韓幫鋒 吳平凡 潘劍 李一 李龍江

（口腔疾病研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川大學(xué)，成都 610041）

鼠雙微粒體2蛋白、P53在口腔白斑和鱗癌中的表達(dá)及其相關(guān)性的研究

韓幫鋒 吳平凡 潘劍 李一 李龍江

（口腔疾病研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川大學(xué)，成都 610041）

目的 研究鼠雙微粒體2（MDM2）和P53在口腔白斑及鱗癌中的表達(dá)及其相關(guān)性。方法 采用免疫組織化學(xué)SP方法對(duì)15例正?？谇火つそM織、24例口腔白斑（OLK）組織及41例口腔鱗癌組織中的MDM2蛋白和P53蛋白進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果 正常黏膜中未見MDM2和P53陽(yáng)性表達(dá)，口腔白斑和口腔鱗癌組織中MDM2陽(yáng)性率分別為58.3%和75.6%，P53的陽(yáng)性率分別為37.5%和68.3%，與正常組相比均具有顯著性差異（P＜0.05）?？谇话装吆涂谇击[癌組相比，MDM2陽(yáng)性率沒有顯著性差異（P＞0.05），P53陽(yáng)性率具有顯著性差異（P＜0.05）。兩種指標(biāo)進(jìn)一步的相關(guān)性分析顯示，MDM2與P53蛋白在口腔白斑組（P=0.018）及口腔鱗癌組（P=0.000）中均呈現(xiàn)正相關(guān)的關(guān)系。結(jié)論 MDM2在口腔白斑和口腔鱗癌中的高表達(dá)提示該基因在口腔鱗癌的發(fā)生發(fā)展中起顯著作用，其與P53表達(dá)的相關(guān)性表明這二者可能在口腔鱗癌的形成過程中起協(xié)同作用。

鼠雙微粒體2； P53蛋白； 口腔白斑； 口腔鱗狀細(xì)胞癌

口腔白斑（oral leukoplakia，OLK）是口腔黏膜的常見癌前病變，約有3%～5%的白斑會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)榭谇击[狀細(xì)胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）。鼠雙微粒體2（murine double minute 2，MDM2）具有癌基因的功能，它可以和P53結(jié)合并抑制P53的功能，36%的肉瘤存在MDM2的擴(kuò)增，而大約5%～10%的人類腫瘤有MDM2的過度表達(dá)[1]。本文著重探討MDM2及P53在OLK和OSCC組織中的表達(dá)及其相關(guān)性，以期有助于探討OLK的癌變機(jī)制及OSCC的早期診斷。

1 材料和方法

1.1 材料

OLK及OSCC標(biāo)本均來自2009年1—9月在四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院頭頸腫瘤外科住院手術(shù)的患者。其中，OLK組24例，OSCC組41例，所有患者術(shù)前均無(wú)放化療史，并且術(shù)后經(jīng)過病理科確診。15例口腔正常黏膜組標(biāo)本來源于腫瘤術(shù)后標(biāo)本，所取組織肉眼觀察距腫瘤邊緣至少2 cm以上，并且顯微鏡下檢查證實(shí)沒有癌細(xì)胞。所有標(biāo)本均經(jīng)過甲醛固定，石蠟包埋，4μm層厚連續(xù)切片。

1.2 試劑與方法

小鼠抗人MDM2單克隆抗體由福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司提供，小鼠抗人P53單克隆抗體由基因科技（上海）有限公司提供，SP試劑盒由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供。染色步驟按說明書進(jìn)行，用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，已知陽(yáng)性片作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.3 結(jié)果判斷

MDM2蛋白以胞核和胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性反應(yīng)，P53蛋白以胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性反應(yīng)。每張切片400倍顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，每個(gè)視野記數(shù)100個(gè)細(xì)胞，計(jì)算5個(gè)視野的陽(yáng)性細(xì)胞的平均百分?jǐn)?shù)，將平均百分?jǐn)?shù)分為5級(jí)：-，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＜5%；+，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為5%～25%之間；++，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為26%～50%之間；+++，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為51%～75%之間；++++，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＞75%。其中出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)的組織中，+、++定為低表達(dá)組，+++、++++定為高表達(dá)組。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MDM2蛋白在OLK和OSCC中的表達(dá)

