侯思名, 張薇, 翟書(shū)華, 岑曉江, 黃興奇 程在全*

（1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所，云南 昆明650205； 2.昆明學(xué)院 生命科學(xué)與技術(shù)系，云南 昆明650214；3.云南大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，云南 昆明 650091）

藥用野生稻（Oryza officinalisWatt.）是原產(chǎn)中國(guó)的3種特有的珍稀野生稻種質(zhì)資源之一，主要分布于云南、廣東、廣西、海南等地，蘊(yùn)含著栽培稻中所沒(méi)有的重要基因和豐富的遺傳多樣性。野生稻種類(lèi)多、遺傳資源豐富、抗逆性較強(qiáng)，是栽培稻遺傳改良和重要基因克隆的基礎(chǔ)[1-2]；而栽培稻種內(nèi)遺傳基礎(chǔ)狹窄，受現(xiàn)有親本遺傳基礎(chǔ)的限制，長(zhǎng)期反復(fù)使用類(lèi)似或相同的親本，使很多改良品種具有相同或相似的遺傳來(lái)源，容易造成遺傳上的單一性。

藥用野生稻屬CC基因組型（染色體數(shù)2n=24），與栽培稻AA基因組型差異較大。通過(guò)傳統(tǒng)的有性雜交方式轉(zhuǎn)移藥用野生稻的優(yōu)良性狀和基因，主要存在雜交不親和、雜交不育等生殖障礙及重組頻率低、不易存活等問(wèn)題。構(gòu)建藥用野生稻的基因組大分子文庫(kù)，開(kāi)展大片段轉(zhuǎn)化，可為野生稻優(yōu)良基因的發(fā)掘和利用提供新的技術(shù)手段。

構(gòu)建基因組DNA大分子文庫(kù)是基因克隆和基因組研究的基礎(chǔ)。新基因的克隆通常需要對(duì)候選克隆進(jìn)行基因功能互補(bǔ)試驗(yàn)，用第 2代載體 YAC、BAC 和 PAC 等構(gòu)建基因組文庫(kù)進(jìn)行目的基因的篩選，在獲得候選克隆后，要進(jìn)行亞克隆，對(duì)每個(gè)亞克隆逐一進(jìn)行基因功能互補(bǔ)試驗(yàn)，不僅工作量大，而且有遺漏目的基因的缺陷[3-5]。第 3代新型載體雙元細(xì)菌人工染色體（BIBAC）和 TAC （transformation- competentartificial hromosome），不僅能作為大片段基因組文庫(kù)的載體，而且能通過(guò)根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)將克隆片段直接導(dǎo)入植物基因組進(jìn)行功能互補(bǔ)試驗(yàn)，效率比較高。

云南藥用野生稻起源于云南，植株具有高度的可塑性，抗病能力強(qiáng)，稻米品質(zhì)優(yōu)良。筆者以云南藥用野生稻為材料，構(gòu)建了云南藥用野生稻基因組BIBAC文庫(kù)，使文庫(kù)中的藥用野生稻部分基因組及一些性狀（包括一些抗病基因）直接進(jìn)入水稻獲得一批轉(zhuǎn)基因植株，用以分析和分離藥用野生稻優(yōu)良性狀和基因，以期為拓寬栽培稻的遺傳基礎(chǔ)服務(wù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

藥用野生稻為孟定類(lèi)型，來(lái)源于云南耿馬孟定遮甸亞熱帶雨林區(qū)，種植于云南省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室溫室。

CIAP堿性磷酸酶、T4DNA ligase為Fermentas產(chǎn)品；NotI購(gòu)自寶生物公司；其他限制性?xún)?nèi)切酶購(gòu)自Fermentas公司。分子量標(biāo)準(zhǔn)Lambda Ladder PEG Marker（N0340S）購(gòu)自新西蘭BioLabas公司。農(nóng)桿菌C0R308、大腸桿菌DH10B為云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物所保存。克隆載體BIBAC2由美國(guó)Cornell大學(xué)贈(zèng)送。

1.2 方 法

取幼穗期幼嫩葉片提取藥用野生稻基因組DNA。

1.2.1 藥用野生稻目標(biāo)大片段的獲得

參照文獻(xiàn)[6]的方法，有改動(dòng)。

1.2.2 基因組DNA瓊脂糖塊的制備

參照文獻(xiàn)[6]的方法，有改動(dòng)。

1.2.3 瓊脂糖塊最佳部分酶切條件的摸索

主要考慮限制性?xún)?nèi)切酶的用量和酶切時(shí)間。分別用不同的酶濃度和不同的酶切時(shí)間進(jìn)行酶切預(yù)試驗(yàn)。

取上述瓊脂糖塊6個(gè)，每個(gè)瓊脂糖塊被切成均等的8小片，放入酶切平衡液中平衡后，轉(zhuǎn)到1.5 mL離心管中，每管放入16小片，加入150 μL的酶切消化液消化。

