康宏 李振強(qiáng) 閉艷妲

（蘭州大學(xué) 口腔醫(yī)學(xué)研究所，蘭州 730000）

自組裝山羊顳下頜關(guān)節(jié)盤組織工程纖維軟骨模型的構(gòu)建

康宏 李振強(qiáng) 閉艷妲

（蘭州大學(xué) 口腔醫(yī)學(xué)研究所，蘭州 730000）

目的 構(gòu)建山羊顳下頜關(guān)節(jié)盤纖維軟骨自組裝模型，觀察自組裝組織工程纖維軟骨的生物學(xué)特征，為顳下頜關(guān)節(jié)盤及其他組織工程纖維軟骨的進(jìn)一步研究創(chuàng)造條件。方法 分離、培養(yǎng)山羊顳下頜關(guān)節(jié)盤細(xì)胞，按每井5.5×106個(gè)接種到預(yù)制的直徑5mm×深10mm瓊脂糖井內(nèi)，每天換液，培養(yǎng)2周，觀察和檢測顳下頜關(guān)節(jié)盤形態(tài)和成分的變化。結(jié)果 接種后1 d，山羊顳下頜關(guān)節(jié)盤細(xì)胞在瓊脂糖井內(nèi)聚集，開始自組裝成一圓盤狀基體，后來逐漸變成圓球形。培養(yǎng)2周時(shí)，蘇木精-伊紅染色可觀察到纖維軟骨細(xì)胞呈圓形，周圍有基質(zhì)包繞；Safranin-O/fast green染色顯示自組裝基體內(nèi)纖維軟骨細(xì)胞分泌細(xì)胞外基質(zhì)氨基多糖；picro-sirius red染色可見自組裝基體內(nèi)有大量膠原纖維。Ⅰ型膠原免疫組織化學(xué)染色可見胞漿和細(xì)胞外有棕黃色顆粒，表明自組裝纖維軟骨可以產(chǎn)生與自然關(guān)節(jié)盤組織一致的Ⅰ型膠原成分。結(jié)論 利用瓊脂糖井構(gòu)建的山羊顳下頜關(guān)節(jié)盤自組裝組織工程模型，能產(chǎn)生與自然關(guān)節(jié)盤成分相似的細(xì)胞外基質(zhì)，表明組織工程化顳下頜關(guān)節(jié)盤組織的途徑是可行的。

顳下頜關(guān)節(jié)盤； 組織工程； 纖維軟骨

顳下頜關(guān)節(jié)盤是位于下頜髁突和顳骨關(guān)節(jié)窩之間的纖維軟骨樣組織，是顳下頜關(guān)節(jié)（temporomandibular joint，TMJ）行使功能的主要組成部分，以關(guān)節(jié)盤變薄、透明樣變和穿孔等不可逆性病變?yōu)樘卣鞯膰?yán)重顳下頜關(guān)節(jié)紊亂病（temporomandibular disorder，TMD），給患者的進(jìn)食、說話帶來了困難和痛苦，長期以來沒有很好的治療方法，是目前口腔臨床面臨的疑難問題之一。近年來組織工程技術(shù)的發(fā)展為臨床修復(fù)損傷和病變的關(guān)節(jié)盤提供了一種新的治療方向[1]。

顳下頜關(guān)節(jié)盤組織工程的目標(biāo)是在體外組裝出與自然組織相似的復(fù)合基體，以實(shí)現(xiàn)病損關(guān)節(jié)盤的功能替換[2]。以往的組織工程纖維軟骨研究模型大多利用三維支架構(gòu)建[2-6]，雖然支架材料不斷改進(jìn)，但是仍然存在一些不足，比如抑制細(xì)胞的移動和細(xì)胞之間的信息交流、應(yīng)力遮擋作用阻礙細(xì)胞的機(jī)械信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、支架阻礙細(xì)胞生長和細(xì)胞外基質(zhì)重塑、有些固體支架使細(xì)胞表型喪失、支架的不利降解產(chǎn)物及炎癥反應(yīng)等等，以瓊脂糖為模具的自組裝技術(shù)（selfassembly process）因可以克服上述缺點(diǎn)在關(guān)節(jié)軟骨組織工程的研究中已有成功報(bào)道[7-9]，但是，TMJ關(guān)節(jié)盤組織與關(guān)節(jié)軟骨不同，細(xì)胞外基質(zhì)以Ⅰ型膠原和氨基多糖（glycosaminoglycans，GAGs）為主而非Ⅱ型膠原，能否采用自組裝技術(shù)進(jìn)行組織構(gòu)建并且能夠產(chǎn)生與自然關(guān)節(jié)盤細(xì)胞外基質(zhì)相似的復(fù)合基體成分還不清楚。因此，本研究旨在探索利用TMJ關(guān)節(jié)盤細(xì)胞體外自組裝構(gòu)建TMJ關(guān)節(jié)盤纖維軟骨復(fù)合基體的可行性。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

