趙邦榮 張香改 齊娜娜 胡振華 馬靜

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)是一種體外擴增特異DNA片段的技術(shù)，具有特異性高、敏感性強、產(chǎn)率高、操作簡單、重復(fù)性好、快速、易自動化等突出優(yōu)點，在生命科學(xué)研究及相關(guān)諸多領(lǐng)域已經(jīng)得到了廣泛應(yīng)用。多重PCR是在一個反應(yīng)體系中使用多對引物，針對多個DNA模板或同一模板的不同區(qū)域進行擴增的過程，滿足同時分析不同DNA序列的需要，尤其是在臨床檢測和科學(xué)研究時，在一個反應(yīng)體系中能夠同時檢測多種目的DNA，這不僅能節(jié)省珍貴的實驗樣品，而且能使以往繁瑣的操作變得省時省力，具有高效快捷、高度特異敏感、實驗成本低等優(yōu)點，具有普通PCR方法不可比擬的優(yōu)越性。本研究采用Y染色體10對引物探討了基因組DNA的多重PCR反應(yīng)體系中各種因素對擴增結(jié)果的影響，優(yōu)化了反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，以期為應(yīng)用多重PCR反應(yīng)檢測Y染色體微缺失提供穩(wěn)定可靠的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 引物:檢索NCBI的UniSTS獲得10對Y染色體引物序列(sY14、sY67、sY129、sY133、sY145、sY150、sY152、sY153、sY157、sY254)，引物由上海生工合成，純化方法為 ULTRAPAGE。

1.1.2 2 ×Taq MasterMix:購自康為世紀(jì)，Taq polymerase 0.25 U/μl，終濃度為 1 × Taq PCR Buffer，1.5 mmol/L MgCl2，200 μmol/L dNTPmix。

1.1.3 DNA模板提取:血液基因組提取試劑盒購自康為世紀(jì)，按說明提取DNA。

1.2 方法:多重PCR擴增，產(chǎn)物3%瓊脂糖電泳，電壓80V，EB染色，凝膠成像系統(tǒng)拍照并保存圖像。

2 結(jié)果

2.1 反應(yīng)條件優(yōu)化

2.1.1 反應(yīng)體積:目前常用的多重PCR反應(yīng)體積有50、25、20、15、5 μl等。50 μl反應(yīng)體積較大，但較浪費實驗材料，5 μl反應(yīng)體積雖然較小，但加樣誤差相對增大，我們認(rèn)為20μl反應(yīng)體積較合適。圖1中1～4泳道為50μl反應(yīng)體積，5～8泳道為20μl反應(yīng)體積，兩者擴增效果無明顯差別。

圖1 不同反應(yīng)體積及是否預(yù)混PCR電泳圖

2.1.2 預(yù)混分裝引物:20μl反應(yīng)體積多重PCR每種引物只需加樣0.25～1μl，加樣誤差相對較大，可通過預(yù)混引物以減小誤差;一般臨床檢驗可能一次檢測標(biāo)本量少，以及為了方便實驗當(dāng)天的操作，可預(yù)先預(yù)混、分裝引物，于-20℃保存。圖1中第4、8泳道為預(yù)混分裝后經(jīng)-20℃保存的引物，第3、7泳道為實驗當(dāng)天加入的引物，兩者擴增效果無明顯差別。

2.1.3 退火溫度:首先對循環(huán)數(shù)、變性溫度、變性時間、延伸時間進行了摸索(限于篇幅，不做詳論)，然后對退火溫度進行了梯度摸索(圖2)，確定退火溫度為58℃，各引物均能很好的擴增出目的片段。最后確定反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性3 min，95℃30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，33 個循環(huán)，72℃延伸 10 min。

圖2 退火溫度梯度多重PCR電泳圖

2.2 反應(yīng)體系優(yōu)化

2.2.1 引物濃度和模板量的正交實驗:以模板和引物為實驗因素，取A、B、C三種水平，見表1。9組結(jié)果中第6組較好(圖3)，為0.125μmol/L引物濃度和25 ng模板量。

圖3 不同引物濃度和不同模板量多重PCR電泳圖

表1 正交實驗因素-水平表

2.2.2 引物濃度的調(diào)整:首先進行等濃度引物的多重PCR擴增，各目的條帶亮度不均(圖4)。因此按倍比關(guān)系降低亮帶引物濃度，增加暗帶引物濃度，從0.03125～0.25μmol/L，相差8倍，從而使條帶亮度趨于一致(圖5)。

