劉慶霞，國(guó) 靜，閻秀峰

（東北林業(yè)大學(xué)鹽堿地生物資源環(huán)境研究中心，東北油田鹽堿植被恢復(fù)與重建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150040）

芥子油苷（Glucosinolates）是一類含氮、含硫的植物次生代謝產(chǎn)物，主要分布于十字花科植物，其降解產(chǎn)物異硫氰酸酯（Isothiocyanates）、硫氰酸酯（Thiocyanates）和腈類（Nitriles）等化合物在抵御病原微生物以及昆蟲(chóng)的取食等方面具有重要作用，用以介導(dǎo)植物與環(huán)境之間的相互作用[1-3]。研究表明，外源激素茉莉酸（Jasmonic acid）等不同程度地影響芥子油苷代謝并調(diào)節(jié)植物產(chǎn)生防御反應(yīng)以適應(yīng)逆境[4]，但有關(guān)茉莉酸信號(hào)調(diào)控芥子油苷代謝的規(guī)律及機(jī)制尚不十分清楚。

外源激素茉莉酸是影響芥子油苷合成的誘導(dǎo)因子[5-6]，可誘導(dǎo)一些植物體內(nèi)吲哚族芥子油苷、脂肪族芥子油苷和芳香族芥子油苷中一些組分含量增加，從而引起植物體內(nèi)總芥子油苷含量上升[7-8]。由于不同類型的芥子油苷代謝途徑存在差異，加之茉莉酸信號(hào)途徑中各位點(diǎn)對(duì)芥子油苷代謝途徑的調(diào)控又各不相同，因此芥子油苷的合成對(duì)茉莉酸的響應(yīng)非常復(fù)雜，其響應(yīng)規(guī)律尚不十分清楚。茉莉酸甲酯（Jasmonic acid methyl）是茉莉酸的甲基衍生物，在植物體內(nèi)可被茉莉酸甲酯酶（Jasmonic acid methyl esterase）催化生成茉莉酸[9]，在植物細(xì)胞間以及植物之間的通訊聯(lián)絡(luò)中起重要作用[10]，通常人們利用茉莉酸甲酯替代茉莉酸，以分析茉莉酸信號(hào)途徑[7,11]。研究表明，茉莉酸能夠誘導(dǎo)一些逆境應(yīng)答響應(yīng)基因的表達(dá)，如植物防衛(wèi)素基因PDF1.2，其表達(dá)受茉莉酸誘導(dǎo)，通常用作茉莉酸信號(hào)途徑的標(biāo)記基因[12]。本研究通過(guò)分析外源茉莉酸甲酯噴施處理后，擬南芥葉片中PDF1.2基因的表達(dá)量及芥子油苷各組分的含量，探討擬南芥芥子油苷各組分含量對(duì)外源茉莉酸的響應(yīng)規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 植物材料及生長(zhǎng)條件

試驗(yàn)所用擬南芥（Arabidopsis thaliana）為Columbia生態(tài)型，種子由中國(guó)科學(xué)院植物研究所惠贈(zèng)。種子消毒沖洗后，于4℃春化3～4 d，播種于盛有土壤與蛭石混合物（體積比1∶2） 的花盆中，在人工培養(yǎng)室中培養(yǎng)（溫度19～26℃，人工光照9 L/15 D，光子通量密度約 150μmol·m-2·s-1，空氣相對(duì)濕度50%～70%）。

1.2 茉莉酸甲酯處理

將茉莉酸甲酯（Sigma）溶于含乙醇（1.5%V/V）和 Triton-100（0.125%V/V）的水溶液[13]，配制成200μmol·L-1的茉莉酸甲酯溶液。選取生長(zhǎng)7周、長(zhǎng)勢(shì)一致的擬南芥幼苗（未抽薹）分為兩組，對(duì)其第九片和第十片蓮座葉進(jìn)行處理并取材，處理組用200μmol·L-1茉莉酸甲酯溶液噴施擬南芥蓮座葉，對(duì)照組用含乙醇（1.5%V/V）和 Triton-100（0.125%V/V）的水溶液進(jìn)行處理，處理0 h取材1次，而后每12 h取材1次，共采樣5次。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析

