梅杰 楊凱 李志剛 曹雨庵

（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 口腔頜面外科，重慶 400016）

肽段連接的近紅外熒光量子點(diǎn)對(duì)人頰鱗癌BcaCD885細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力的影響

梅杰 楊凱 李志剛 曹雨庵

（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 口腔頜面外科，重慶 400016）

目的 研究肽段連接的近紅外熒光量子點(diǎn)（QDs）對(duì)人頰鱗癌BcaCD885細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲、黏附和趨化運(yùn)動(dòng)能力的影響。方法 1）用表面連接穿膜肽段最大發(fā)射波長(zhǎng)為800 nm的近紅外熒光量子點(diǎn)（QD800）標(biāo)記BcaCD885細(xì)胞（BcaCD885/QD800），用流式細(xì)胞儀檢測(cè)QD800對(duì)BcaCD885細(xì)胞的標(biāo)記率，用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察QD800在BcaCD885細(xì)胞內(nèi)的分布情況；2）用不同濃度的QD800與BcaCD885細(xì)胞共培養(yǎng)，觀察QD800對(duì)BcaCD885細(xì)胞生長(zhǎng)的影響；3）用Transwell侵襲小室法和沖刷實(shí)驗(yàn)，比較BcaCD885/QD800和BcaCD885細(xì)胞侵襲、黏附和趨化運(yùn)動(dòng)能力的變化。結(jié)果 1）QD800對(duì)BcaCD885細(xì)胞標(biāo)記后6 h時(shí)的標(biāo)記率為94.07%，QD800主要分布在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)；2）不同濃度的QD800均未影響B(tài)caCD885細(xì)胞的生長(zhǎng)情況；3）BcaCD885/QD800和BcaCD885細(xì)胞的侵襲、黏附和趨化運(yùn)動(dòng)能力無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。結(jié)論 用肽段連接的近紅外熒光量子點(diǎn)標(biāo)記BcaCD885細(xì)胞后不影響其生長(zhǎng)、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移能力，為利用量子點(diǎn)進(jìn)一步在活體條件下非侵入的體內(nèi)腫瘤細(xì)胞成像和示蹤研究提供了科學(xué)依據(jù)。

量子點(diǎn)； 近紅外熒光； 黏附； 侵襲

發(fā)展對(duì)體內(nèi)癌細(xì)胞非侵入可視化的監(jiān)測(cè)方法對(duì)研究腫瘤的發(fā)生發(fā)展、早期診斷及治療具有重大意義。由于新型納米熒光探針量子點(diǎn)（quantum dots， QDs）與目前已有的有機(jī)熒光染料探針和熒光蛋白相比具有光穩(wěn)定性好、熒光量子產(chǎn)率高等優(yōu)良的光學(xué)特征，在對(duì)體內(nèi)癌細(xì)胞非侵入長(zhǎng)期示蹤觀察方面具有很大的發(fā)展前景[1]，特別是發(fā)射波長(zhǎng)在近紅外光范圍內(nèi)（700～900 nm）的量子點(diǎn)的熒光不僅對(duì)人體組織具有強(qiáng)的穿透力，同時(shí)也可避免組織自發(fā)熒光（400～600 nm）的干擾，特別適合行體內(nèi)非侵入的醫(yī)學(xué)成像。近年來(lái)證明：用具有穿膜作用的肽段表面修飾的QDs能提高對(duì)細(xì)胞的標(biāo)記率[2]。雖然目前研究已表明生物化的QDs標(biāo)記癌細(xì)胞后對(duì)細(xì)胞沒(méi)有毒性，并且不影響其生長(zhǎng)及分化[1，3]，但具有穿膜作用的肽段表面修飾的QDs大量標(biāo)記進(jìn)入癌細(xì)胞后是否影響其生長(zhǎng)、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為這些關(guān)鍵問(wèn)題目前還未見(jiàn)報(bào)道，這是用QDs標(biāo)記癌細(xì)胞后進(jìn)行非侵入可視化研究得到的結(jié)論是否科學(xué)的首要關(guān)鍵問(wèn)題。本研究利用表面連有肽段，最大發(fā)射波長(zhǎng)為800 nm的近紅外熒光量子點(diǎn)QD800通過(guò)內(nèi)吞作用標(biāo)記人頰鱗癌BcaCD885細(xì)胞，觀察被QD800標(biāo)記后BcaCD885的生長(zhǎng)、侵襲、黏附和趨化運(yùn)動(dòng)能力的改變情況。