MDM2蛋白主要在OLK及OSCC的細(xì)胞核和細(xì)胞漿中著色，顏色從黃色到深棕色（圖1）。

圖1 MDM2蛋白在OLK和OSCC中的表達(dá)Fig 1 Expression of MDM2 in OLK and OSCC

口腔正常黏膜、OLK及OSCC組織中MDM2的陽(yáng)性表達(dá)率分別為：0、58.3%和75.6%。MDM2在OLK組和OSCC組的陽(yáng)性表達(dá)率與正常組相比均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），OLK組和OSCC組之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.145＞0.05）。對(duì)OLK組和OSCC組中MDM2表達(dá)陽(yáng)性的低表達(dá)組和高表達(dá)組進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)OLK組和OSCC組中MDM2的表達(dá)沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.511）。但是MDM2在不同病變組織中的陽(yáng)性表達(dá)率隨組織惡性程度增高呈上升趨勢(shì)，見表1。MDM2蛋白在OSCC組織中的表達(dá)與腫瘤部位、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及分化程度均無(wú)明顯相關(guān)性（P＞0.05），見表2。

表1 口腔正常黏膜、OLK、OSCC中MDM 2的表達(dá)Tab 1 Expression of MDM 2 in normal oral mucosa,OLK and OSCC

表2 MDM 2在OSCC中的表達(dá)與臨床病理數(shù)據(jù)關(guān)系Tab 2 Correlation of MDM 2 protein expression in OSCC with clinicopathological parameters

2.2 P53蛋白在OLK和OSCC中的表達(dá)

P53蛋白主要在OLK及OSCC的細(xì)胞核中著色，為粗細(xì)不一的黃色顆粒狀（圖2）?？谇徽ｐつ?、OLK及OSCC組織中P53的陽(yáng)性表達(dá)率分別為：0、37.5%和68.3%。P53在OLK組和OSCC組的陽(yáng)性表達(dá)率與正常組相比均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），OLK組和OSCC組之間也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.016）。對(duì)OLK組和OSCC組中P53表達(dá)陽(yáng)性的低表達(dá)組和高表達(dá)組也進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)OLK組和OSCC組中P53的表達(dá)沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.772）。但是P53在不同病變組織中的陽(yáng)性表達(dá)率隨組織惡性程度增高呈上升趨勢(shì)，見表3。

圖2 P53蛋白在OLK和OSCC中的表達(dá)Fig 2 Expression of P53 in OLK and OSCC

表3 口腔正常黏膜、OLK、OSCC中MDM 2的表達(dá)Tab 3 Expression of P53 in normal oral mucosa，OLK and OSCC

2.3 MDM2與P53蛋白表達(dá)的相關(guān)性

通過對(duì)MDM2和P53蛋白表達(dá)的相關(guān)性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)：MDM2與P53蛋白在OLK及OSCC中均呈現(xiàn)正相關(guān)的關(guān)系（P=0.018和P=0.000）。

3 討論

口腔鱗狀細(xì)胞癌作為口腔最常見的惡性腫瘤，其預(yù)后往往較差，對(duì)患者的生活質(zhì)量影響甚大。OLK在組織病理學(xué)上表現(xiàn)為上皮單純性增生或上皮異常增生，約有3%～5%的OLK會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)镺SCC。對(duì)OLK和OSCC的關(guān)系進(jìn)行研究有助于探討OSCC發(fā)生的作用機(jī)制，對(duì)OSCC的預(yù)防及早期診斷有重要意義。