利用TRIzol試劑（Invitrogen Inc.）提取總RNA，使用DNAase（TaKaRa Inc.）對(duì) RNA中所含痕量基因組DNA進(jìn)行消化。使用NanoDrop 1000型（Nano-Drop Technologies Inc.）分光光度計(jì)檢測(cè)RNA純度及濃度。按照Transcriptor First Strand cDNA synthesis kit（TaKaRa Inc.）試劑盒說(shuō)明書(shū)合成cDNA第一鏈，去離子水稀釋10倍作為實(shí)時(shí)熒光定量PCR的模板。

按照TAIR數(shù)據(jù)庫(kù)（Eurogentec,Seraing,Belgium）提供的基因序列，使用Primer Express 2.x軟件（Applies Biosystems）設(shè)計(jì)基因的特異引物。PDF1.2基因的特異引物序列分別為5'TCATGGCT AAGTTTGCTTCC 3'和5'AATACACACGATTTAGC ACC 3'；以ACTIN基因作為內(nèi)參，其引物序列分別為:5'TCCAGGAATCGTTCACAGAA 3'和5'GCT ACAAAACAATGGGACTAAAA 3'。引物由上海生工有限公司合成。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)參照董曉麗等的方法[14]。反應(yīng)體系為25μL，其中SYBR Premix Ex TaqTM（2×）12.5μL，正向、反向引物（10μmol·L-1）各 1μL，cDNA 模板 2μL，超純水 8.5μL。實(shí)時(shí)熒光定量PCR在DNA Engine OpticonTM2（MJ Research Inc.）實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行。反應(yīng)程序?yàn)?95℃預(yù)變性30 s；95℃20 s，55℃20 s，72℃30 s，80℃ 1 s，讀板，45個(gè)循環(huán)。融解曲線分析:60～95℃，每0.5℃讀板1次（溫度恒定1 s后讀板）。每個(gè)樣品做3個(gè)重復(fù)。

1.4 芥子油苷的提取及測(cè)定

芥子油苷提取及測(cè)定按照Pang等方法[15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 PDF1.2基因表達(dá)對(duì)外源茉莉酸甲酯的響應(yīng)

PDF1.2基因編碼一種植物防衛(wèi)素，研究中通常將其作為茉莉酸信號(hào)途徑的標(biāo)記基因[13]，本研究通過(guò)測(cè)定擬南芥蓮座葉中PDF1.2基因的表達(dá)量來(lái)判斷外源茉莉酸甲酯處理信號(hào)是否傳導(dǎo)到植體內(nèi)并誘發(fā)茉莉酸信號(hào)反應(yīng)。以茉莉酸甲酯處理0 h的蓮座葉中PDF1.2基因的表達(dá)作為一個(gè)單位，對(duì)不同處理時(shí)間的葉片中該基因的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)定量PCR分析。

由圖1可以看出，茉莉酸甲酯處理后，蓮座葉中PDF1.2基因的表達(dá)顯著上調(diào)。在處理12 h，其表達(dá)量已上調(diào)至0 h的6.0倍；處理24 h時(shí)，PDF1.2基因表達(dá)量約為0 h的350倍，此時(shí)處理與對(duì)照中PDF1.2基因的表達(dá)量均達(dá)到最高值，茉莉酸甲酯處理的材料中PDF1.2基因表達(dá)量顯著高于對(duì)照（約為對(duì)照的2.8倍）；此后該基因表達(dá)水平急劇下降。這表明，外源茉莉酸甲酯能夠誘導(dǎo)依賴于茉莉酸的信號(hào)反應(yīng)，在12 h內(nèi)啟動(dòng)誘導(dǎo)，至24 h達(dá)到最高值。