圖4 等濃度引物多重PCR電泳圖

圖5 調(diào)整引物濃度多重PCR電泳圖

3 討論

自1988年Chamberlain等［1］首先使用多重PCR技術(shù)對人DMD進行檢測以來，多重PCR技術(shù)已被成功地應(yīng)用到了生物學(xué)的多個方面，如各類病原的檢測與鑒別、遺傳疾病診斷、以及基因缺失、突變和多態(tài)性分析、定量分析等。與常規(guī)PCR相比，多重PCR由于同時涉及到了多對引物，因而影響因素更多，可以分為反應(yīng)體系和反應(yīng)條件兩大類，因此，必須對反應(yīng)條件進行優(yōu)化。隨著多重PCR技術(shù)的進一步成熟及DNA提取試劑盒和混合Taq DNA聚合酶的商品化，操作變得更為簡便，只需加入引物、混合Taq DNA聚合酶及DNA模板即可，使得多重PCR技術(shù)用于臨床檢測和科學(xué)研究簡便易行。但與常規(guī)PCR相比，多重PCR由于同時涉及了多對引物，因而影響因素更多，如不同引物在反應(yīng)體系中的熱循環(huán)條件和退火溫度及延伸溫度、反應(yīng)緩沖液終濃度等。雖然 Henegariu等［2］通過對多重PCR中各種因素的大量組合、調(diào)整和優(yōu)化，以基因組DNA為模板，提出了一項較完整的多重PCR的操作方案和通用策略，但在實際應(yīng)用中仍然要對反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進行優(yōu)化。

引物的優(yōu)劣直接關(guān)系到PCR的特異性與靈敏度，可以檢索NCBI的UniSTS獲得引物序列或應(yīng)用各種軟件自行設(shè)計引物序列［3］。初次進行多重PCR反應(yīng)時，各種引物按相等的摩爾數(shù)添加是很有必要的，結(jié)果將會揭示哪些引物的濃度需要調(diào)整。過高的引物濃度易引起錯配，增加其非特異性擴增，還易形成引物二聚體，出現(xiàn)條帶彌散或拖尾現(xiàn)象;過低的引物濃度易造成擴增產(chǎn)物太少而使條帶過弱或消失。

目前多重PCR還存在一些普遍的問題，如某一特定片段的優(yōu)先擴增及容易形成引物二聚體等。影響多重PCR擴增效果的因素為反應(yīng)體系和反應(yīng)條件。

在反應(yīng)體系中主要影響因素有引物濃度、模板量、Taq酶用量、Mg2+濃度、dNTP濃度，可以用正交設(shè)計來優(yōu)化［4］。本實驗采用商品化的混合Taq酶(含Taq polymerase 0.25 U/μl，終濃度為1 × Taq PCR Buffer，1.5 mmol/L MgCl2，200 μmol/L dNTP mix)，只需對引物濃度和模板量進行優(yōu)化，采用三個水平，進行9次實驗即可。按2×Taq MasterMix操作說明加等量濃度引物進行多重PCR，以0.125μmol/L濃度引物及25 ng模板量最優(yōu)，但是擴增條帶亮度并非均一，即使在優(yōu)化了循環(huán)條件后，某些基因的擴增產(chǎn)物仍不明顯。由于引物之間存在競爭性抑制，造成同一管內(nèi)產(chǎn)物量不等，導(dǎo)致電泳條帶亮度相差較大，因此按倍比關(guān)系進一步調(diào)整了引物的濃度，即亮帶進一步降低引物濃度，暗帶則增加引物濃度，從0.03125～0.25μmol/L，相差8倍，擴增條帶亮度趨于一致。

反應(yīng)條件的影響因素有退火溫度、循環(huán)數(shù)、反應(yīng)體積等，但最主要的是退火溫度，退火溫度決定PCR特異性與產(chǎn)量。溫度高，特異性強，但過高則引物不能與模板牢固結(jié)合，DNA擴增效率下降;溫度低，產(chǎn)量高，但過低可造成引物與模板錯配，非特異性產(chǎn)物增加。一般可根據(jù)引物的(G+C)%含量進行推測，退火溫度Ta(annealing temperature)比擴增引物的融解溫度Tm(melting temperature)低5℃，可按公式進行計算:Ta=Tm-5℃ =4(G+C)+2(A+T)-5℃。但最好使用梯度PCR儀摸索最佳退火溫度，更方便、快捷、準(zhǔn)確。本實驗經(jīng)過梯度摸索，采用58℃30秒的退火溫度和時間，得到了理想的目的片段。

總之，可用梯度PCR儀優(yōu)化退火溫度，用正交設(shè)計優(yōu)化引物濃度和模板量，同時調(diào)整多重PCR反應(yīng)中各對引物之間的濃度差異，以優(yōu)化多重PCR的擴增效果。

1 Chamberlain JS，Gibbs RA，Ranier JE，et al.Deletion screening of the Duchennemuscular dystrophy locus viamultiplex DNA amplification.Nucleic Acids Res，1988，16:11141-11156.

2 Henegariu O，Heerema NA，Dlouhy SR，et al.Multiplex PCR:critical parameters and step-by-step protocol.Biotechniques，1997，23:504-511.

3 王穩(wěn)，屈武斌，申志勇，等.利用 MPprimer設(shè)計引物并優(yōu)化擴增條件以提高多重 PCR效率的實驗研究.生物化學(xué)與生物物理進展，2010，37:342-346.

4 趙宏宇，蔡祿，趙秀娟，等.應(yīng)用正交實驗法優(yōu)化DNA重復(fù)序列的PCR擴增體系.內(nèi)蒙古科技大學(xué)學(xué)報，2008，27:346-350.