MDM2最初由Cahilly-Snyder等[2]在Ballb/c3T3成纖維細(xì)胞系中鑒定出來，它在進(jìn)化過程中很保守，在鼠和人的許多組織中都有表達(dá)。人類MDM2定位于12p13-14，其表達(dá)的調(diào)節(jié)相當(dāng)復(fù)雜，并且mRNA剪接形式的方式多樣[3]。MDM2有5個(gè)保守區(qū)，其中在V區(qū)含有一個(gè)環(huán)指結(jié)構(gòu)域，可介導(dǎo)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)的相互作用，也可以與DNA或RNA結(jié)合[4]。MDM2具有癌基因的功能，它可以和P53結(jié)合并抑制P53的功能，36%的肉瘤存在MDM2的擴(kuò)增，而大約5%～10%的人類腫瘤有MDM2的過度表達(dá)[1]。MDM2的癌基因功能已經(jīng)在肺癌、乳腺癌等惡性腫瘤中得到證實(shí)[5-7]。 MDM2在OSCC中的作用國(guó)外報(bào)道也有很多[8-10]，國(guó)內(nèi)唐瞻貴等[11-12]發(fā)現(xiàn)其在口腔疣狀癌中發(fā)揮重要作用。雖然MDM2在OLK中的作用國(guó)外早有文獻(xiàn)報(bào)道[13]，但是近年來一直沒有進(jìn)展，而國(guó)內(nèi)這方面的報(bào)道則少見。

p53被稱為基因組衛(wèi)士，大約50%以上的人類惡性腫瘤中發(fā)生了p53基因的突變[14]。p53介導(dǎo)的信號(hào)途徑在細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、衰老、應(yīng)激等生命過程中起著重要的調(diào)控作用，而且與細(xì)胞內(nèi)其他信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路間存在著錯(cuò)綜復(fù)雜的相互關(guān)系[15]，其中P53與MDM2形成的負(fù)反饋調(diào)節(jié)環(huán)最引人注目。MDM2是p53的轉(zhuǎn)錄靶基因，含有2個(gè)p53基因結(jié)合位點(diǎn)，在抑制p53的活性過程中發(fā)揮關(guān)鍵的作用。P53的過表達(dá)或活性上升可促進(jìn)MDM2表達(dá)，致使細(xì)胞中MDM2蛋白水平升高，并轉(zhuǎn)而與P53的N末端轉(zhuǎn)錄激活區(qū)結(jié)合形成復(fù)合物，封閉其轉(zhuǎn)錄活性，抑制其功能，而MDM2水平的升高，反過來激活P53，抑制MDM2，這樣就形成了一個(gè)P53/MDM2負(fù)反饋調(diào)節(jié)環(huán)，調(diào)節(jié)P53的穩(wěn)定性[16]。另外，在沒有應(yīng)激刺激的條件下，MDM2通過泛素蛋白連接酶，使P53羧基末端多個(gè)賴氨酸泛素化，促使P53的降解[17]。

本研究表明：MDM2在OLK組和OSCC組的陽(yáng)性表達(dá)率與正常組相比均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），并且MDM2在不同病變組織中的陽(yáng)性表達(dá)率隨組織惡性程度增高呈上升趨勢(shì)。這說明MDM2蛋白在正常黏膜組織到癌轉(zhuǎn)化的初始階段（癌前病變，如白斑）就已經(jīng)參與其中并起到重要的作用，并且它的作用有隨組織的惡性程度升高而增加的趨勢(shì)。然而MDM2在OLK組和OSCC組之間的陽(yáng)性表達(dá)率卻沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.145＞0.05），這說明雖然MDM2的作用有隨組織的惡性程度升高而增加的趨勢(shì)，但是其在OLK組和OSCC組中所起的作用卻相差不大。推測(cè)這是因?yàn)镸DM2的過表達(dá)在口腔正常黏膜到OLK的轉(zhuǎn)化過程中就已經(jīng)頻繁發(fā)生，而不是OSCC階段才發(fā)生的事件。Lim等[8]也證明：在OSCC的發(fā)生中經(jīng)常發(fā)生MDM2的過表達(dá)事件。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)OLK組中MDM2染色的細(xì)胞主要位于上皮基底層，而在OSCC組中MDM2染色的細(xì)胞則基本布滿整個(gè)上皮層，這也與國(guó)外的報(bào)道[18]相一致。

