I養(yǎng)因子會(huì)影響大豆粕的利用[3]，將其所含蛋白降解成游離氨基酸及小肽是實(shí)現(xiàn)豆粕高效利用的重要途徑[4-5]。為此，實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展了發(fā)酵降解豆粕制備氨基酸的系統(tǒng)研究，現(xiàn)將自選菌種進(jìn)行豆粕發(fā)酵的中試研究結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

大豆粕為湖南金葉肥料公司提供，菌株為湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室自選菌M1。

1.2 主要儀器

恒溫水浴箱，高壓滅菌鍋，超凈工作臺(tái)，恒溫培養(yǎng)箱，HZQ-Q振蕩器，中國(guó)麗BIOF-2000型5 L發(fā)酵罐，中國(guó)麗BIOF-6100A SB A型100 L發(fā)酵罐，TU-1810紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)等。

1.3 方法

1.3.1 5 L發(fā)酵罐培養(yǎng)條件優(yōu)化 在實(shí)驗(yàn)室前期發(fā)酵條件摸索工作的基礎(chǔ)上，摸索在5 L發(fā)酵罐中發(fā)酵降解大豆粕的最佳控制條件[6]。種子液培養(yǎng)基為L(zhǎng)B培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)基為3 000mL水、210 g大豆粕、6 g KH2PO4、1.5 g CaCl2，并以培養(yǎng)溫度、接種量、攪拌轉(zhuǎn)速及通氣量4個(gè)因素為正交試驗(yàn)因子，選擇4因素3水平的L9（34）正交試驗(yàn)，因素水平設(shè)置見(jiàn)表1。

表1 L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.2 放大中試方法 試驗(yàn)菌種M1為好氧菌，發(fā)酵過(guò)程為高好氧發(fā)酵過(guò)程，所以以體積溶氧系數(shù)相等為基準(zhǔn)，結(jié)合單位體積發(fā)酵液的攪拌功耗相等，并參考實(shí)際工作經(jīng)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行由5 L試驗(yàn)罐到100

L罐的發(fā)酵試驗(yàn)。5 L試驗(yàn)罐直徑D=15 cm，2組攪拌葉輪直徑Di=6.5 cm，高徑比H/D=2，液深H=21 cm，4擋板 W/D=0.1；100 L罐直徑 D=40 cm，2組攪拌葉輪直徑Di=16 cm，高徑比H/D=2，液深H=50 cm，4擋板W/D=0.1。發(fā)酵液為牛頓型流體，黏度u=1.78×10-3Pa·s,密度 L=1 050 kg/m3。以 60 L 水、4.2 kg 大豆粕、120 g KH2PO4、30 g CaCl2為發(fā)酵培養(yǎng)基，滅菌前使用NaOH調(diào)節(jié)pH至7.2。依據(jù)公式（1）攪拌雷諾準(zhǔn)數(shù)：Re=ωDi2PL/μ；（2）不通氣攪拌功率：P0=2NPω3PLDi5；（3） 通氣攪拌功率：Pg=2.25×10-3（P02ωDi3/Q0.08）0.39；（4）空截面氣速：vs=VG（π/4）D2；（5）體積溶氧系數(shù)：Kd=（2.36+3.3×2）（Pg/VL）0.56vs0.7ω0.7×10-9計(jì)算放大后的發(fā)酵控制條件[7]。

1.3.3 檢測(cè)方法 （1）轉(zhuǎn)速、溫度、罐壓、空氣流量、發(fā)酵體系pH值等發(fā)酵的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)從控制電腦直接讀取。（2）每8 h取樣一次進(jìn)行生化指標(biāo)檢測(cè)。還原糖含量測(cè)量：3,5-二硝基水楊酸法[8]；可溶性蛋白含量測(cè)定：考馬斯亮藍(lán)G-250法[9]；氨基酸含量測(cè)定：茚三酮法[9]；活菌數(shù)測(cè)定：平皿培養(yǎng)單菌落計(jì)數(shù)法[10]；蛋白酶活力測(cè)定：folin酚法[11]；粗蛋白含量測(cè)定：凱式定氮法[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵控制參數(shù)

正交試驗(yàn)以發(fā)酵后發(fā)酵液中氨基態(tài)氮含量為參考依據(jù)，得到發(fā)酵罐培養(yǎng)控制條件中影響菌種M1發(fā)酵降解大豆粕制備氨基酸的4個(gè)因素的影響程度為：通氣量＞接種量＞溫度＞攪拌速度（表2）。