圖1 擬南芥蓮座葉中PDF1.2基因的表達(dá)Fig.1 Expression of PDF1.2 gene in Arabidopsis thaliana rosette leaves

2.2 擬南芥蓮座葉芥子油苷總量對(duì)外源茉莉酸甲酯的響應(yīng)

從圖2可以看出，茉莉酸甲酯處理后，擬南芥蓮座葉中總芥子油苷、脂肪族芥子油苷以及吲哚族芥子油苷含量表現(xiàn)出相似的變化趨勢(shì)，均在24 h時(shí)達(dá)到最高值，與相應(yīng)對(duì)照相比顯著增加；此后含量開(kāi)始緩慢下降，但在36 h時(shí)其含量仍然顯著高于對(duì)照，至48 h，僅吲哚族芥子油苷的含量顯著高于對(duì)照（約為對(duì)照的1.1倍，P＜0.05），總芥子油苷和脂肪族芥子油苷的含量與對(duì)照相比沒(méi)有顯著差異，基本恢復(fù)至0 h的初始水平。表明茉莉酸甲酯能夠誘導(dǎo)吲哚族芥子油苷和脂肪族芥子油苷的合成。

2.3 擬南芥蓮座葉脂肪族芥子油苷含量對(duì)外源茉莉酸甲酯的響應(yīng)

如圖3所示，擬南芥蓮座葉中共檢測(cè)出9種脂肪族芥子油苷，茉莉酸甲酯處理后，除4-甲基亞磺酰丁基芥子油苷（4-methylsulphinylbutyl glucosinolate，4-MSOB）含量沒(méi)有顯著變化外，其余組分含量均有顯著變化。4-羥基丁基芥子油苷（4-hydroxybutyl glucosinolate，4-OHB）、5-甲基亞磺酰戊基芥子油苷（5-methylsulphinylpentyl glucosinolate，5-MSOP）、6-甲基亞磺酰己基芥子油苷（6-methylsulphinylhexyl glucosinolate，6-MSOH）變化趨勢(shì)基本相似，在處理24 h含量均達(dá)到最高值，分別為相應(yīng)對(duì)照的1.2倍、1.4倍、1.8倍；此后含量均顯著低于相應(yīng)的對(duì)照，并低于0 h的水平。3-甲基亞磺酰丙基芥子油苷（3-methylsulphinylpropyl glucosinolate，3-MSOP）和7-甲硫庚基芥子油苷（7-methylthioheptyl glucosinolate，7-MTH）的含量在處理24 h達(dá)到最高值，且與對(duì)照相比差異顯著；之后含量基本恢復(fù)到0 h的水平。8-甲硫辛基芥子油苷（8-methylthiooctyl glucosinolate，8-MTO）與 8-甲基亞磺酰辛基芥子油苷（8-methylsulphinyloctyl glucosinolate，8-MSOO）含量均在處理24 h達(dá)到最高值，且與對(duì)照相比差異顯著，均約為相應(yīng)對(duì)照的2.1倍，之后含量有所下降，但明顯高于對(duì)照。3-羥基丙基芥子油苷（3-hydroxylpropyl glucosinolate，3-OHP）含量的最高值出現(xiàn)較晚，在處理36 h達(dá)到最高值，為0 h的2.0倍。

圖2 擬南芥蓮座葉中總芥子油苷、脂肪族芥子油苷及吲哚族芥子油苷總量Fig.2 Content of total gluconsinolates,aliphatic and indolic gluconsinolates in Arabidopsis thaliana rosette leaves

圖3 擬南芥蓮座葉中脂肪族芥子油苷各組分含量Fig.3 Content of aliphatic glucosinolates in Arabidopsis thaliana rosette leaves

2.4 擬南芥蓮座葉吲哚族芥子油苷含量對(duì)外源茉莉酸甲酯的響應(yīng)

