胡赟 鄭雷蕾 唐甜 趙志河 宋錦璘 鄧鋒

（1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院 口腔預(yù)防與兒童牙病科；

2.正畸科，重慶 400015；3.四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院 正畸科，成都 610041）

正畸微種植體周?chē)讓?duì)骨結(jié)合界面影響的研究

胡赟1鄭雷蕾2唐甜3趙志河3宋錦璘2鄧鋒2

（1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院 口腔預(yù)防與兒童牙病科；

2.正畸科，重慶 400015；3.四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院 正畸科，成都 610041）

目的 研究微種植體周?chē)讓?duì)微種植體-骨界面的組織學(xué)改變，同時(shí)對(duì)齦溝液相關(guān)細(xì)胞因子進(jìn)行檢測(cè)，從而探討微種植體周?chē)椎陌l(fā)生機(jī)制。方法 健康雄性Beagle純種犬4只，采用自身對(duì)照，隨機(jī)選定實(shí)驗(yàn)動(dòng)物一側(cè)為對(duì)照組，一側(cè)為實(shí)驗(yàn)組，每側(cè)植入4枚微種植體。實(shí)驗(yàn)組種植體頸部結(jié)扎絲線，誘導(dǎo)微種植體周?chē)?。在植入后?、2、3、4周分別處死動(dòng)物，處死前收集種植體周?chē)l溝液（PISF），酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)腫瘤壞死因子-α（TNF-α）含量，收集標(biāo)本做硬組織切片觀察。結(jié)果 根據(jù)植入后時(shí)間的延長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)組微種植體頸部表現(xiàn)明顯的進(jìn)展性破壞：植入1周微種植體頸部聚集大量炎性細(xì)胞，但并沒(méi)有破壞皮質(zhì)骨；植入2周微種植體頸部皮質(zhì)骨已經(jīng)出現(xiàn)少量角形吸收；植入3周表現(xiàn)骨吸收進(jìn)一步向縱深發(fā)展；植入4周表現(xiàn)骨吸收已經(jīng)至第二螺紋，充滿大量膠原纖維。植入后1、2、3、4周，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組PISF和TNF-α相比均有顯著性差異（P<0.05），實(shí)驗(yàn)組高于對(duì)照組；實(shí)驗(yàn)組植入后4周PISF和TNF-α顯著高于其余各階段（P<0.05）。結(jié)論 微種植體周?chē)资紫绕茐慕Y(jié)合界面頸部，并沿界面進(jìn)一步縱深發(fā)展。無(wú)論是健康或者炎癥的微種植體周?chē)加蠺NF-α表現(xiàn)，炎癥的發(fā)生可能是造成TNF-α含量上調(diào)的始動(dòng)因素，炎癥的發(fā)生進(jìn)一步加劇了TNF-α表達(dá)的上調(diào)。

微種植體； 微種植體周?chē)祝?腫瘤壞死因子-α； 種植體周?chē)l溝液

微種植體應(yīng)用于正畸臨床在近年來(lái)取得了極大的發(fā)展。早期對(duì)于微種植體的研究主要集中在種植體的骨組織界面，并且取得了突出的成果。近年來(lái)，對(duì)于微種植體與口腔黏膜上皮的軟組織界面的研究正逐漸引起眾多學(xué)者的重視。

