崔 莉,朱戰(zhàn)波,朱洪偉,崔玉東,樸范澤

(1黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,黑龍江大慶,163319;2廣東溫氏食品集團(tuán)有限公司江蘇分公司;3黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科技學(xué)院)

金黃色葡萄球菌是奶牛乳房炎的重要致病菌之一,也是人類醫(yī)源感染的常見病原菌,多為耐甲氧西林金黃色葡萄球菌。傳統(tǒng)的抗生素療法引起了金黃色葡萄球菌對(duì)多種抗生素的拮抗[1],已不能有效治療由金黃色葡萄球菌引起的感染,尤其發(fā)現(xiàn)有些分離株甚至對(duì)新型的抗生素也產(chǎn)生了耐藥性[2],所以人們把研究的重點(diǎn)轉(zhuǎn)向疫苗方面。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展,基因工程疫苗的研究展示出良好的發(fā)展前景。國(guó)外一些學(xué)者對(duì)篩選疫苗靶向的方法進(jìn)行了深入的研究,Yukiko等[3]用反向遺傳學(xué)方法在 8株金黃色葡萄球菌的染色體組序列中檢測(cè)出 19種保守性表面蛋白,同時(shí)鑒定出 4種產(chǎn)生高度保護(hù)性免疫的蛋白:IsdA,IsdB,SdrD和 SdrE。用這 4種表面蛋白免疫小鼠,與其它 15種抗原相比,產(chǎn)生了最高的保護(hù)水平,這項(xiàng)鑒定在篩選疫苗候選抗原的研究中具有重要意義。

金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)需要鐵作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),感染時(shí)它可以與宿主血紅素相互作用而攝取鐵。金黃色葡萄球菌鐵調(diào)控表面決定子(Isd)是與鐵吸收相關(guān)的一個(gè)重要成分[4],該系統(tǒng)能結(jié)合機(jī)體的血紅蛋白,并使血紅蛋白通過細(xì)胞壁和細(xì)胞膜,在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)蓄積,一旦進(jìn)入細(xì)胞,血紅素的咔啉環(huán)會(huì)被酶降解掉,形成能被細(xì)菌用作營(yíng)養(yǎng)來源的自由鐵[5]。在 Isd基因座中,IsdB是唯一的完全暴露在細(xì)胞壁表面的蛋白,對(duì)金黃色葡萄球菌鐵的攝取具有重要作用。試驗(yàn)證明,金黃色葡萄球菌是通過 IsdB捕獲血紅蛋白,在 IsdB失活、而IsdA和IsdH沒有失活的突變株中,細(xì)菌細(xì)胞壁結(jié)合到的血紅蛋白就會(huì)減少,同時(shí)也就削弱了金黃色葡萄球菌利用血紅蛋白作為鐵來源的能力[6]。Kuklin等[7]根據(jù) IsdB在不同的金黃色葡萄球菌臨床株中均具有保守性這一特點(diǎn),將該蛋白制成疫苗免疫小鼠,結(jié)果獲得了高度的免疫,且在獼猴中也呈現(xiàn)出抗體效價(jià)的高水平增長(zhǎng)。因此,利用 IsdB的鐵結(jié)合機(jī)制來發(fā)展抗金黃色葡萄球菌疫苗具有廣闊的前景。筆者通過對(duì)編碼金黃色葡萄球菌 IsdB蛋白的基因進(jìn)行克隆,構(gòu)建原核表達(dá)載體,并在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá),旨在為進(jìn)一步研究其在奶牛乳房炎免疫預(yù)防中的作用及新型 DNA疫苗奠定分子理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及載體 奶牛乳房炎致病菌金黃色葡萄球菌 BMSA/855/23-1株,表達(dá)載體 pQE-30和受體菌 E.coli XL1-Blue均為本實(shí)驗(yàn)室保存;pMD18-T Vector System購(gòu)自大連寶生物工程有限公司。