1 材料和方法

1.1 主要材料和儀器

人頰鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株BcaCD885細(xì)胞（四川大學(xué)口腔疾病研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室），QtrackerTM800 Cell Labeling Kit（Invitrogen公司，美國(guó)），Tcs-sp5激光掃描共聚焦顯微鏡（laser-scanning confocal microscope，LSCM）（Leica公司，德國(guó)），流式細(xì)胞儀（BD公司，美國(guó)），Z233MK-2冷凍低速離心機(jī)（Hermle公司，德國(guó)），Transwell侵襲小室（Costar公司，美國(guó)）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 QDs對(duì)BcaCD885細(xì)胞的標(biāo)記 QD800標(biāo)記BcaCD885細(xì)胞根據(jù)QtrackerTM800 Cell Labeling Kit提供的實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行，簡(jiǎn)述如下：制備10 nmol·L-1的QD800標(biāo)記液待用，將用胰蛋白酶消化后的Bca-CD885細(xì)胞移入EP管內(nèi)，共1×106個(gè)細(xì)胞，然后加入0.2mL QD800標(biāo)記液，吹打均勻后，置培養(yǎng)箱中共同培養(yǎng)1 h后冷凍低速離心5 min（1 000 r·min-1，4℃），棄去培養(yǎng)液，PBS沖洗細(xì)胞2次，洗掉未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的QD800，然后再加入培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)6 h后，將QD800標(biāo)記的細(xì)胞（BcaCD885/QD800）消化吹打成懸液，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)標(biāo)記率。用LSCM觀察QD800標(biāo)記BcaCD885細(xì)胞后QD800在細(xì)胞內(nèi)的分布情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值計(jì)算標(biāo)記率。

1.2.2 QDs對(duì)BcaCD885細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 將生長(zhǎng)旺盛的BcaCD885細(xì)胞按每毫升2×104個(gè)的密度接種到4塊24孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔0.18mL，分為4組，培養(yǎng)24 h使細(xì)胞生長(zhǎng)相對(duì)同步化后，對(duì)照組加入含15%小牛血清的PRMI1640培養(yǎng)液0.02mL，實(shí)驗(yàn)組分為A、B、C組，分別加入0.02mL不同濃度的QD800，使實(shí)驗(yàn)組A、B、C組所加入QD800后的終濃度分別為5、10、15 nmol·L-1，每天各組隨機(jī)取3孔用0.1%胰酶充分消化，吹打細(xì)胞培養(yǎng)液，制成單細(xì)胞懸液，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算細(xì)胞，計(jì)算平均值，連續(xù)8 d，繪制細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取其平均值。

1.2.3 QDs對(duì)BcaCD885細(xì)胞黏附力影響分析 按前面1.2.1實(shí)驗(yàn)方法分別制備密度為每毫升5×106個(gè)的BcaCD885/QD800和Tca8113細(xì)胞2組懸液，取24孔細(xì)胞培養(yǎng)板,每孔加細(xì)胞懸液0.2mL，每組12孔，分別于培養(yǎng)30、60、90、120min后各組隨機(jī)取3孔棄去培養(yǎng)液，PBS液輕洗2遍，去除未真正黏附而貼附于孔底的細(xì)胞，0.25%胰酶消化后顯微鏡下計(jì)數(shù)，用下式計(jì)算不同時(shí)間的細(xì)胞黏附率：細(xì)胞黏附率=黏附細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.2.4 QDs對(duì)BcaCD885細(xì)胞侵襲力影響測(cè)定 按前面1.2.1實(shí)驗(yàn)方法將QD800與BcaCD885細(xì)胞共同培養(yǎng)，QD800濃度為10 nmol·L-1，培養(yǎng)1 h后，用0.1%胰酶充分消化后離心得到被QD800標(biāo)記的BcaCD885細(xì)胞（即BcaCD885/QD800）。細(xì)胞侵襲重建基底膜實(shí)驗(yàn)在Transwell小室中進(jìn)行，Transwell小室被孔徑為8μm的聚碳酸多孔濾膜分為上下兩室，在濾膜上下分別鋪以15μg Matrigel，于37℃下重建1 h后備用。將BcaCD885/QD800和BcaCD885以2×105個(gè)細(xì)胞加入Transwell小室的上室中，37℃培養(yǎng)12 h，侵襲至濾膜下表面的細(xì)胞用蘇木精-伊紅染色后，隨機(jī)選擇5個(gè)400倍顯微視野，重復(fù)3次，以平均數(shù)作為穿膜細(xì)胞數(shù)來(lái)表示BcaCD885細(xì)胞的侵襲能力。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.2.5 QDs對(duì)BcaCD885細(xì)胞趨化運(yùn)動(dòng)影響分析 該實(shí)驗(yàn)與前面1.2.4實(shí)驗(yàn)的差異在于聚碳酸多孔濾膜表面未鋪Matrigel，其余步驟和方法相同，仍隨機(jī)選擇5個(gè)400倍顯微視野統(tǒng)計(jì)濾膜下表面的細(xì)胞數(shù)目，以細(xì)胞的相對(duì)數(shù)目來(lái)表示BcaCD885細(xì)胞的趨化運(yùn)動(dòng)能力。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 QDs對(duì)BcaCD885細(xì)胞的標(biāo)記