種植體與自然牙齒在結(jié)構(gòu)上有著本質(zhì)的區(qū)別，種植體表面沒(méi)有牙骨質(zhì)和牙周膜纖維，與口腔黏膜上皮的附著也不同于自然牙的結(jié)合上皮，因而其生物屏障作用就顯得相對(duì)薄弱，容易被細(xì)菌及其他炎癥因子侵入組織內(nèi)環(huán)境而引起炎癥。微種植體周?chē)祝╬eri-implantitis）是指種植體周?chē)M織由于受到細(xì)菌等致病原的侵襲而引起的組織炎癥反應(yīng)。微種植體周?chē)淄鶗?huì)導(dǎo)致微種植體-骨界面的喪失、骨組織吸收、微種植體松動(dòng)，是導(dǎo)致微種植體失敗的主要原因之一。本研究通過(guò)建立Beagle犬的微種植體周?chē)椎膭?dòng)物模型，研究微種植體周?chē)讓?duì)微種植體-骨界面的組織學(xué)改變，對(duì)齦溝液相關(guān)細(xì)胞因子進(jìn)行檢測(cè)，從而探討微種植體周?chē)椎陌l(fā)生機(jī)制，以期為微種植體廣泛應(yīng)用于臨床奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選用健康雄性Beagle純種犬4只（由四川大學(xué)華西實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），體重13～14 kg，年齡為18個(gè)月。要求牙體、牙列完整，無(wú)齲壞及牙周病，咬合關(guān)系正常。根據(jù)預(yù)計(jì)觀察的時(shí)間，將犬分別編號(hào)為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ號(hào)，分為1、2、3、4周組。所有Beagle犬均采用籠中特殊飼養(yǎng)的方法，定時(shí)、定量攝食，自由飲水。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)[1]。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)材料及試劑

Aarhus microcrew自攻型純鈦微種植釘（直徑1.6mm，螺紋長(zhǎng)度6.0mm，穿齦部分長(zhǎng)度2.5mm，Medicon公司，德國(guó)）；速眠新Ⅱ（長(zhǎng)春農(nóng)牧大學(xué)獸醫(yī)研究所產(chǎn)）；Eppendorf離心管（Boster公司，中國(guó)）；腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）試劑盒（Immunotech公司，法國(guó)），硬組織切片機(jī)（Leica公司，德國(guó)）；光學(xué)顯微鏡（Nikon公司，日本）。

1.3 植入過(guò)程

在Beagle犬后肢臀部肌肉注射麻醉藥速眠新Ⅱ（0.04mL·kg-1）麻醉后，四肢固定于犬固定床，繃帶張口固定，消毒鋪巾。種植手術(shù)由同一術(shù)者行常規(guī)操作完成。含腎上腺素2%利多卡因浸潤(rùn)注射術(shù)區(qū)口腔前庭溝底，以減少術(shù)區(qū)出血和保證麻醉深度。在下頜雙側(cè)前磨牙區(qū)域用探針暴露頰側(cè)骨質(zhì)，低速引導(dǎo)鉆（鉆速800 r·min-1）鉆開(kāi)皮質(zhì)骨，持續(xù)用冷生理鹽水沖洗降溫；用就位器將微種植體植入到位。采用同體對(duì)照，隨機(jī)選定實(shí)驗(yàn)動(dòng)物一側(cè)為對(duì)照組，另一側(cè)為實(shí)驗(yàn)組，每側(cè)植入4枚微種植體。實(shí)驗(yàn)組種植體頸部結(jié)扎絲線，誘導(dǎo)微種植體周?chē)桩a(chǎn)生。

手術(shù)后，所有實(shí)驗(yàn)犬均攝入半流質(zhì)飼料，從而避免硬質(zhì)食物對(duì)微種植體的撞擊，定期對(duì)種植體動(dòng)度和種植體周?chē)例l進(jìn)行檢查，同時(shí)定期對(duì)種植區(qū)進(jìn)行X線攝片。

1.4 種植體周?chē)l溝液（peri-implant sulcular fluid，PISF）的收集

在植入后第1、2、3、4周分別處死第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ號(hào)動(dòng)物，處死前收集PISF。將濾紙剪裁成條狀（2mm×10mm），放置于1.5mL的EP離心管中，用精密電子天平（上海天平儀器廠）定量后備用。收集齦溝液前除盡收集部位的菌斑，隔濕后用氣槍輕輕吹干種植體表面，1min后，將濾紙條插入種植體與軟組織間隙，當(dāng)有阻力時(shí)停止插入，停留30 s后，取出紙簽，放回離心管中，立即稱重。前后重量之差即為PISF的量，以齦溝液的密度為1 g·mL-1計(jì)算PISF的體積。然后加入200μL樣本稀釋液置于-70℃冰箱保存待檢。每枚微種植體收集頰、舌、近、遠(yuǎn)中向4個(gè)位點(diǎn)的齦溝液[2]。

