馬麗 張建全 潘亞萍,3
(1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院 口腔生物學(xué)教研室,沈陽(yáng) 110002;2.天津市寶坻區(qū)人民醫(yī)院 口腔科,天津 301800;3.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院 牙周科,沈陽(yáng) 110002)
福賽斯坦納菌在2型糖尿病患者齦下菌斑中的分布
馬麗1張建全2潘亞萍1,3
(1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院 口腔生物學(xué)教研室,沈陽(yáng) 110002;2.天津市寶坻區(qū)人民醫(yī)院 口腔科,天津 301800;3.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院 牙周科,沈陽(yáng) 110002)
目的 觀察福賽斯坦納菌(T.forsythensis)在2型糖尿病患者不同牙周狀況下的分布及其與相關(guān)影響因素的關(guān)系,探討T.forsythensis在慢性牙周炎與2型糖尿病中的作用。方法 采集160例不同牙周狀況的2型糖尿病患者的齦下集合菌斑,采用酚-氯仿法提取細(xì)菌DNA,應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)法對(duì)T.forsythensis進(jìn)行檢測(cè)。采用Pearson相關(guān)和Logistic回歸等統(tǒng)計(jì)方法分析T.forsythensis與牙周及全身狀況的相關(guān)性。結(jié)果 160例糖尿病患者中,T.forsythensis在牙周健康組未檢出,在輕度牙周炎組檢出率為47.82%,中度牙周炎組為48.71%,重度牙周炎組為67.39%。重度牙周炎組的檢出率明顯高于輕、中度組(P<0.05)。與T.forsythensis獨(dú)立相關(guān)的因素有簡(jiǎn)化口腔衛(wèi)生指數(shù)和糖尿病病程,OR值分別為1.947、0.873。結(jié)論T.forsythensis在2型糖尿病牙周炎患者中的分布與口腔衛(wèi)生狀況、牙周破壞程度及糖尿病病程有關(guān)。
2型糖尿病; 慢性牙周炎; 福賽斯坦納菌
福賽斯坦納菌(Tannerella forsythensis,T.forsythensis)是一種革蘭陰性厭氧桿菌,是牙周疾病重要的致病菌之一,與牙周炎的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本課題組前期研究[1]發(fā)現(xiàn):在同等程度的牙周炎癥下,T.forsythensis在伴2型糖尿病的牙周炎患者中的檢出率及相對(duì)數(shù)量明顯高于無糖尿病的牙周炎患者。為探討T.forsythensis增多的可能原因,本研究采用以16S rRNA為基礎(chǔ)的聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)技術(shù)檢測(cè)160例2型糖尿病患者不同牙周狀況下T.forsythensis的分布情況,分析T.forsythensis與牙周臨床指標(biāo)及糖尿病相關(guān)指標(biāo)的關(guān)系,進(jìn)一步探討T.forsythensis在慢性牙周炎與2型糖尿病中的作用。
PCR反應(yīng)相關(guān)試劑(包括Tag DNA聚合酶、10× PCR緩沖液、dNTP)和DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)DL2000,均購(gòu)自日本TaKaRa公司。主要實(shí)驗(yàn)儀器為PCR擴(kuò)增儀(Tgradient型,Biometra公司,德國(guó))、自動(dòng)凝膠成像分析儀(GDS8000型,UVP公司,美國(guó))。采用國(guó)際參考標(biāo)準(zhǔn)菌株T.forsythensis ATCC 43037作為陽(yáng)性對(duì)照,變異鏈球菌作為陰性對(duì)照。以上菌株均來自中國(guó)醫(yī)科大學(xué)口腔中心實(shí)驗(yàn)室菌種保存中心。
樣本源自2007年7—12月在遼寧省莊河、盤錦、康平及沈陽(yáng)大東地區(qū)的城鎮(zhèn)和農(nóng)村,采用時(shí)點(diǎn)橫斷面研究方法對(duì)2型糖尿病患者的牙周狀況進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查的人群。按本試驗(yàn)要求選取并納入受試者160例,年齡為33~73歲,平均年齡為(53.84±9.60)歲;其中男65例,女95例;初診為2型糖尿病者99例,有2型糖尿病病史者61例。