1.1.2 酶和試劑 LA Taq DNA聚合酶及核酸分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自大連寶生物工程有限公司,限制性內(nèi)切酶和 T4 DNA連接酶以及低分子量蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)均購(gòu)自加拿大 MBI公司;DNA片段快速膠回收試劑盒購(gòu)自北京博大泰克生物基因技術(shù)有限責(zé)任公司;鼠金黃色葡萄球菌多克隆抗體由本實(shí)驗(yàn)室保存;辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠 IgG抗體購(gòu)自 NEB公司;其它試劑為 Sigma公司產(chǎn)品。

1.1.3 引物 根據(jù) GenBank中(登錄號(hào):BA000033)金黃色葡萄球菌的 isdB基因序列設(shè)計(jì)一對(duì) PCR擴(kuò)增特異性引物,在上游引物的 5′端加上一個(gè) Bam HI酶切位點(diǎn)(見下劃線)和 3個(gè)保護(hù)性堿基 CGG,下游引物的 5′端加上一個(gè) Sal I酶切位點(diǎn)和 2個(gè)保護(hù)性堿基 GC,即上游引物為 5′-CGGGGATCCATGAACAAACAGCAAAAAGA-3′,下游引物為 5′-GCGTCGACTTAGTTTTTACGTTTTCTAG-3′。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 金黃色葡萄球菌 DNA的提取 將金黃色葡萄球菌用液體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)后,離心,沉淀用葡萄球菌溶菌酶和蛋白酶 K處理,然后用酚、氯仿抽提提取金黃色葡萄球菌 DNA,方法詳見文獻(xiàn)[8]。

1.2.2 PCR擴(kuò)增、克隆及序列分析 用 LA Taq DNA聚合酶進(jìn)行 PCR擴(kuò)增,反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性 3 min后,94℃變性 1.5min,60℃退火 1min,72℃延伸 2 min,進(jìn)行 30個(gè)循環(huán),最后 72℃延伸 10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后,用DNA膠回收試劑盒回收目的片段。16℃過夜連接pMD18-T載體,次日轉(zhuǎn)化到 XL1-Blue感受態(tài)細(xì)胞并涂布于含有終質(zhì)量濃度 50 mg/L氨芐青霉素的 LB瓊脂平板上,置 37℃培養(yǎng)。隨機(jī)挑選幾個(gè)菌落,用堿裂解法粗提質(zhì)粒,并對(duì)其進(jìn)行 PCR和 Bam HI,Sal I雙酶切鑒定,篩選出的陽性菌送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定,預(yù)計(jì) IsdB片段大小約為1 938 bp,pMD18-T載體大小約為 2 692 bp,測(cè)序后對(duì)測(cè)序結(jié)果用 DNAStar軟件進(jìn)行序列分析。

1.2.3 重組蛋白原核表達(dá)載體的構(gòu)建 上述陽性質(zhì)粒命名為 pMD18-T-isdB,將該克隆質(zhì)粒和 pQE-30表達(dá)載體質(zhì)粒分別用Bam HI和 Sal I雙酶切,pQE-30表達(dá)載體片段大小約為 3 439 bp,回收目的基因片段和線狀表達(dá)載體。用 T4連接酶在 22℃條件下對(duì)目的基因片段和線狀表達(dá)載體進(jìn)行過夜連接,按 1.2.2的方法轉(zhuǎn)化和鑒定陽性克隆,并將陽性菌命名為 pQE-30-isdB。

1.2.4 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 將重組菌 pQE-30-isdB及空載體 pQE-30在含有 50mg/L氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)到 A600值達(dá)到 0.6時(shí),加入 IPTG至終濃度為 1mmol/L,進(jìn)行目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)。分別取誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后 3 h的重組菌,誘導(dǎo)后 3 h的空載體 1mL菌液,4℃離心收集菌體。沉淀菌體中加入 1×SDS上樣緩沖液 100μL,混勻后,沸水加熱 5min,10 000 g離心 10min后,取上清 10μL,按參考文獻(xiàn)[8]的方法進(jìn)行 SDS-PAGE分析。

1.2.5 estern blot分析 按照參考文獻(xiàn)[8]的方法以 BIO-RAD系統(tǒng)電轉(zhuǎn)移至 PVDF轉(zhuǎn)移膜上,用脫脂乳封閉后,依次加入鼠金黃色葡萄球菌多克隆抗體,辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠 IgG抗體,最后在聯(lián)苯胺(DAB)溶液中顯色,觀察結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 isdB基因擴(kuò)增、TA克隆及其序列分析