野生型P53的半衰期很短，不易檢測(cè)到，而突變型P53蛋白其半衰期延長(zhǎng)，能夠用免疫組織化學(xué)的方法檢測(cè)出。本研究中P53在OLK組和OSCC組的陽(yáng)性表達(dá)率與正常組相比均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），并且P53在不同病變組織中的陽(yáng)性表達(dá)率也隨組織惡性程度增高而呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，這與之前的研究結(jié)論相符[13，19]。

腫瘤的形成往往是多種因素同時(shí)或先后作用的結(jié)果，為此本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究了2種蛋白出現(xiàn)陽(yáng)性表達(dá)的相關(guān)性。Yanamoto等[9]研究發(fā)現(xiàn)P53/MDM2的聯(lián)合表達(dá)與OSCC的侵襲程度有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：MDM2與P53蛋白在OLK及OSCC中的表達(dá)均呈現(xiàn)正相關(guān)的關(guān)系。這說明：從口腔正常黏膜向OLK乃至OSCC轉(zhuǎn)變的過程中，MDM2與P53蛋白的作用密切相關(guān)，很可能是這二者的協(xié)同作用最終導(dǎo)致了OSCC的發(fā)生。

目前，對(duì)腫瘤發(fā)生的分子機(jī)制、基因治療等研究主要集中在“基因組衛(wèi)士”P53身上，P53基因治療OLK的研究方興未艾[20-21]，而MDM2作為P53主要的抑制因子，對(duì)MDM2與P53蛋白在口腔腫瘤中的表達(dá)及相關(guān)性進(jìn)行研究顯得尤為必要。本研究對(duì)MDM2與P53蛋白在口腔正常黏膜、OLK及OSCC不同疾病階段的表達(dá)及相關(guān)性進(jìn)行了初步研究，這將有助于闡明口腔腫瘤發(fā)生及轉(zhuǎn)歸的機(jī)制，對(duì)口腔腫瘤的臨床預(yù)防、監(jiān)測(cè)具有一定的指導(dǎo)意義。

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（本文編輯 湯亞玲）

Expression and its relationship of murine double m inute 2 and P53 protein in oral leukoplakia and squamous cell carcinoma

HAN Bang-feng,WU Ping-fan,PAN Jian,LI Yi,LI Long-jiang.（State Key Laboratory of Oral Diseases,Sichuan University,Chengdu610041,China）

ObjectiveTo study the expression and its relationship of murine double minute 2（MDM2）,P53 protein in oral leukoplakia and squamous cell carcinoma.MethodsImmunohistochemical assay was used to detect the expression of MDM2 and P53 proteins in 15 normal oral epithelium tissues,24 cases of oral leukoplakias and 41 cases of oral squamous cell carcinomas.Results There were no positive expression of MDM2 and P53 in normal mucosa.With significantly difference compared with the normal group（P＜0.05）,the positive rates of MDM2 and P53 were 58.3%,75.6%and 37.5%,68.3%in oral leukoplakia and squamous cell carcinoma.MDM2-positive rate had no significant difference（P＞0.05）,while P53-positive rate was significant difference（P＜0.05）compared with oral leukoplakia and oral squamous cell carcinoma.Two kinds of indicators for further correlation analysis showed that MDM2 and P53 protein showed a positive correlation relationship both in oral leukoplakia（P=0.018）and oral squamous cell carcinoma（P=0.000）.ConclusionThe expression of MDM2 in oral leukoplakia and oral squamous cell carcinoma suggests that this gene may play a significant role in the process of carcinogenesis of oral squamous cell carcinoma.The correlation of MDM2 and P53 expression indicates that both of them may play a synergistic role in the process of carcinogenesis of oral squamous cell carcinoma.

murine double minute 2； P53 protein； oral leukoplakia； oral squamous cell carcinoma

R 782.2

A

10.3969/j.issn.1000-1182.2011.01.019

1000－1182（2011）01－0079-04

2009-11-25；

2010-03-02

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（30973345和30471901）

韓幫鋒（1982—），男，山東人，碩士

李龍江，Tel：028-85501428