按照 1.0、2.0、5.0、12.0、15.0、30.0 u 的酶濃度單位加限制性?xún)?nèi)切酶BamHI?；靹蚝蟊戏胖? h，37 ℃，分別酶切15、20 、25 、30 、60 min。反應(yīng)完畢后立即加入 1/10體積的 0.5 mol/L的EDTA（pH 8.0）終止反應(yīng)。

用脈沖電泳分析酶切效果，選擇部分酶切后DNA片段大小集中在60～200 kb時(shí)的酶切濃度為最佳條件。

1.2.4 大片段DNA的部分酶切和目標(biāo)片段的回收

按照摸索的條件，用限制性?xún)?nèi)切酶大量酶切包埋于瓊脂糖塊中的基因組DNA。脈沖電泳回收透析袋中的DNA。

1.2.5 BIBAC2載體質(zhì)粒的大量提取與純化

BIBAC2載體質(zhì)粒按堿裂解法提取。先用CsCl-EtBr梯度平衡離心法純化閉環(huán)DNA質(zhì)粒，再用PEG沉淀法進(jìn)行第2次純化。BamHI完全酶切，酶切后用CIAP堿性磷酸酶去除磷酸。定量后等份分裝，貯存于－20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6 連 接

取回收的大片段DNA與BIBAC2載體進(jìn)行連接，載體與大片段在60 ℃下溫浴10 min，室溫冷卻15 min后，再加入T4DNA ligase。連接體系10 μL。連接產(chǎn)物脫鹽、濃縮。

1.2.7 電激轉(zhuǎn)化和陽(yáng)性菌落的保存

用大腸桿菌DH10B感受態(tài)細(xì)胞電激轉(zhuǎn)化，涂布于含50 mg/mL的卡那霉素和5%蔗糖的LB平板中，37 ℃，12～18 h。挑取陽(yáng)性克隆于384孔板中，－80 ℃保存。

1.2.8 BIBAC文庫(kù)的分析鑒定

1） 鑒定插入片段大小。從平板中隨機(jī)挑取 50個(gè)白色克隆，分別接種到1 mL 含50 mg/mL卡那霉素和5%蔗糖的LB培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜，用堿裂解法提取質(zhì)粒。提取的質(zhì)粒用NotI進(jìn)行酶切，37 ℃下，2～4 h，或過(guò)夜。65 ℃水浴10 min分離黏性末端。酶切片段用脈沖電泳分離，EB染色后，紫外燈下檢測(cè)插入的DNA片段的大小。

2） 檢測(cè)BIBAC克隆的穩(wěn)定性。隨機(jī)挑選出2個(gè)陽(yáng)性克隆，分別接種到含50 mg/mL卡那霉素和5%蔗糖的LB培養(yǎng)基中，37 ℃連續(xù)繼代培養(yǎng)5 d，用堿裂解法分別提取第0代和第100代BIBAC克隆的質(zhì)粒DNA。把第0代和第100代質(zhì)粒電轉(zhuǎn)到農(nóng)桿菌COR308中，28 ℃連續(xù)繼代培養(yǎng)10 d，再用堿裂解法分別提取第0代和第100代BIBAC2克隆的質(zhì)粒 DNA。所有第 0代和第 100代的質(zhì)粒都用BamHI 和HindIII進(jìn)行酶切，利用脈沖電泳檢測(cè)BIBAC克隆中外源DNA在大腸桿菌和農(nóng)桿菌繼代培養(yǎng)中的穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 藥用野生稻基因組DNA瓊脂糖塊的檢測(cè)

脈沖電泳檢測(cè)提取的基因組DNA。從圖1的結(jié)果看，所提取的基因組DNA滯后于分子量標(biāo)準(zhǔn)中最高條帶291.0 kb，表明DNA的相對(duì)分子質(zhì)量很大。出現(xiàn)一整齊條帶，且無(wú)降解現(xiàn)象，表明 DNA的質(zhì)量相對(duì)較好，能滿(mǎn)足后續(xù)試驗(yàn)的要求。

圖1 藥用野生稻基因組DNA的檢測(cè)圖譜Fig.1 Patterns of genome DNA of Oryza officinalis

2.2 大片段DNA的部分酶切檢測(cè)

藥用野生稻基因組DNA用BamHI在不同濃度和不同時(shí)間下進(jìn)行酶切，隨著酶濃度的增大和酶切時(shí)間的延長(zhǎng)，酶切后得到的片段越小。圖2顯示的是不同酶切時(shí)間和酶切濃度下的酶切電泳圖譜。其中1～4和5～8各為一組，酶切時(shí)間分別為30和25 min，泳道1和5的酶切濃度為1.0 U，2和6的酶切濃度為2.0 U，3和6的酶切濃度為5.0 U，4和8的酶切濃度為12.0 U。從圖中可看出，25 min 1.0 U時(shí)的酶切結(jié)果與預(yù)期的片段相近。