受試者要求符合以下條件:無全身其他系統(tǒng)性疾病,婦女非妊娠期,未服用避孕藥;近半年內(nèi)未做過牙周治療;3個(gè)月內(nèi)未服用過抗生素;無明顯咬合關(guān)系異常;試驗(yàn)前需簽署知情同意書。2型糖尿病的診斷標(biāo)準(zhǔn)[2]:空腹血糖(fasting blood glucose,F(xiàn)BG)≥7.0mmol·L-1和(或)糖耐量實(shí)驗(yàn)2 h血糖(oral glucose tolerance test 2 h blood glucose,OGTT 2 h BG)≥11.1mmol·L-1。
牙周健康者要求符合以下條件:全口牙探診深度(probing depth,PD)≤3 mm,無臨床附著喪失(clinical attachment loss,CAL),齦溝出血指數(shù)(sulcus bleeding index,SBI)≥2的位點(diǎn)不超過10%,無SBI≥4的位點(diǎn)[3]。參照Armitage等[4]推薦的診斷標(biāo)準(zhǔn),將慢性牙周炎患者細(xì)分為以下3組。1)輕度牙周炎組:平均CAL為0.6~1.59mm,無鄰面部位CAL≥3mm,缺失牙不超過3顆。2)中度牙周炎組:平均CAL為1.60~2.49mm,口內(nèi)至少3個(gè)區(qū)或至少6顆牙齒CAL≥3mm,但CAL≥3mm的部位鄰面不超過8個(gè),缺失牙不超過5顆。3)重度牙周炎組:平均CAL≥2.5mm,口內(nèi)3個(gè)區(qū)有1個(gè)或多個(gè)部位鄰面CAL≥5mm,缺失牙不超過14顆。
口腔檢查前所有受試者均要求接受統(tǒng)一的問卷調(diào)查。問卷內(nèi)容除性別、年齡等一般情況外,還包括家庭月收入,吸煙、飲酒情況,口腔衛(wèi)生習(xí)慣,糖尿病史及用藥情況等。
試驗(yàn)引物參見Ashimoto等[6]的設(shè)計(jì)。T.forsythensis特異性引物序列為:(F)5’-GCGTATGTAACCTGCCCGCA-3’,(R)5’-TGCTTCAGTGTCAGTTATACCT-3’,PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為641 bp;細(xì)菌通用引物序列為:(F)5’-ATTAGATACCCTGGTAGTCCAC-3’,(R)5’-CCCGGGAACGTATTCACCG-3’,擴(kuò)增產(chǎn)物為602 bp。本試驗(yàn)引物由大連寶生物技術(shù)有限公司合成。
Moving the known items in Eq.(1)to the left of the equal sign gets
PCR反應(yīng)在25μL反應(yīng)體系中進(jìn)行,95℃預(yù)變性2min后,進(jìn)入主循環(huán):95℃變性45 s,58.5℃退火1min,72℃延伸60 s。35個(gè)循環(huán)后72℃延伸10min。質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。紫外燈下觀察結(jié)果并經(jīng)自動(dòng)凝膠成像分析儀拍照,應(yīng)用電泳凝膠成像分析軟件Fluorchem V2.0分析各電泳條帶的平均灰度值(average gradation,AVG)。計(jì)算T.forsythensis特異性引物與該菌斑通用引物的PCR產(chǎn)物的AVG比值,以分析齦下菌斑中T.forsythensis所占比例在不同組間的差異[5]。
每批PCR擴(kuò)增均設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照。所有試驗(yàn)樣本的測(cè)定均在盲法下進(jìn)行,并用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)抽取10%的樣本做重復(fù)試驗(yàn),檢測(cè)PCR結(jié)果的可靠性。T.forsythensis特異性引物與通用引物的PCR產(chǎn)物在同一凝膠上同時(shí)進(jìn)行3次電泳,取平均值為最終灰度值比值。
采用SPSS 11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,統(tǒng)計(jì)方法采用t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)、Pearson相關(guān)性分析和Logistic回歸分析等,檢驗(yàn)水準(zhǔn)為雙側(cè)α=0.05。
160例2型糖尿病患者中,牙周健康者6例,慢性牙周炎154例,其中輕度牙周炎23例,中度39例,重度92例。牙周炎的患病率為96.25%。160例患者的年齡和牙周檢查結(jié)果見表1。