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析,結(jié)果顯示,獲得了全長(zhǎng)約為 1 938 bp的條帶,與預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物大小一致(圖 1)。對(duì)pMD18-T-isdB質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定,結(jié)果擴(kuò)增出與預(yù)計(jì)目的片段大小1 938 bp相符的條帶,將 PCR鑒定為陽性的質(zhì)粒用 Bam HI和 Sal I雙酶切鑒定,酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后,獲得預(yù)期大小的 2個(gè)目的基因片段(2 692 bp和 1 938 bp)(圖 2)。測(cè)序后,NCBIBlast分析顯示,該 DNA片段大小為 1 938 bp,與 GenBank中金黃色葡萄球菌株 MW 2的 isdB堿基序列的同源性為 98.6%。

2.2 重組蛋白原核表達(dá)載體的鑒定

對(duì) pQE-30-isdB質(zhì)粒進(jìn)行 PCR鑒定,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析,PCR鑒定結(jié)果為陽性,將該質(zhì)粒用Bam HI和 Sal I雙酶切得到 2個(gè)預(yù)期大小的片段(3 439 bp和 1 938 bp)(圖 3)。

3 討 論

金黃色葡萄球菌通過 IsdB蛋白介導(dǎo)鐵從宿主血紅蛋白轉(zhuǎn)移到細(xì)菌內(nèi),表現(xiàn)了 IsdB蛋白的一個(gè)重要的毒力作用。缺乏這種蛋白,金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的毒力卻會(huì)減少,該細(xì)菌在宿主組織中將無法正常復(fù)制和永久定居。有研究表明[6],當(dāng) IsdB與 AAHS(amorphous aluminum hydroxyphosphate sulfate)佐劑結(jié)合作為疫苗時(shí),具有高度的免疫原性,產(chǎn)生的特異性抗體對(duì)鼠模型中不同分離株的金黃色葡萄球菌感染具有穩(wěn)定及顯著的保護(hù)作用。因此,IsdB是一個(gè)良好的疫苗侯選抗原。

本次研究應(yīng)用基因工程方法成功地克隆了金黃色葡萄球菌包含了信號(hào)肽序列的全長(zhǎng) isdB基因,與報(bào)道的 isdB全長(zhǎng)基因序列比較,其核苷酸和氨基酸序列同源性都為 98.6%,同源性很高,存在的少量差異基因可能是菌株的特異性所致。由于大腸桿菌是當(dāng)前應(yīng)用較廣泛的原核表達(dá)體系,具有培養(yǎng)方法簡(jiǎn)單、快速、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn),所以在本次研究中選擇大腸桿菌來表達(dá)isdB基因。pQE-30載體能夠編碼 6個(gè)組氨酸殘基,外源基因經(jīng)多克隆位點(diǎn)插入后,可與 IsdB一起融合表達(dá),這樣有利于提高表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性,且融合蛋白經(jīng) Western blot試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)能和金黃色葡萄球菌的陽性血清發(fā)生反應(yīng),說明該目的蛋白具有金黃色葡萄球菌的抗原性,可作為亞單位疫苗的候選蛋白。

近年來,在奶牛乳房炎疫苗研究過程中,金黃色葡萄球菌基因工程疫苗已成為了國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn),如金黃色葡萄球菌的凝集因子 A,纖連蛋白結(jié)合蛋白,膠原結(jié)合蛋白,溶血毒素及腸毒素等均已被用作免疫抗原。isdB基因的克隆和 IsdB蛋白的成功獲得為今后進(jìn)一步研究 IsdB亞單位疫苗的免疫效力及金黃色葡萄球菌致病機(jī)制提供了有力的工具和研究基礎(chǔ),高度保守且免疫原性較強(qiáng)的 IsdB蛋白抗原可能作為基因工程疫苗的良好靶向,對(duì)臨床防治由金黃色葡萄球菌引起的感染將具有重要的意義。

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(責(zé)任編輯:朱寶昌)