陳朝喜,朱恒乾,廖曉萍,劉雅紅*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院,廣東廣州510642;2.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,四川成都610041)

大腸埃希菌是一種重要的人獸共患病病原,研究發(fā)現(xiàn)大腸埃希菌能夠形成生物被膜來抵抗外界環(huán)境條件的改變,從而造成致病力的增強[1-3]。此外,生物被膜作為大腸埃希菌的毒力因子之一,在抗生素壓力下常常引起持續(xù)性感染的遷延不愈[4-6]。本研究通過優(yōu)化大腸埃希菌生物被膜體外模型,為研究大腸埃希菌生物被膜的耐藥機制提供基礎(chǔ)性的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 249株大腸埃希菌分離自廣東省畜禽養(yǎng)殖場和寵物醫(yī)院患病或死亡動物的糞便、腸道內(nèi)容物和臟器。標準株ATCC25922由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)藥理學(xué)實驗室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基、儀器和化學(xué)試劑 麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、MH肉湯、LB肉湯、蛋白胨大豆肉湯(TSB)、葡萄糖,為廣州環(huán)凱生物科技有限公司產(chǎn)品,結(jié)晶紫染色和快速銀染法試劑為廣州化學(xué)試劑廠產(chǎn)品,色氨酸定量試劑為Pharmacia公司產(chǎn)品,胎牛血清為Hyclone公司產(chǎn)品;掃描電子顯微鏡及樣品處理試劑均由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)測試中心提供。

1.2 方法

1.2.1 ATCC25922生物被膜形成試驗 參照文獻[7-8]的方法進行。每株菌接種4孔,同時做3次重復(fù),根據(jù)OD570/ODC比值確定其成膜能力表型。

1.2.2 快速銀染法及掃描電鏡鑒定大腸埃希菌生物被膜 參照李乃靜和何平等[9-10]的方法對生物被膜進行快速銀染鑒定。掃描電鏡樣品制備及圖像處理參照Glowacki R等方法進行[11],同時用滅菌硅膠片作空白對照。

1.2.3 細菌接種量對生物被膜形成的影響 取過夜培養(yǎng)的ATCC25922標準菌株菌液用TSB肉湯將菌液10倍比稀釋(10—1,10—2,10—3,10—4,10—5),分別取100 μ L稀釋菌液接種于48孔細胞培養(yǎng)板中,每個稀釋度的菌液接種4孔,然后每孔補加TSB肉湯至1 mL。37℃培養(yǎng)24 h后按照1.2.1進行分析統(tǒng)計。

1.2.4 培養(yǎng)條件對生物被膜形成的影響 分別將不同的組分按比例添加至TSB肉湯中,比較在TSB(弱堿性)(1組),TSB+50 mL/L胎牛血清(2組),TSB+10 g/L葡萄糖(3組),TSB(高滲透壓)(4組),LB(5組),MH(6組),TSB(厭氧)(7組)以及TSB肉湯(8組)等培養(yǎng)條件下ATCC25922 OD570的變化。

1.2.5 色氨酸定量試驗 參考文獻[12-13]的方法,分析不同培養(yǎng)條件下大腸埃希菌生物被膜胞外多糖蛋白復(fù)合物的含量變化。

1.2.6 大腸埃希菌浮游菌和生物被膜菌生長曲線的繪制 挑取ATCC25922單菌落接種TSB肉湯,置37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng),分別在0、2、4、8、12、16、24 h取樣,采用平板計數(shù)法計算菌落總數(shù),每個時間點3個重復(fù),繪制浮游菌生長曲線。生物被膜菌生長曲線的繪制按照優(yōu)化的體外模型條件進行,分別在第0、8、16、24、48、72、96、120、144、168 h時間點取3塊硅膠片,生理鹽水充分沖洗后放入加有1 mL MH肉湯的小試管內(nèi),150 W超聲水浴震蕩15 min～20 min,在4℃以6 000 r/min離心30 min,棄上清,用0.05 mol/L、pH 7.0的PBS調(diào)整菌液濃度,采用平板菌落計數(shù)法計數(shù),每個時間點3個重復(fù)。

1.2.7 大腸埃希菌生物被膜菌體外模型的應(yīng)用根據(jù)1.2.1～1.2.4中優(yōu)化的模型條件對249株臨床分離大腸埃希菌進行生物被膜鑒定,結(jié)合文獻[14]的方法進行成膜能力表型分析,以驗證大腸埃希菌生物被膜體外模型的適用性。

2 結(jié)果

2.1 大腸埃希菌的生物被膜快速銀染及掃描電鏡觀察

大腸埃希菌生物被膜是一種完全不同于浮游菌、有組織的特殊生理結(jié)構(gòu)(圖1)。

圖1 培養(yǎng)7 d的空白對照,銀染照片(400×)和掃描電鏡照片(6 400×)Fig.1 Negative control,silver staining picture(400×)and scanning electron microscope picture(6 400×)of E.coli on 7thday

2.2 細菌接種量對ATCC25922生物被膜形成的影響

從圖2可以看出,細菌接種量對大腸埃希菌生物被膜生物量的變化影響不明顯(P＞0.05)。

圖2 細菌接種量對ATCC25922生物被膜形成的影響Fig.2 Effect of different inoculum on ATCC25922 biofilm formation