1月齡山羊，體重10～15 kg，購自蘭州市屠宰場。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 關(guān)節(jié)盤纖維軟骨細(xì)胞的分離 將購回的死亡不超過12 h的山羊頭6只，用自來水加洗潔劑洗凈血污，浸沒于75%乙醇中20min，置入超凈工作臺，無菌條件下取出雙側(cè)TMJ盤，剪去周圍組織，浸入75%醫(yī)用乙醇10 s，用含100 U·mL-1雙抗（青霉素、鏈霉素）的PBS液于離心管內(nèi)吹打沖洗3次，移入50mL燒杯，加入少量PBS，用眼科剪將關(guān)節(jié)盤剪成糊狀，約1mm3大小。加入15mL用完全培養(yǎng)基（見單層細(xì)胞培養(yǎng)）配置的Ⅰ型膠原酶（2mg·mL-1），移入100mL錐形瓶，牛皮紙封口，于37℃、90 r·min-1搖床內(nèi)消化16 h，100目篩網(wǎng)過濾，1 200 r·min-1離心10min，DMEM重懸洗滌（1 000 r·min-1離心5min）2次，以去除膠原酶，收集的細(xì)胞利用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)，6只山羊的關(guān)節(jié)盤獲得1.8×106細(xì)胞，按2×105進(jìn)行單層細(xì)胞培養(yǎng)。備用細(xì)胞源采用凍存液（DMEM：胎牛血清：DMSO=5∶4∶1）置于-82℃冰箱中凍存。

1.2.2 單層細(xì)胞培養(yǎng) 用于細(xì)胞培養(yǎng)的完全培養(yǎng)基是含有2mmol·L-1L-谷氨酰胺、4.5 g·L-1葡萄糖、110mg·L-1丙酮酸鈉的高糖DMEM培養(yǎng)基，其中添加了15%的胎牛血清、1%青-鏈霉素、1%非必需氨基酸、25μL·mL-1抗壞血酸[2]。6只羊頭的原代TMJ盤細(xì)胞接種到8個(gè)25 cm2的培養(yǎng)瓶中，于5%CO2、飽和濕度、37℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)至70%～90%匯合，然后用每瓶胰蛋白酶（0.25%）1mL消化，傳代至第2代。

1.2.3 自組裝基體制備 加工6個(gè)直徑5mm、長10mm的不銹鋼棒，兩端盡量平整光滑，將其一端黏在48孔板的蓋子內(nèi)面，使之正對48孔板的6個(gè)孔，紫外線照射1 h，然后將消毒融化的2%的瓊脂糖灌注于48孔板與不銹鋼棒相對應(yīng)的孔內(nèi)，每孔1mL，合上蓋子，瓊脂糖在室溫下30min成凝膠。然后小心將蓋子連同不銹鋼棒從瓊脂糖中分離，向所形成的瓊脂糖井中加入每井500μL完全培養(yǎng)基，加蓋另一無菌蓋子，在隨后2 d中更換4次培養(yǎng)基，以使培養(yǎng)基完全置換出瓊脂糖中的PBS，使瓊脂糖井模具被培養(yǎng)基完全飽和到細(xì)胞接種時(shí)間為止。然后將150μL含有5.5×106個(gè)細(xì)胞的培養(yǎng)基加在每一個(gè)瓊脂糖井內(nèi)[8]，4 h后添加每井350μL培養(yǎng)基，以后每天換液每井500μL，細(xì)胞24 h將自組裝在瓊脂糖井內(nèi)形成圓盤狀基體，培養(yǎng)2周后進(jìn)行各項(xiàng)檢測。

1.2.4 大體觀察 2周時(shí)取出自組裝基體，測量其濕重、直徑、厚度。

1.2.5 組織學(xué)和免疫組織化學(xué)染色 樣品冰凍，14μm切片，蘇木精-伊紅染色觀察基體組織形態(tài)，Safranin-O/fast green染色檢測GAGs分布情況，picro-sirius red染色檢查膠原分布。切片用冰丙酮固定，緩沖液沖洗，用過氧化氫/甲醇終止過氧化物酶活動，山羊血清阻斷（SP-9002免疫組化染色試盒），鼠抗Ⅰ型膠原抗體孵育，加入第二抗體（山羊抗小鼠IgG，SP-9002免疫組化染色試盒），DAB顯色，檢測Ⅰ型膠原的分布。