表1 受試者的年齡及牙周檢查結(jié)果Tab 1 The age and the clinical periodontal index of subjects ±s
表1 受試者的年齡及牙周檢查結(jié)果Tab 1 The age and the clinical periodontal index of subjects ±s
分組 例數(shù) 年齡/歲 PD/mm CAL/mm SBI OHI-S輕度牙周炎 23 49.2±9.5 2.22±0.65 1.20±0.29 1.06±0.49 1.09±0.49中度牙周炎 39 52.8±9.4 2.51±0.06 2.06±0.27 1.20±0.58 1.45±0.46重度牙周炎 92 56.0±9.2 2.88±0.55 3.67±0.95 1.76±0.64 1.89±0.64牙周健康 6 46.3±2.4 2.00±0.15 0.38±0.05 0.93±0.10 1.08±0.12
T.forsythensis部分PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果見圖1。分別采用T.forsythensisATCC 43037的DNA、變異鏈球菌DNA和無菌雙蒸水作為陽(yáng)性、陰性和空白對(duì)照。
圖1 T.forsythensis特異性引物檢測(cè)電泳圖Fig 1 Electrophoresis results of PCR products with T.forsythensisspecific primer
T.forsythensis在牙周健康組未檢出;在輕度牙周炎組檢出11例,檢出率為47.82%;在中度牙周炎組檢出19例,檢出率為48.71%;在重度牙周炎組檢出62例,檢出率為67.39%。重度牙周炎組的檢出率明顯高于輕、中度牙周炎組(P<0.05)。
2.2.1T.forsythensis與牙周及口腔衛(wèi)生狀況的關(guān)系本組研究對(duì)象中,牙周狀況、口腔衛(wèi)生狀況及生活習(xí)慣與T.forsythensis的關(guān)系見表2。
表2 T.forsythensis的分布與受試者的牙周指數(shù)、OHIS及相關(guān)生活習(xí)慣的關(guān)系Tab 2 Relationship between the distribution of T. forsythensis and periodontal index,OHI-S and related habits
T.forsythensis陽(yáng)性患者的PD、CAL、OHI-S明顯高于陰性患者(P<0.05);T.forsythensis檢出情況與吸煙、飲酒等與口腔健康相關(guān)的生活習(xí)慣無關(guān),與每天刷牙次數(shù)及刷牙時(shí)間也無關(guān)。另外,經(jīng)Pearson相關(guān)性分析,T.forsythensis特異性引物與菌斑通用引物的AVG比值與OHI-S呈正相關(guān)(r=0.405,P= 0.001)。
2.2.2T.forsythensis與血糖、血脂、血壓的關(guān)系T. forsythensis檢出情況與患者的血糖、血脂、血壓的關(guān)系見表3。由表3可見:T.forsythensis陽(yáng)性患者的TC水平明顯高于陰性患者(P=0.002)。另外,經(jīng)Pearson相關(guān)性分析,T.forsythensis特異性引物與菌斑通用引物的AVG比值與FBG呈正相關(guān),且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(r=0.275,P=0.033)。
表3 T.forsythensis的分布與受試者的基本情況及全身因素的關(guān)系Tab 3 Relationship between the distribution of T. forsythensis and demographic,system ic conditions of subjects
2.2.3T.forsythensis的分布與年齡、性別、居住地區(qū)、家庭月收入、糖尿病病程等基本資料的關(guān)系T.forsythensis的分布與受試者基本情況的關(guān)系見表3。T.forsythensis的檢出率農(nóng)村明顯高于城鎮(zhèn)(P= 0.001)。另外,T.forsythensis特異性引物與菌斑通用引物的AVG比值農(nóng)村患者明顯高于城鎮(zhèn)患者(P= 0.001),男性明顯高于女性(P=0.001)。T.forsythensis陽(yáng)性患者的糖尿病病程短于T.forsythensis陰性患者(P=0.006),初診為糖尿病的患者的T.forsythensis檢出率明顯高于有糖尿病病史的患者(P=0.005)。