1.5 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）法檢測(cè)TNF-α

將齦溝液標(biāo)本在室溫下自然解凍后，低溫離心10min（4℃，10 000 r·min-1），取上清液。將100μL TNF-α標(biāo)準(zhǔn)液、質(zhì)控液及樣本加入含抗TNF-α單克隆抗體的96板孔中，留出第1孔作空白對(duì)照，再加入100μL TNF-α單克隆抗體和堿性磷酸酶于各孔，底物空白孔除外，振蕩培養(yǎng)2 h（18～25℃，350 r·min-1）。洗滌后，加入200μL底物到所有的孔中，振蕩培養(yǎng)30min（24℃，350 r·min-1）。加入50μL終止液，用405 nm的波長(zhǎng)檢測(cè)吸光度值，計(jì)算齦溝液中TNF-α的含量。

1.6 組織學(xué)觀察

觀察期畢處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，離體取得包含微種植體、黏膜和頜骨的標(biāo)本，固定于10%甲醛溶液1周。用渦輪機(jī)將標(biāo)本修整成10mm×10mm×6mm組織塊，要求每個(gè)組織塊包含1枚種植釘和其周?chē)辽?mm的骨質(zhì)和被覆骨黏膜。將組織塊用甲基丙烯酸甲酯包埋，在硬組織切片機(jī)上進(jìn)行切片，然后行甲苯胺藍(lán)染色。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS 10.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以±s表示，樣本均數(shù)的比較采用單向方差分析。

2 結(jié)果

2.1 臨床觀察

植入微種植體均保持穩(wěn)定，未見(jiàn)松動(dòng)脫落，實(shí)驗(yàn)組微種植體周?chē)つそM織腫脹，圍繞種植體頸部，探診有出血。對(duì)照組微種植體周?chē)つゎ伾＃匆?jiàn)紅腫，無(wú)探針出血（圖1）。

2.2 組織學(xué)觀察

根據(jù)植入后時(shí)間的延長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)組微種植體頸部表現(xiàn)明顯的進(jìn)展性破壞（圖2）：植入1周微種植體頸部聚集大量炎性細(xì)胞，但并沒(méi)有破壞皮質(zhì)骨；植入2周微種植體頸部皮質(zhì)骨已經(jīng)出現(xiàn)少量角形吸收；植入3周表現(xiàn)骨吸收進(jìn)一步向縱深發(fā)展；植入4周表現(xiàn)骨吸收已經(jīng)達(dá)至第二螺紋，其中充滿大量的膠原纖維（圖2）。

圖1 微種植體植入情況Fig 1 Microscrew implantation

2.3 PISF檢測(cè)結(jié)果

植入后1、2、3、4周，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比均有顯著性差異（P＜0.05），實(shí)驗(yàn)組PISF量高于對(duì)照組；對(duì)照組在植入各階段PISF量沒(méi)有顯著性差異（P＞0.05）；實(shí)驗(yàn)組各階段PISF量?jī)蓛杀容^：實(shí)驗(yàn)組植入后4周PISF顯著高于其余各階段（P＜0.05），而植入后2周與3周比較，實(shí)驗(yàn)組PISF量沒(méi)有顯著性差異（P＞0.05），見(jiàn)圖3。