表2 正交試驗(yàn)方案和結(jié)果

根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果，以發(fā)酵液中氨基態(tài)氮濃度最高為目標(biāo)，得到實(shí)驗(yàn)室自篩菌M1在5 L試驗(yàn)罐中發(fā)酵降解大豆粕的最佳條件組合為：通氣量250 L/h，接種量5%，溫度38℃，攪拌速度250 r/min。在此種試驗(yàn)條件下，發(fā)酵液中氨基態(tài)氮的最高含量可以達(dá)到831μg/mL。由試驗(yàn)可知，隨著通氣量的上升，產(chǎn)物含量呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，由于試驗(yàn)條件所限，通氣量250 L/h已經(jīng)是在不產(chǎn)生發(fā)酵逃液前提下的最高值。再發(fā)酵放大時(shí)，由于試驗(yàn)條件的改變，可以嘗試在保持KLa（計(jì)算時(shí)取體積溶氧系數(shù)Kd）基本不變的基礎(chǔ)上提高通氣量，考察產(chǎn)物含量變化。

2.2 100 L中試罐放大試驗(yàn)

在5 L發(fā)酵罐正交試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，根據(jù)

1.3.2 中放大公式計(jì)算，并結(jié)合實(shí)際工作中積累的經(jīng)驗(yàn)，以實(shí)現(xiàn)高效降解大豆粕中蛋白質(zhì)生產(chǎn)氨基酸和小分子肽為目標(biāo)，確定100 L發(fā)酵罐中試的控制條件為：通氣量60 L/min，接種量1%，溫度38℃，攪拌速度150 r/min。

2.2.1 發(fā)酵過(guò)程中發(fā)酵情況的監(jiān)測(cè)和控制 由發(fā)酵罐電腦系統(tǒng)實(shí)時(shí)對(duì)發(fā)酵情況進(jìn)行在線監(jiān)測(cè)和控制，能夠保證轉(zhuǎn)速、溫度和通氣條件穩(wěn)定在設(shè)定值。發(fā)酵罐內(nèi)部壓力通過(guò)調(diào)整尾氣出口閥門(mén)進(jìn)行調(diào)節(jié)，在實(shí)際發(fā)酵中，由于菌種代謝產(chǎn)生大量氣體，發(fā)酵罐內(nèi)部出現(xiàn)泡沫，氣壓增加。通過(guò)調(diào)整尾氣出口閥門(mén)，內(nèi)部氣壓可保持在1.45×105Pa左右，保證內(nèi)壓大于外壓，避免空氣中雜菌污染發(fā)酵，也能避免罐內(nèi)壓力增加過(guò)快導(dǎo)致發(fā)酵液從尾氣出口逃出。pH的高低對(duì)菌種生長(zhǎng)和產(chǎn)物的合成影響明顯，但在發(fā)酵過(guò)程中，無(wú)需人為地對(duì)發(fā)酵體系pH進(jìn)行調(diào)節(jié)，菌種M1在代謝過(guò)程中本身具有一定的調(diào)節(jié)周?chē)鷓H的能力，建成最適pH的環(huán)境。實(shí)際發(fā)酵過(guò)程中，pH值從滅菌后的6.7逐漸升高到發(fā)酵結(jié)束時(shí)的7.9，所以只需在發(fā)酵培養(yǎng)基配置時(shí)將pH調(diào)至7.2，即可實(shí)現(xiàn)發(fā)酵的順利進(jìn)行。

2.2.2 發(fā)酵過(guò)程中生化指標(biāo)的變化 為了適應(yīng)工業(yè)生產(chǎn)，降低生產(chǎn)成本，發(fā)酵培養(yǎng)基中除加必要的無(wú)機(jī)鹽外，碳源和氮源物質(zhì)均由大豆粕降解提供，不另添加其他物質(zhì)。發(fā)酵體系中，降解豆粕中多糖類(lèi)物質(zhì)產(chǎn)生的還原糖為菌種生長(zhǎng)產(chǎn)酶提供碳源，多糖的降解和還原糖的利用基本實(shí)現(xiàn)平衡，基本滿足菌種生長(zhǎng)產(chǎn)酶。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，體系中還原糖的含量呈現(xiàn)緩慢降低的趨勢(shì)（圖1）；大豆粕中的蛋白質(zhì)隨著菌種的生長(zhǎng)，被逐漸降解利用，發(fā)酵液中可溶性蛋白的含量快速提高，發(fā)酵進(jìn)行至30 h左右，發(fā)酵液中的可溶性蛋白含量達(dá)到頂峰，之后，由于大豆粕中粗蛋白被降解殆盡，可溶性蛋白被菌種降解，其含量急速下降；而發(fā)酵液中氨基態(tài)氮含量的變化情況滯后于可溶性蛋白含量變化，于可溶性蛋白含量達(dá)到頂峰后15 h左右，氨基態(tài)氮含量達(dá)到頂峰，為1 051μg/mL，之后由于發(fā)酵底物消耗殆盡，菌種自身生長(zhǎng)需要消耗，氨基態(tài)氮含量出現(xiàn)緩慢降低情況。3類(lèi)物質(zhì)隨發(fā)酵時(shí)間的變化情況表明，發(fā)酵體系中可溶性蛋白含量與氨基酸產(chǎn)率密切相關(guān)。