2.3 培養(yǎng)條件對大腸埃希菌生物被膜形成和胞外多糖分泌量的影響

在不同培養(yǎng)條件下,各種條件均會對大腸埃希菌生物被膜的形成和胞外多糖的分泌量造成不同程度的影響(圖3和圖4),表明在生物被膜的形成過程中,受到各種培養(yǎng)條件的制約。

圖3 不同培養(yǎng)條件對ATCC25922生物被膜形成的影響Fig.3 Effect of different culture conditions on ATCC25922 biofilm formation

圖4 培養(yǎng)條件對不同成膜能力大腸埃希菌胞外多糖分泌量的影響Fig.4 Effect of culture conditions on exopolysaccharide secretion in different biofilm phenotype E.coli

2.4 浮游菌和BBF生長曲線的繪制

大腸埃希菌浮游菌在大約4 h開始進入對數(shù)生長期,約延續(xù)至12 h,之后進入穩(wěn)定期。而大腸埃希菌生物被膜菌有兩個對數(shù)增長期,其中第1個對數(shù)生長期對應(yīng)于生物被膜形成的黏附期,在此階段浮游菌黏附到硅膠片表面;在72 h～120 h進入第2個對數(shù)生長期,在此階段生物被膜中的活菌數(shù)又開始快速增長(圖5),胞外基質(zhì)的分泌量逐漸增多,直至第7天成熟的生物被膜形成,具有海綿狀等多形態(tài)的特殊生理結(jié)構(gòu)。

圖5 ATCC25922浮游菌(A)和生物被膜菌(B)生長曲線Fig.5 Growth curves of A TCC25922 planktonic bacteria(A)and biofilm bacteria(B)

2.5 不同來源大腸埃希菌生物被膜表型能力的鑒定結(jié)果

從249株臨床分離的大腸埃希菌生物被膜表型能力的散點圖可以看出(圖6),其成膜能力主要分布在中等和弱成膜能力兩種表型(OD570/ODC集中在2.0～4.0之間),而強成膜能力(OD570＞4ODC)和無成膜能力(OD570＜ODC)表型的菌株所占比例較小,與國外對水環(huán)境中大腸埃希菌成膜能力的表型研究的報道一致[15]。

圖6 249株臨床分離的大腸埃希菌生物被膜表型能力的散點圖Fig.6 Scatterplot of 249 clinical E.coli isolates in different biofilm phenoty pe

3 討論

3.1 改良結(jié)晶紫染色方法對生物被膜表型能力的鑒定分析

試驗結(jié)果表明,所采用的微量組織培養(yǎng)板法能夠?qū)υ囼灳甑纳锉荒ば纬赡芰M行準確測定,消除在判定成膜能力過程中的主觀性。Rodrigues L B等[16]研究結(jié)果表明,在微孔板定量方法中,采用的增加冰乙酸的脫色步驟能夠有效的對黏附在孔底和孔壁的染料進行脫色,避免在孔的氣液界面的干擾,實現(xiàn)對生物被膜形成能力進行較為全面和準確的定性和定量研究。根據(jù)優(yōu)化的模型條件能夠?qū)?49株臨床分離菌分為沒有黏附能力(—)、弱黏附能力(+)、中等黏附能力(++)和強黏附能力(+++)4種表型。

3.2 快速銀染法鑒定細菌生物被膜

試驗結(jié)果表明,在快速銀染的過程中,生物被膜經(jīng)氯化鈣飽和溶液處理后,清洗時間對硝酸銀著色影響較大。清洗的時間過短,不能夠?qū)⒐枘z片上過多黏附的氯化鈣去除,這樣在加入硝酸銀后,會在硅膠片的表面形成較多的白色沉淀,對硫代硫酸鈉透明處理過程中都會造成硅膠片上的生物被膜基質(zhì)大量脫落。清洗時間延長會造成實際銀染的胞外基質(zhì)的量減小,不能較好的反映生物被膜中包外基質(zhì)的相對量。

3.3 脫膜時間對生物被膜菌的影響

在不同生長階段,生物被膜外層藻酸鹽的厚度及緊密程度完全不同,其中的被膜菌對外界環(huán)境條件的抵抗能力也不一樣,因此超聲波脫膜時一定要考慮超聲波強度和超聲時間對生物被膜細菌的影響。本研究的脫膜條件能夠有效的將生物被膜完全從硅膠片上脫離下來,并且將生物被膜中的細菌最大程度地釋放出來,對保證生物被膜菌計數(shù)的準確性非常重要。

3.4 培養(yǎng)周期內(nèi)不同生物被膜表型胞外基質(zhì)分泌量的變化規(guī)律

同一株細菌在生長周期的不同階段,其胞外基質(zhì)的分泌量也表現(xiàn)出一定的規(guī)律性:第1天,根據(jù)大腸埃希菌胞外基質(zhì)的分泌量不同將其初步分為不同的表型。隨著培養(yǎng)時間的延長,不同表型的大腸埃希菌胞外基質(zhì)的分泌量也逐步增加,但不同表型的大腸埃希菌的包外基質(zhì)增加的幅度不同。在生物被膜達到成熟階段后(7 d),各表型的大腸埃希菌的胞外基質(zhì)分泌量也表現(xiàn)出相對穩(wěn)定。

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