2.4 TNF-α檢測(cè)結(jié)果

植入后1、2、3、4周，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比均有顯著性差異（P＜0.05），實(shí)驗(yàn)組TNF-α量高于對(duì)照組；對(duì)照組在植入各階段TNF-α量沒(méi)有顯著性差異（P＞0.05）；實(shí)驗(yàn)組各階段TNF-α量?jī)蓛杀容^：實(shí)驗(yàn)組植入后4周顯著高于其余各階段（P＜0.05），而植入后2周與3周比較，實(shí)驗(yàn)組TNF-α量沒(méi)有顯著性差異（P＞0.05），見(jiàn)表1。

圖3 微種植體植入后實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組各階段PISF量Fig 3 Detection results of PISF between experimental group and control group after microscrew implantation

表1 微種植體植入后實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組各階段TNF-α檢測(cè)結(jié)果Tab 1 Detection results of TNF-α between experimental group and control group after m icroscrew im plantation ng·m L-1

3 討論

3.1 微種植體頸部“生物封閉”

微種植體貫穿口腔黏膜組織，其一端進(jìn)入組織內(nèi)環(huán)境，另一端在口腔這個(gè)外環(huán)境是有菌的環(huán)境，如果沒(méi)有一種封閉屏障存在，微生物則侵入組織內(nèi)，形成感染。天然牙頸部的生物封閉是由結(jié)合上皮、上皮下結(jié)締組織、游離齦纖維束、牙槽嵴纖維束的連接作用完成的。因此種植體在貫穿口腔黏膜組織這一區(qū)域與軟組織間能否有一種“生物封閉”，對(duì)種植體周組織健康和種植體長(zhǎng)期穩(wěn)固性至關(guān)重要。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：微種植體周?chē)捉M在植入后隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，其頸部表現(xiàn)明顯的進(jìn)展性破壞：植入1周微種植體頸部聚集大量炎性細(xì)胞，但并沒(méi)有破壞皮質(zhì)骨；植入2周微種植體頸部皮質(zhì)骨已經(jīng)出現(xiàn)少量角形吸收；植入3周表現(xiàn)骨吸收進(jìn)一步向縱深發(fā)展；植入4周表現(xiàn)骨吸收已經(jīng)至第二螺紋，充滿大量膠原纖維。這說(shuō)明微種植體對(duì)骨界面的破壞可能最先破壞“生物封閉”，隨后進(jìn)一步縱深發(fā)展，引起微種植體的松動(dòng)甚至脫落。有學(xué)者觀察到種植體頸部存在類(lèi)同天然牙頸部的基板和半橋粒結(jié)構(gòu)，培養(yǎng)的上皮細(xì)胞可在鈦、羥磷灰石等材料表面形成基板和半橋粒形式的黏附。這種類(lèi)同天然牙頸部的“生物封閉”機(jī)制的存在，對(duì)種植體的成功性予以理論支持[3-4]。種植手術(shù)后，血液及組織滲出液與種植體接觸，很快吞噬成纖維細(xì)胞與種植體表面接觸，并分泌細(xì)胞外基質(zhì)附著在種植體表面，術(shù)后1周就有上皮附著發(fā)生，在術(shù)后3周就可形成“生物封閉”。一些因素可破壞建立起的“生物封閉”，病理過(guò)程與牙周病機(jī)制相同。

3.2 PISF與微種植體周?chē)椎年P(guān)系

齦溝液是一種炎性滲出液，它的產(chǎn)生與齦下菌斑的性質(zhì)和比例密切相關(guān)。牙齦炎癥時(shí)齦溝內(nèi)含有的菌斑微生物產(chǎn)生一定量的大分子產(chǎn)物，這些產(chǎn)物在細(xì)胞與基底膜間擴(kuò)散，聚集于基底膜，從而產(chǎn)生了持續(xù)的滲透梯度，形成了齦溝液的流動(dòng)。與自然牙一樣，種植體周?chē)泊嬖邶l溝。PISF是指種植體周?chē)鷿B出的液體。本研究發(fā)現(xiàn)：實(shí)驗(yàn)組在植入各階段PISF量高于對(duì)照組，這表示微種植體周?chē)鶳ISF量的增加是由于種植體周?chē)装Y的發(fā)生而發(fā)生，這一結(jié)果與牙周病學(xué)的研究相似[5]。研究還發(fā)現(xiàn)：實(shí)驗(yàn)組植入后4周PISF和TNF-α顯著高于其余各階段，同時(shí)組織學(xué)研究也顯示骨界面的破壞在實(shí)驗(yàn)組呈進(jìn)行性發(fā)展，在4周時(shí)破壞最明顯。這提示PISF量更多的是反映了種植體周?chē)墙M織的變化，與Last等[6]和徐淑蘭等[7]的研究結(jié)果一致。