圖1 還原糖、可溶性蛋白、氨基態(tài)氮的含量隨發(fā)酵時(shí)間的變化

蛋白酶活性和生物量隨發(fā)酵時(shí)間的變化見(jiàn)圖2：菌株M1生長(zhǎng)從16 h開(kāi)始進(jìn)入對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期，24 h時(shí)達(dá)到最高點(diǎn)，之后進(jìn)入穩(wěn)定期，并逐漸衰亡；而酶活力隨著發(fā)酵的進(jìn)行持續(xù)緩慢增長(zhǎng)，24 h后增長(zhǎng)速度迅速提高，40 h后酶活力達(dá)到最高點(diǎn)，之后趨于穩(wěn)定，并呈現(xiàn)緩慢下降趨勢(shì)。由于蛋白酶活力的變化趨勢(shì)明顯滯后于菌種的生長(zhǎng)，在菌株進(jìn)入穩(wěn)定期后酶活力才進(jìn)入快速增長(zhǎng)階段，可以推測(cè)蛋白酶的分泌是在菌株達(dá)到穩(wěn)定期以后才開(kāi)始的。

圖2 蛋白酶活性和生物量隨發(fā)酵時(shí)間的變化

2.3 大豆粕粗蛋白降解效果比較

分別取發(fā)酵前后的大豆粕烘干后用凱式定氮法測(cè)定了其中的粗蛋白含量。5 L發(fā)酵罐中利用優(yōu)化條件發(fā)酵的大豆粕中粗蛋白的含量由41.57%下降到10.90%，降解率約為73.80%；100 L放大發(fā)酵的大豆粕中粗蛋白的含量由41.57%下降到4.75%，降解率約為88.57%。由此可見(jiàn)，相比5 L試驗(yàn)罐，放大罐中發(fā)酵的大豆粕粗蛋白降解率更高，降解效果更好。同時(shí)也說(shuō)明隨著發(fā)酵規(guī)模的逐漸放大，大豆粕的降解效果仍然有提升的空間。

3 結(jié)語(yǔ)

（1）實(shí)驗(yàn)室篩選的針對(duì)降解大豆粕生產(chǎn)氨基酸的菌種M1，在5 L發(fā)酵罐中的最佳發(fā)酵條件為裝液量3 L，通氣量250 L/h，接種量5%，溫度38℃，攪拌速度250 r/min條件下，發(fā)酵液中氨基態(tài)氮含量達(dá)到831μg/mL，降解大豆粕中蛋白質(zhì)的效果較好。

（2）由5 L試驗(yàn)罐到100 L罐的發(fā)酵放大試驗(yàn)，發(fā)酵液中氨基態(tài)氮含量最高時(shí)達(dá)到1 051μg/mL，大豆粕中粗蛋白的降解率由73.80%提升到88.57%，表明100 L罐發(fā)酵效果更佳，放大方法可行。

綜上所述，菌種M1能夠適用于工業(yè)條件下降解大豆粕產(chǎn)氨基酸的生產(chǎn)，菌種M1為高耗氧菌，工業(yè)生產(chǎn)條件可由實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)按照體積溶氧系數(shù)相等為基準(zhǔn)，結(jié)合單位體積發(fā)酵液的攪拌功率相等，并根據(jù)具體生產(chǎn)條件結(jié)合工作經(jīng)驗(yàn)數(shù)據(jù)調(diào)整的放大方法進(jìn)行放大生產(chǎn)。

[1] 宋國(guó)安.大豆資源的開(kāi)發(fā)利用（一）[J].山東食品科技，2004，6（11）：4-6.

[2]肖 玲，邊四輩.浸出油廠制油工藝對(duì)大豆粕品質(zhì)影響分析[J].飼料工業(yè)，2000，21（3）：9-10.

[3] 閆貴龍，張建云.改善大豆餅（粕）品質(zhì)的途徑[J].中國(guó)飼料，1996，（17）：18-20.

[4] 姚小飛，石 慧.大豆多肽的功能特性及其開(kāi)發(fā)應(yīng)用進(jìn)展[J].中國(guó)食物與營(yíng)養(yǎng)，2009，（7）：44-46.

[5] 吳民熙，王靜雅，詹逸舒，等.不同菌種對(duì)3種油脂下腳料降解情況的初步研究[J].湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，（4）：107-109.

[6]顏焱娜.一株芽孢桿菌M1降解不同餅粕粗蛋白比較及擴(kuò)繁研究[D].長(zhǎng)沙：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，2010.

[7] 梁世中.生物工程設(shè)備[M].北京：中國(guó)輕工業(yè)出版社，2006.

[8] 3,5－二硝基水楊酸比色法測(cè)定還原糖和總糖.[EB/OL].http://www.docin.com/p-50425246.html

[9] 楊虹琦.生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M].長(zhǎng)沙：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院生物化學(xué)教研室，2005.

[10]黃秀梨.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M].北京：高等教育出版社，1999.

[11]姜錫瑞.酶制劑應(yīng)用手冊(cè)[M].北京：中國(guó)輕工業(yè)出版社，1999.292-297.

[12]丘 鑫.煙草專(zhuān)用餅肥粗蛋白高效降解研究[D].長(zhǎng)沙：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2005.