2 結(jié)果

2.1 自組裝基體大體觀察

高密度TMJ盤細(xì)胞接種到瓊脂糖井內(nèi)后，在光滑的瓊脂糖表面不貼壁，不伸展，而是細(xì)胞間相互靠近匯聚，4 h后可見在井底瓊脂糖表面形成圓盤狀結(jié)構(gòu)，乳白色，直徑約（5.0±0.3）mm，厚約（3.0±0.2）mm，1 d后變成圓球狀，直徑略縮?。▓D1），以后直徑逐漸縮小，10 d后趨于穩(wěn)定，約（1.5±0.1）mm，表面日趨光滑，14 d時(shí)直徑（1.6±0.1）mm，濕重（3.0±0.2）mg，如圖2所示。

圖1 1 d時(shí)自組裝基體形態(tài)Fig 1 Gross morphology of the construct at the first day

圖2 2周時(shí)自組裝基體的正面（左）、側(cè)面（右）形態(tài)Fig 2 Morphology of the construct from frontal（left）and sagittal（right）view at 2 weeks

2.2 自組裝基體組織學(xué)觀察

培養(yǎng)14 d時(shí)，蘇木精-伊紅染色可觀察到纖維軟骨細(xì)胞呈圓形，周圍有基質(zhì)包繞（圖3）。Safranin-O/ fast green染色顯示自組裝基體內(nèi)纖維軟骨細(xì)胞分泌細(xì)胞外基質(zhì)GAGs（圖4）。

圖3 纖維軟骨細(xì)胞呈圓形（藍(lán)色），周圍有細(xì)胞外基質(zhì)（粉紅色）包繞 HE ×400Fig 3 Fibrocartilage cells（stained blue）are round,wrapped around by extracellular matrix（stained pink） HE ×400

圖4 自組裝基體內(nèi)的纖維軟骨細(xì)胞周圍可見少量GAGs（紅色）Safranin-O/fast green染色 ×400Fig 4 A little of GAGs（stained red）around the fibrochondrocytes in the construct Safranin-O/fast green staining ×400

picro-sirius red染色可見自組裝基體內(nèi)有大量膠原纖維（圖5）。

圖5 自組裝基體含有大量膠原纖維，尤其是基體外周最多picro-sirius red染色 ×100Fig 5 Numerous collagen fibers in the construct,extremely densely in the periphery of the construct picro-sirius red staining ×100

2.3 自組裝基體免疫組織化學(xué)觀察

14 d時(shí)，Ⅰ型膠原免疫組織化學(xué)染色可見胞漿和細(xì)胞外有棕黃色顆粒分布（圖6），表明自組裝纖維軟骨有分泌Ⅰ型膠原的能力。

圖6 Ⅰ型膠原表達(dá)于胞漿和細(xì)胞外，呈棕黃色顆粒 SP-9002染色 ×200Fig 6 Expression of collagenⅠwas brown-yellow particles in cytoplasm and extracellular matrix SP-9002 staining ×200

3 討論

本實(shí)驗(yàn)的目標(biāo)是構(gòu)建與自然關(guān)節(jié)盤細(xì)胞外基質(zhì)成分相似的復(fù)合基體組織。工程化細(xì)胞外基質(zhì)可采取兩種策略，一種是采用結(jié)構(gòu)和性能與細(xì)胞外基質(zhì)相似的生物材料作為支架自上而下進(jìn)行工程化組織的構(gòu)建；另一種是利用特異性能的小分子由下而上進(jìn)行自組裝生成工程化組織，以達(dá)到功能上的仿生[10]。自組裝過程是組織工程一個(gè)獨(dú)特的方法，它能使細(xì)胞源在不需要附著于支架結(jié)構(gòu)的條件下，細(xì)胞彼此之間相互結(jié)合在一起形成功能性的新生組織。這種過程似乎遵循了Steinberg[11]關(guān)于差力黏附的假說，該假說指出單分散細(xì)胞通過細(xì)胞間黏附力的最大化及總自由能的最小化使細(xì)胞聚集并結(jié)合在一起。由于細(xì)胞的接種密度以及不同的黏附力是形成組織性能的決定性因素[12]，本實(shí)驗(yàn)采用每150μL 5.5×106個(gè)的高細(xì)胞密度，使得細(xì)胞間距變小，細(xì)胞間黏附力增大，同時(shí)，光滑的瓊脂糖井底和井壁極大地減小了聚集自由能，為纖維軟骨細(xì)胞自組裝基體的形成創(chuàng)造了必要條件。