3.3 細(xì)胞因子TNF-α參與微種植體周?chē)椎臋C(jī)制

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：微種植體周?chē)M織無(wú)論是健康還是有炎癥，其PISF中均有TNF-α的表達(dá)，微種植體周?chē)椎腡NF-α的表達(dá)高于無(wú)炎癥者。PISF來(lái)源于血漿和組織液的滲出，推測(cè)微種植體周?chē)M織健康者的TNF-α可能是血漿中滲出所致[8-9]。微種植體周?chē)捉MTNF-α表達(dá)水平高于健康組，說(shuō)明炎癥的發(fā)生可能是造成TNF-α含量上調(diào)的始動(dòng)因素，炎癥的發(fā)生進(jìn)一步加劇了TNF-α表達(dá)的上調(diào)。文獻(xiàn)[10-11]報(bào)道：細(xì)胞因子可以通過(guò)旁分泌、自分泌調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞，促進(jìn)破骨細(xì)胞的活性，參與炎癥過(guò)程，導(dǎo)致組織破壞。徐淑蘭等[7]研究犬實(shí)驗(yàn)性種植體周?chē)l溝液滲出的幾種炎性細(xì)胞因子濃度的變化與骨吸收的關(guān)系發(fā)現(xiàn)：絲線結(jié)扎4周時(shí)齦溝液細(xì)胞因子的濃度明顯增高，骨性界面的骨組織出現(xiàn)明顯吸收。這與本研究結(jié)果一致，結(jié)合實(shí)驗(yàn)進(jìn)行的含微種植體的硬組織切片觀察，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)性微種植體炎進(jìn)展到4周時(shí)，骨吸收最明顯。

微種植體周?chē)资钦⒎N植體脫落的重要原因，涉及到口腔微生物學(xué)、種植學(xué)、正畸學(xué)、生物力學(xué)等多種交叉領(lǐng)域，如何進(jìn)一步明確微種植體周?chē)椎陌l(fā)生機(jī)制和優(yōu)化微種植體植入設(shè)計(jì)方案尚需進(jìn)一步探討。

[1] Schwarz F,Herren M,Sager M,et al.Comparison of naturally occurring and ligature induced peri-implantitis bone defects in humans and dogs[J].Clin Oral Implants Res,2007,18（4）：161-170.

[2] Kaklamanos EG,Tsalikis L.A review on peri-implant crevicular fluid assays potential in monitoring and predicting peri-implant tissue responses[J].J Int Acad Periodontol,2002,4（2）：49-59.

[3] Mankoo T.Contemporary implant concepts in aesthetic dentistry—Part 1：Biologic width[J].Pract Proced Aesthet Dent,2003,15（8）：609-616.

[4] Hermann JS,Schoolfield JD,Nummikoski PV,et al.Crestal bone changes around titanium implants：A methodologic study comparing linear radiographic with histometric measurements[J]. Int J Oral Maxillofac Implants,2001,16（4）：475-485.

[5] Niimi A,Ueda M.Crevicular fluid in the osseointegrated implant sulcus：A pilot study[J].Int J Oral Maxillofac Implants,1995,10（4）：434-436.

[6] Last KS,Cawood JI,Howell RA,et al.Monitoring of Tübingen endosseous dental implants by glycosaminoglycans analysis of gingival crevicular fluid[J].Int J Oral Maxillofac Implants,1991, 6（1）：42-49.