T.forsythensis是牙周炎最重要的微生物危險(xiǎn)因素之一,也是目前公認(rèn)的牙周炎證據(jù)最為充分的三大主要致病菌之一。Smith等[7]用PCR方法檢測(cè)伴糖尿病的慢性牙周炎患者的齦下菌斑,T.forsythensis檢出率為50%。Hintao等[8]用棋盤式DNA-DNA雜交法檢測(cè)伴2型糖尿病的重度牙周炎患者,T.forsythensis檢出率為69.9%。本試驗(yàn)中,重度牙周炎組T.forsythensis的檢出率為67.39%,接近Hintao等[8]的結(jié)果,可能與檢測(cè)人群同為亞洲人有關(guān)。目前國(guó)內(nèi)對(duì)2型糖尿病患者T.forsythensis的檢測(cè)報(bào)道還較少,楊禾等[9]曾對(duì)單純的重度牙周炎病變位點(diǎn)的齦下菌斑進(jìn)行檢測(cè),T.forsythensis檢出率為56.5%。
本試驗(yàn)中,T.forsythensis在伴2型糖尿病的牙周炎標(biāo)本中同樣有較高的檢出率,并隨牙周炎癥程度的增加而逐漸增加,這種趨勢(shì)與不伴有糖尿病的牙周炎情況相似。由此可見:T.forsythensis也是伴2型糖尿病的慢性牙周炎患者口腔中重要的致病菌。至于T.forsythensis在牙周健康的2型糖尿病患者口腔中的分布情況,本試驗(yàn)中該類患者只有6例,尚未檢測(cè)到T.forsythensis。楊禾等[9]在牙周及全身健康人群的T.forsythensis檢出率為10.9%;本研究在前期試驗(yàn)中,40例健康者中有5例檢出T.forsythensis。
研究[10-11]顯示:T.forsythensis與牙周附著喪失明顯相關(guān)。Machtei等[12]報(bào)道:如果在基線時(shí)檢測(cè)到T. forsythensis,則意味著牙周袋深度增加的危險(xiǎn)增大了7倍,以后發(fā)生牙槽骨喪失就比較顯著;同時(shí),T. forsythensis的檢出率與牙周袋深度有關(guān),牙周袋越深則T.forsythensis檢出率越高。Klein等[13]用PCR方法檢測(cè)不同牙周狀況齦下菌斑中T.forsythensis的情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn):任何健康部位都沒有檢出T.forsythensis,而牙周袋深度小于5mm的牙周病變部位T.forsythensis檢出率為70%,牙周袋深度大于或等于5mm部位的檢出率為100%。本試驗(yàn)結(jié)果表明:在2型糖尿病患者中,T.forsythensis的檢出情況與多種牙周檢測(cè)指標(biāo)如PD、CAL、OHI-S相關(guān),這與其他學(xué)者在單純慢性牙周炎中的研究結(jié)果一致。
本試驗(yàn)采用多種統(tǒng)計(jì)方法進(jìn)行分析,結(jié)果顯示:T.forsythensis與性別、居住地區(qū)、FBG、TC、OHI-S及糖尿病病程有相關(guān)性。將以上相關(guān)因素用Logistic逐步回歸去除因素間的相互影響后,顯示T. forsythensis與性別、居住地區(qū)、FBG和TC均不相關(guān),只與OHI-S和糖尿病病程獨(dú)立相關(guān)。分析其原因,可能是因?yàn)楸窘M研究對(duì)象中農(nóng)村患者的OHI-S及TC水平明顯高于城市患者[14],這些因素的作用導(dǎo)致了T.forsythensis與居住地區(qū)、TC水平相關(guān)的假陽(yáng)性結(jié)果。與糖尿病相關(guān)的指標(biāo)TC及FBG與T.forsythensis未獨(dú)立相關(guān),提示糖尿病患者的高血糖狀態(tài)可能并不直接影響T.forsythensis的定植,而是通過影響牙周組織的炎癥程度等其他途徑間接引起2型糖尿病患者中T.forsythensis檢出率偏高的現(xiàn)象。另外,本試驗(yàn)受試者的糖尿病持續(xù)時(shí)間相對(duì)較短,T.forsythensis與機(jī)體血糖的相互影響尚不充分,也可能是導(dǎo)致陰性結(jié)果的重要原因。
有學(xué)者[15]提出糖尿病患者齦下菌群的數(shù)量及細(xì)菌種類與血糖、血脂的相關(guān)性與糖尿病病程、牙周損害程度有關(guān),即糖尿病病程越長(zhǎng),牙周損害越重,這種相關(guān)性就越強(qiáng);反之,在糖尿病病程較短、牙周損害較輕的病例中,細(xì)菌與血糖、血脂并無明顯相關(guān)性,且齦下菌群的數(shù)量與糖尿病的血糖水平也無明顯差異。臨床資料也顯示,糖尿病病程較短、牙周損害較輕的病例,兩者治療效果的相互影響并不明顯。由此看來:疾病持續(xù)時(shí)間可能在糖尿病和牙周炎的相互影響以及牙周可疑致病菌與2種疾病的相互影響中發(fā)揮重要作用。本試驗(yàn)未嚴(yán)格限定2種疾病的持續(xù)時(shí)間,尤其確認(rèn)慢性牙周炎的病程較為困難,可能給結(jié)果帶來一定偏差,在以后的研究中應(yīng)將病程因素充分考慮。至于本研究中T. forsythensis與糖尿病病程存在獨(dú)立相關(guān)性這種現(xiàn)象,是2型糖尿病對(duì)T.forsythensis的影響結(jié)果,還是2型糖尿病發(fā)生的重要原因,尚待進(jìn)一步研究。