細(xì)胞接種到瓊脂糖井內(nèi)的最初幾天，由于組裝成的基體較為疏松，換液時(shí)應(yīng)盡量避免晃動培養(yǎng)板以防基體碎裂。本實(shí)驗(yàn)利用自組裝技術(shù)構(gòu)建的纖維軟骨基體，在外觀、組織學(xué)和組織化學(xué)上與自然關(guān)節(jié)盤組織相似。Ⅰ型膠原和GAGs是TMJ關(guān)節(jié)盤組織較為特異的標(biāo)志性成分，免疫組織化學(xué)檢測顯示自組裝基體內(nèi)廣泛分布有Ⅰ型膠原成分，Safranin-O/fast green染色也表明自組裝基體內(nèi)關(guān)節(jié)盤細(xì)胞分泌少量細(xì)胞外基質(zhì)GAGs。無支架瓊脂糖凝膠三維培養(yǎng)系統(tǒng)為細(xì)胞間信息的交流和自分泌生長因子的聚集提供便利，維系關(guān)節(jié)盤纖維軟骨細(xì)胞的表型[13]。

自組裝基體在細(xì)胞接種后的第1周出現(xiàn)明顯的外形收縮現(xiàn)象。有人認(rèn)為這種收縮可能與體外培養(yǎng)的纖維軟骨中α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）的表達(dá)增多有關(guān)，表達(dá)α-SMA的纖維軟骨細(xì)胞會引起細(xì)胞外基質(zhì)收縮、變形，對工程化纖維軟骨構(gòu)建產(chǎn)生不利影響[14]。研究提示堿性成纖維細(xì)胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）[15]和星孢菌素[16]可抑制軟骨細(xì)胞中α-SMA表達(dá)。

另外，有研究對影響自組裝基體生長的外環(huán)境因素包括生長因子和生物力學(xué)刺激的效應(yīng)進(jìn)行了研究。血小板衍生生長因子、bFGF和轉(zhuǎn)化生長因子-β1對接種到二維生長物與聚乙醇酸表面的關(guān)節(jié)盤細(xì)胞的代謝有一定的影響，對細(xì)胞增殖、膠原合成和復(fù)合物的力學(xué)性能具有上調(diào)效應(yīng)和協(xié)同效應(yīng)[3-4，17]。在體外細(xì)胞培養(yǎng)中，靜水壓、直接壓縮力、剪切流環(huán)境等機(jī)械刺激都是纖維軟骨細(xì)胞生存和不斷生成細(xì)胞外基質(zhì)的手段[9，18-19]，盡管采用瓊脂糖凝膠三維自組裝模型為研究機(jī)械刺激對工程化組織的作用提供了便利，但是，干預(yù)基體生長的最佳因素目前還不明確。

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（本文編輯 湯亞玲）

Self-assembly tissue engineering fibrocartilage model of goat tem poromandibular joint disc

KANG Hong,LI Zhen-qiang,BI Yan-da.（Institute of Stomatology,Lanzhou University,Lanzhou730000,China）

ObjectiveTo construct self-assembly fibrocartilage model of goat temporomandibular joint disc and observe the biological characteristics of the self-assembled fibrocartilage constructs,further to provide a basis for tissue engineering of the temporomandibular joint disc and other fibrocartilage.MethodsCells from temporomandibular joint discs of goats were harvested and cultured.5.5×106cells were seeded in each agarose well with diameter 5mm ×depth 10mm,daily replace of medium,cultured for 2 weeks.Results One day after seeding,goat temporomandibular joint disc cells in agarose wells were gathered and began to self-assemble into a disc-shaped base,then gradually turned into a round shape.When cultured for 2 weeks,hematoxylin-eosin staining was conducted and observed that cells were round and wrapped around by the matrix.Positive Safranin-O/fast green staining for glycosaminoglycans was observed throughout the entire constructs,and picro-sirius red staining was examined and distribution of numerous typeⅠcollagen was found.Immunohistochemistry staining demonstrated brown yellow particles in cytoplasm and around extracellular matrix, which showed self-assembly construct can produce typeⅠcollagen as native temporomandibular joint disc tissue.ConclusionProduction of extracellular matrix in self-assembly construct as native temporomandibular joint disc tissue indicates that the use of agarose wells to construct engineered temporomandibular joint disc will be possible and practicable.

temporomandibular joint disc； tissue engineering； fibrocartilage

R 782.6

A

10.3969/j.issn.1000-1182.2011.03.024

1000－1182（2011）03－0314-04

2010-06-15；

2010-11-22

甘肅省國際科技合作基金資助項(xiàng)目（0804WCGA127）

康宏（1966—），男，甘肅人，教授，博士

康宏，Tel：0931-6112809