由圖4可知，擬南芥蓮座葉中共檢測(cè)出4種吲哚族芥子油苷。

茉莉酸甲酯處理后，吲哚基-3-甲基芥子油苷（Indol-3-yl-methyl glucosinolate，I3M）含量在12 h有所降低。1-甲氧吲哚基-3-甲基芥子油苷（1-methoxyindol-3-ylmethyl glucosinolate，1MT-I3M）經(jīng)茉莉酸甲酯處理后36 h內(nèi)含量持續(xù)增高，至36 h達(dá)到最高值，為0 h含量的2.1倍；在48 h含量降低，低于0 h的初始水平。4-羥基吲哚基-3-甲基芥子油苷（4-hrdroxyindol-3-ylmethyl glucosinolate，4OH-I3M）和4-甲氧吲哚基-3-甲基芥子油苷（4-methoxyindol-3-ylmethyl glucosinolate，4MT-I3M）的含量在處理24 h達(dá)到最高值，分別為0 h的2.0倍和1.5倍，與相應(yīng)的對(duì)照相比均差異顯著，在36 h含量降低，之后又出現(xiàn)上升的趨勢(shì)，與0 h初始含量相比均有顯著差異。

圖4 擬南芥蓮座葉中吲哚族芥子油苷各組分含量Fig.4 Content of indolic glucosinolates in Arabidopsis thaliana rosette leaves

3 討論

茉莉酸信號(hào)途徑標(biāo)記基因PDF1.2經(jīng)茉莉酸甲酯處理后表達(dá)量顯著上調(diào)，表明在噴施茉莉酸甲酯后，誘導(dǎo)了茉莉酸信號(hào)反應(yīng)，且在24 h誘導(dǎo)程度最為強(qiáng)烈。與此一致，脂肪族及吲哚族芥子油苷合成響應(yīng)茉莉酸甲酯的變化趨勢(shì)與PDF1.2基因表達(dá)的變化趨勢(shì)一致，含量均上調(diào)，且同樣在24 h達(dá)到最大值，表明吲哚族和脂肪族芥子油苷的合成均受外源茉莉酸甲酯誘導(dǎo)（見(jiàn)圖2）；脂肪族芥子油苷中除4-MSOB含量沒(méi)有明顯增加外，其余組分的含量與相應(yīng)對(duì)照相比均顯著增加；在吲哚族芥子油苷中除I3M外，其余組分的含量均明顯增加，這與前人的研究結(jié)果不同。Doughty等發(fā)現(xiàn)，甘藍(lán)型油菜經(jīng)不同濃度的茉莉酸甲酯處理后增加的組分幾乎全是吲哚族芥子油苷[7]。Mikkelsen等利用茉莉酸甲酯處理生長(zhǎng)6周的擬南芥蓮座葉，發(fā)現(xiàn)在檢測(cè)到的脂肪族芥子油苷各組分中只有5-MSOP、8-MTO、8-MSOO的含量顯著增加[11]。這表明不同物種以及同一物種不同發(fā)育時(shí)期，芥子油苷含量對(duì)茉莉酸的響應(yīng)能力是有差異的。

本研究表明，脂肪族芥子油苷和吲哚族芥子油苷含量對(duì)外源茉莉酸的響應(yīng)能力存在差異。脂肪族芥子油苷的含量在處理48 h已基本恢復(fù)至初始水平，而此時(shí)吲哚族芥子油苷的含量則高于初始水平，且與相應(yīng)的對(duì)照相比差異顯著。暗示這兩類芥子油苷合成途徑中的酶對(duì)茉莉酸信號(hào)的響應(yīng)是存在差異的。芥子油苷生物合成過(guò)程可分為氨基酸側(cè)鏈延長(zhǎng)、核心結(jié)構(gòu)合成和次級(jí)修飾3個(gè)階段[16]。其中，次級(jí)修飾階段因芥子油苷的種類而異。本研究結(jié)果表明，脂肪族（或吲哚族）芥子油苷的一些組分含量對(duì)茉莉酸具有特異的響應(yīng)規(guī)律（見(jiàn)圖3、4），暗示這些芥子油苷組分合成過(guò)程中參與次級(jí)修飾的酶對(duì)茉莉酸的響應(yīng)能力不同，并且同一種酶在不同處理時(shí)間對(duì)茉莉酸的響應(yīng)能力可能也有所不同。