圖2 大片段DNA部分酶切圖譜Fig.2 Patterns of partial digestion genome DNA

2.3 BⅠBAC質(zhì)粒酶切檢測(cè)驗(yàn)證

質(zhì)粒經(jīng)過(guò)提取與純化后，分別用BamHI、SalI、EcoRI酶切檢測(cè)BIBAC載體的完整性。圖3結(jié)果表明，載體結(jié)構(gòu)完整，經(jīng)過(guò)處理的載體可以用于后續(xù)的文庫(kù)構(gòu)建。

圖3 BⅠBAC載體質(zhì)粒酶切驗(yàn)證Fig.3 Ⅰdentification of BⅠBAC vector

2.4 BⅠBAC克隆中插入片斷大小的鑒定

從LB平板中隨機(jī)挑取50個(gè)菌落，堿裂解法提取質(zhì)粒后進(jìn)行酶切鑒定，脈沖電泳估算插入片段的大小和檢測(cè)空載率。圖4是藥用野生稻BIBAC文庫(kù)插入片段的分布情況，從圖中可以看出，酶切片段大小以50～100 bp居多，在20～50 bp也集中了一定數(shù)量的酶切片段，與預(yù)期的用于構(gòu)建文庫(kù)的酶切片段大小接近。

圖4 BⅠBAC文庫(kù)插入片段的分布Fig.4 Size distribution of insert fragments in BⅠBAC library

2.5 BⅠBAC克隆的穩(wěn)定性檢測(cè)

比較2個(gè)隨機(jī)克隆在大腸桿菌和農(nóng)桿菌中的第0代和第100代的質(zhì)粒的酶切圖譜，結(jié)果顯示，各代中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)任何變化（圖5，圖6），表明藥用野生稻基因組DNA可以在BIBAC克隆中穩(wěn)定存在。

圖5 BⅠBAC克隆的BamHⅠ酶切檢測(cè)Fig.5 Stability detection of BⅠBAC clones digested with BamHⅠ

圖6 BⅠBAC克隆的Hind Ⅲ酶切檢測(cè)Fig.6 Stability detection of BⅠBAC clones digested with Hind Ⅲ

3 討 論

本研究所構(gòu)建的云南藥用野生稻BIBAC文庫(kù)，總克隆數(shù)為53 760個(gè)，保存在140塊384孔板中，至少覆蓋了5.86倍藥用野生稻基因組。

載體制備直接影響到文庫(kù)的構(gòu)建，只有高質(zhì)量的載體才可能有高效率的連接和高質(zhì)量的文庫(kù)[7]。大量粗提的載體會(huì)含有部分的細(xì)菌基因組DNA和線(xiàn)性化的質(zhì)粒DNA，通常采用CsCl-EtBr梯度平衡超離心法純化，可以得到高純度的超螺旋閉環(huán)質(zhì)粒DNA，最終獲得較高的連接效率和較低的空載率[8-13]。另外，在載體酶切后進(jìn)行脫磷處理，也可減少或避免空載體出現(xiàn)。本試驗(yàn)過(guò)程中大量粗提的載體質(zhì)粒單獨(dú)使用CsCl-EtBr梯度平衡離心法純化后，總有1段較小片段的DNA混雜其中，經(jīng)過(guò)連接后轉(zhuǎn)化效率不高，但在使用CsCl-EtBr梯度平衡離心法純化，輔助以PEG沉淀法純化載體質(zhì)粒后，小片段雜質(zhì)部分就不復(fù)存在了。說(shuō)明以上兩種方法聯(lián)合使用比單一用CsCl-EtBr梯度平衡離心法純化更能得到較好的質(zhì)粒載體，而且載體的連接效率高，每微升載體連接后可獲得3 000～4 000左右的克隆。

載體的酶切程度和去磷酸化處理的把握也很重要，載體的酶切要徹底但不能過(guò)度，酶切不徹底或過(guò)度都不能獲得較高的連接效率。另外，在對(duì)DNA的酶切過(guò)程中，筆者使用了較低濃度的限制性?xún)?nèi)切酶但用了稍長(zhǎng)的時(shí)間酶切，實(shí)際效果好于較高的酶濃度以較短時(shí)間的酶切。本試驗(yàn)中，獲得基因組DNA后沒(méi)有進(jìn)行脫鹽，但在酶切成大片段后進(jìn)行連接前脫鹽，同樣得到了較好的連接效果。

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英文編輯：易來(lái)賓