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(本文編輯 胡興戎)
Prevalence of Tannerella forsythensis in subgingival p laque of type 2 diabetic patients
MA Li1,ZHANG Jian-quan2,PAN Ya-ping1,3.(1.Dept.of Oral Biology,School of Stomatology,China Medical University,Shenyang110002,China;2.Dept.of Stomatology,Baodi People’s Hospital of Tianjin,Tianjin301800,China;3.Dept.of Periodontics,School of Stomatology,China Medical University,Shenyang110002,China)
ObjectiveTo study the prevalence ofTannerella forsythensis(T.forsythensis)in the subgingival plaque of type 2 diabetes,analyze the relationship betweenT.forsythensisand related factors,discuss the role ofT.forsythensisin the chronic periodontitis and type 2 diabetes.Methods160 subgingival plaque samples were collected from type 2 diabetic patients and pathogens genomic DNA were extracted by phenol and chloroform from plaque.T. forsythensiswas detected by polymerase chain reaction,and Pearson correlation and Logistic regression analysis were used to analyze the relationship betweenT.forsythensisand systemic factors and periodontal status.Results The prevalence ofT.forsythensisin mild,moderate,severe periodontitis group was 47.82%,48.71%,67.39%respectively,and the prevalence was higher in the severe periodontitis group than in mild,moderate group(P<0.05).There was noT.forsythensisin 6 diabetic patients with healthy periodontium.Logistic regression analysis illustrated that the prevalence ofT.forsythensiswas associated with simplified oral hygiene index(OHI-S)and diabetic duration(OR= 1.947,OR=0.873).ConclusionThe prevalence ofT.forsythensisin type 2 diabetes with chronic periodontitis was related with oral hygiene,periodontal status and diabetic duration.
type 2 diabetes; chronic periodontitis;Tannerella forsythensis
R 781.4
A
10.3969/j.issn.1000-1182.2011.01.014
1000-1182(2011)01-0057-05
2010-02-12;
2010-07-15
國(guó)家“十一五”科技支撐計(jì)劃基金資助項(xiàng)目(2007-BAI-18B02);遼寧省科學(xué)技術(shù)計(jì)劃基金資助項(xiàng)目(2007225007)
馬麗(1979—),女,遼寧人,碩士
潘亞萍,Tel:024-22891701