[7] 徐淑蘭,張開(kāi)宜,許曼波,等.實(shí)驗(yàn)性種植體周?chē)l溝液炎癥細(xì)胞因子濃度的檢測(cè)及其對(duì)界面骨吸收影響的研究[J].中國(guó)口腔種植學(xué)雜志,2002,7（3）：108-110.

XU Shu-lan,ZHANG Kai-yi,XU Man-bo,et al.The effect of cytokines in gingival crevicular fluid on absorbition of bone interface in experimental peri-implantitis[J].Chin J Oral Implant, 2002,7（3）：108-110.

[8] Panagakos FS,Aboyoussef H,Dondero R,et al.Detection and measurement of inflammatory cytokines in implant crevicular fluid：A pilot study[J].Int J Oral Maxillofac Implants,1996,11（6）：794-799.

[9] Curtis DA,Kao R,Plesh O,et al.Crevicular fluid analysis around two failing denta implants：A clinical report[J].J Prosthodont,1997,6（3）：210-214.

[10] Salcetti JM,Moriarty JD,Cooper LF,et al.The clinical,microbial,and host response characteristics of the failing implant[J].Int J Oral Maxillofac Implants,1997,12（1）：32-42.

[11] Perala DG,Chapman RJ,Gelfand JA,et al.Relative production of IL-1 beta and TNF alpha by mononuclear cells after exposure to dental implants[J].J Periodontol,1992,63（5）：426-430.

（本文編輯 湯亞玲）

Influence of the peri-im p lantitis to the m icroscrew-bone interface

HU Yun1,ZHENG Lei-lei2,TANG Tian3,ZHAO Zhi-he3,SONG Jin-lin2,DENG Feng2.（1.Dept.of Preventive and Pediatric Dentistry，The Affiliated Stomatology Hospital,Chongqing Medical University,Chongqing400015,China；2.Dept.of Orthodontics,The Affiliated Stomatology Hospital,Chongqing Medical University,Chongqing400015,China；3.Dept.of Orthodontics,West China College of Stomatology,Sichuan University,Chengdu610041,China）

ObjectiveTo study the histological change of microscrew-bone interface,detect the relative cytokine of gingival crevicular fluid,and explore the impossible mechanism of peri-implantitis.MethodsFour male Beagles were collected.Random ly select one side of animals jaw as the experimental group to induce the peri-implantitis, and another side as the controll group.Four microscrews were implanted on each side.In the 1st,2nd,3rd,4th weeks after implantation,collect peri-implant sulcular fluid（PISF）and detect tumor necrosis factor-α（TNF-α）levels before sacrificed,and the harvest tissue were observed in histological ways.Results According to the extension of time after implantation,the experimental group showed visible progress of interface destruction:1st week after implantation showed large numbers inflammatory cells collected at the neck but did not undermine the cortical bone;2nd week after implantation,cortical bone were observed angular absorption;Bone resorption continued to develop and at the 4th week,bone resorption were enlarged to the second thread of microscrew and the interface was filled with a large number of collagen fibers.ConclusionThe destruction of interface began at the neck of microscrew,and the further development was along the interface in depth. Both microscrews with peri-implantitis and the healthy controls showed the presence of TNF-α.Inflammation accumulation might trigger the up-regulation of TNF-α level,and the onset of inflammation would enhance the up-trend.

microscrew； peri-implantitis； tumor necrosis factor-α； peri-implant sulcular fluid

R 783.5

A

10.3969/j.issn.1000-1182.2011.01.005

1000－1182（2011）01－0017-04

2009-12-30；

2010-03-10

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81000463和10902075）；高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專(zhuān)項(xiàng)科研基金新教師類(lèi)基金資助項(xiàng)目（200955031-20006）

胡赟（1979—），男，四川人，主治醫(yī)師，博士

鄭雷蕾，Tel：15086986968