QD800對(duì)BcaCD885細(xì)胞標(biāo)記后6 h用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的標(biāo)記率為94.07%（圖1），平均熒光強(qiáng)度為234.52。標(biāo)記6 h后在LSCM下見(jiàn)BcaCD885細(xì)胞內(nèi)有大量的QD800，主要分布在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)（圖2）。

2.2 QDs對(duì)BcaCD885細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

用不同時(shí)間各組細(xì)胞數(shù)繪制對(duì)照組和各實(shí)驗(yàn)組的生長(zhǎng)曲線（圖3），各實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組生長(zhǎng)曲線無(wú)顯著性差異。結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)中不同濃度的QD800未影響B(tài)caCD885細(xì)胞的生長(zhǎng)。

圖1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)QD800標(biāo)記BcaCD885細(xì)胞6 h后的標(biāo)記率Fig 1 Flow cytometry detection of QD800 labeling of BcaCD885 cells at 6 h

圖2 QD800進(jìn)入BcaCD885細(xì)胞后分布在細(xì)胞質(zhì)內(nèi) LSCM ×400Fig 2 QD800 distributes in the BcaCD885 cytoplasm LSCM ×400

圖3 對(duì)照組和各實(shí)驗(yàn)組的生長(zhǎng)曲線Fig 3 Growth curve of control group and each experimental group

2.3 QDs對(duì)BcaCD885細(xì)胞黏附性的影響

不同時(shí)間點(diǎn)BcaCD885/QD800和BcaCD885細(xì)胞的黏附率見(jiàn)表1，結(jié)果表明：經(jīng)QD800標(biāo)記后的Bca-CD885細(xì)胞其黏附能力未發(fā)生改變。

2.4 QDs對(duì)BcaCD885細(xì)胞侵襲能力的影響

鋪在多孔濾膜表面上的Matrigel形成類似天然基底膜的結(jié)構(gòu)，細(xì)胞穿過(guò)Matrigel的能力反映了該細(xì)胞的侵襲能力。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：BcaCD885/QD800和Bca-CD885穿膜細(xì)胞均數(shù)分別為71.6±2.8、72.8±2.7，兩均數(shù)間無(wú)顯著差異（P＞0.05），表明經(jīng)QD800標(biāo)記后的BcaCD885細(xì)胞未影響其侵襲能力。

表1 各時(shí)間點(diǎn)BcaCD885/QD800和BcaCD885細(xì)胞的黏附率Tab 1 Adhesion of BcaCD885/QD800 and Bca-CD885 cells at 30,60,90 and 120m in

2.5 QDs對(duì)BcaCD885細(xì)胞趨化運(yùn)動(dòng)的影響

BcaCD885/QD800和BcaCD885侵襲至濾膜下表面的細(xì)胞數(shù)目分別為79.6±4.1、82.3±3.4，兩均數(shù)間無(wú)顯著差異（P＞0.05），表明經(jīng)QD800標(biāo)記后的Bca-CD885細(xì)胞未影響其趨化運(yùn)動(dòng)能力。

3 討論

近年來(lái)基于多學(xué)科交叉發(fā)展起來(lái)的量子點(diǎn)納米熒光探針，與目前已有的有機(jī)物熒光探針（如rhodamine、FITC、Cy3、Cy5等）和各種熒光蛋白探針相比，它具有熒光量子產(chǎn)率高、發(fā)光度強(qiáng)、光化學(xué)穩(wěn)定性好、不易被光解或漂白[4-5]，同時(shí)QDs的發(fā)光特征具有嚴(yán)格的量子尺寸效應(yīng),通過(guò)改變QDs粒徑大小可獲得從紫外到近紅外范圍（或從藍(lán)色到紅色波長(zhǎng)范圍）內(nèi)任意點(diǎn)的光譜[6]，QDs的這些光學(xué)特征是目前所有的熒光探針都不具備的，如果用QDs標(biāo)記活細(xì)胞就可以利用這些光學(xué)特征長(zhǎng)期觀察或同時(shí)觀察多種活細(xì)胞的相互作用及變化情況[1]。