4 結(jié)論

外源茉莉酸甲酯能夠誘導(dǎo)擬南芥蓮座葉中芥子油苷的合成。脂肪族芥子油苷除4-MSOB以外其余組分含量均受外源茉莉酸甲酯影響，吲哚族芥子油苷除I3M以外其余組分含量均受外源茉莉酸甲酯影響。這兩類芥子油苷中多數(shù)組分在茉莉酸甲酯處理24 h含量最高。

[1]陳亞州,閻秀峰.芥子油苷在植物-生物環(huán)境關(guān)系中的作用[J].生態(tài)學(xué)報(bào),2007,27(6):2584-2593.

[2]Yan X,Chen S.Regulation of plant glucosinolate metabolism[J].Planta,2007,226:1343-1352.

[3]喬世佳,李淑敏,孟令波.蕓薹屬植物對(duì)四種土傳病原微生物熏蒸效果的研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2010,41(5):19-24.

[4]Brader G,Tas E,Palva E T.Jasmonate-dependent induction of indole glucosinolates in Arabidopsis by culture filtrates of the nonspecific pathogen Erwinia carotovora[J].Plant Physiol,2001,126:849-860.

[5]Bodnaryk R P.Potent effect of jasmonates on indole glucosinolates in oilseed rape and mustard[J].Phytochemistry,1994,35(2):301-305.

[6]Smolen G,Bender J.Arabidopsis cytochrome P450 cyp83B1 mutations activate the tryptophan biosynthetic pathway[J].Genetics,2002,160:323-332.

[7]Doughty K J,Kiddle G A,Pye B J,et al.Selective induction of glucosinolates in oilseed rape leaves by methyl jasmonate[J].Phytochemistry,1995,38(2):347-350.

[8]Cipollini D F,Sipe M L.Jasmonic acid treatment andmammalian herbivory differentially affect chemical defenses and growth of wild mustard(Brassica kaber)[J].Chemoecology,2001,11:137-143.

[9]Thines B,Katsir L,Melotto M,et al.JAZ repressor proteins are targets of the SCFCOI1complex during jasmonate signaling[J].Nature,2007,448:661-666.

[10]Arimura G,Ozawa R,Shimoda T,et al.Herbivory-induced volatiles elicit defence genes in lima bean leaves[J].Nature,2000,406(6795):512-515.

[11]Mikkelsen M D,Petersen B L,Glawischnig E,et al.Modulation of CYP79 genes and glucosinolate profile in Arabidopsis by defence signaling pathways[J].Plant Physiol,2003,131:298-308.

[12]Brown R L,Kazan K,McGrath K C,et al.A role for the GCC-box in jasmonate-mediated activation of the PDF1.2 gene of Arabidopsis[J].Plant Physiol,2003,132:1020-1032.

[13]Mewis I,Appel H M,Schultz J C,et al.major signaling pathways modulate Arabidopsis glucosinolate accumulation and response to both phloem-feeding and chewing insects[J].Plant Physiol,2005,138:1149-1162.

[14]董曉麗,王加啟,卜登攀,等.免疫刺激后小鼠肝臟內(nèi)參基因穩(wěn)定性研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2009,40(5):80-85.

[15]Pang Q,Chen S,Li L,et al.Characterization of glucosinolate-myrosinase system in developing salt stress Thellungiella halophila[J].Physiol Plant,2009,136(1):1-9.

[16]鐘海秀,陳亞州,閻秀峰.植物芥子油苷代謝及其轉(zhuǎn)移[J].生物技術(shù)通報(bào),2007(3):44-48.