QDs優(yōu)良的光學(xué)特征已在活體非侵入原位研究癌細(xì)胞在體內(nèi)的發(fā)生發(fā)展、癌癥的早期診斷、藥物在體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程等領(lǐng)域顯示出了巨大的發(fā)展前景[7-8]，特別是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)發(fā)射波長(zhǎng)在近紅外光范圍內(nèi)的量子點(diǎn)的熒光不僅對(duì)人體組織具有強(qiáng)的穿透力，同時(shí)也可避免組織自發(fā)熒光的干擾，特別適合行體內(nèi)非侵入的細(xì)胞成像。目前人們利用近紅外熒光量子點(diǎn)對(duì)體內(nèi)腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移情況進(jìn)行成像研究[2，9]證明：QD800不僅具有良好的體內(nèi)成像能力，而且對(duì)細(xì)胞沒(méi)有毒性和不影響其生長(zhǎng)。近年來(lái)證明用多種具有穿膜作用的肽段表面修飾的QDs能提高對(duì)細(xì)胞的標(biāo)記率[10-12]。但還未查見(jiàn)具有穿膜作用的肽段表面修飾的量子點(diǎn)大量標(biāo)記進(jìn)入癌細(xì)胞后對(duì)腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力有無(wú)影響的研究報(bào)道，這是用QDs標(biāo)記癌細(xì)胞后進(jìn)行非侵入可視化研究得到的結(jié)論是否科學(xué)以及是否真實(shí)地反映了體內(nèi)癌細(xì)胞浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移的情況的首要關(guān)鍵問(wèn)題之一。

本研究用最大發(fā)射波長(zhǎng)為800 nm的近紅外熒光量子點(diǎn)，由于該量子點(diǎn)表面連接有富含精氨酸聚合體的肽段，因而具有較強(qiáng)的穿膜作用。本研究用肽段連接的QD800與BcaCD885細(xì)胞共培養(yǎng)證明：QD800能快速容易進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，標(biāo)記6 h后對(duì)BcaCD885細(xì)胞的標(biāo)記率高達(dá)94.07%，大量肽段連接的QD800進(jìn)入BcaCD885細(xì)胞后對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲、黏附和趨化運(yùn)動(dòng)能力均無(wú)影響。

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（本文編輯 湯亞玲）

Study on effect of peptide-conjugated near-infrared fluorescent quantum dots on invasion and metastasis of human buccal squamous cell carcinoma cell line BcaCD885

MEI Jie,YANG Kai,LI Zhi-gang,CAO Yu-an.（Dept.of Oral and Maxillofacial Surgery,The First Affiliated Hospital,Chongqing Medical University,Chongqing400016,China）

ObjectiveTo study the effect of peptide-conjugated near-infrared quantum dots（QDs）on growth, invasion and metastasis of human buccal squamous cell carcinoma cell line（BcaCD885 cell）.Methods1）BcaCD885 cells were labeled by cell-penetrating peptide-conjugated QDs with a maximum emission wavelength of 800 nm（QD800）,then labeling efficiency was detected by flow cytometry,and laser-scanning confocal microscope was used to observe the distribution of QD800 within the cells.2）Different concentrations of QD800 was applied to BcaCD885 cells,and the cell growth of control and three test groups were compared respectively.3）BcaCD885 cells were labeled by QD800（BcaCD885/QD800）,then transwell chambers and wash way were used to dectect the difference of invasion and metastasis ability between BcaCD885/QD800 and BcaCD885 cells.Results 1）The labeling rate of BcaCD885 cells after 6 h was 94.07%,and QD800 distributes in the BcaCD885 cytoplasm.2）Different concentrations of QD800 showed no negative effects on growth of BcaCD885 cells.3）The ability of invasion,attachment and motion of BcaCD885 cells were not significantly different between test and control group（P＞0.05）.ConclusionQDs showed no effects on growth,invasion and metastasis ability of BcaCD885 cells.Our results provide science foundation for QDs as a new fluorescence probes to real-time monitor cells and cells imaging in a living.

quantum dots； near-infrared fluorescence； attachment； invasion

R 739.8

A

10.3969/j.issn.1000-1182.2011.01.022

1000－1182（2011）01－0092-04

2010-09-25；

2010-12-20

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（30872925和30470893）

梅杰（1982—），男，重慶人，碩士

楊凱，Tel：023-89012569