楊 婷,侯文龍,牛少莉,劉曉敏,段志青,楊越冬

(河北科技師范學院理化學院,河北秦皇島,066004)

固定化酶是指被局限在某一特定區(qū)域上的、并且保留了它們的催化活力、可以反復、連續(xù)使用的酶。與游離酶相比,固定化酶具有下列優(yōu)點:固定化酶極易與底物、產(chǎn)物分開;可以在較長時間內進行反復分批反應和裝柱連續(xù)反應;在大多數(shù)情況下,能夠提高酶的穩(wěn)定性;酶反應過程能夠嚴格控制:產(chǎn)物溶液中沒有酶的殘留,簡化了提純工藝;較游離酶更適合于多酶反應;可以增加產(chǎn)物的收率,提高產(chǎn)物的質量;酶的使用效率提高,成本降低[1～7]。膠囊法固定化酶最接近自由酶的工作環(huán)境,能最大限度地保留酶的活性。在已有的膠囊法固定化酶技術中,利用聚陰離子電解質——海藻酸和聚陽離子電解質——殼聚糖、聚賴氨酸等間的靜電作用形成多電解質絡合物囊膜實現(xiàn)酶固定化的報道非常多[8～12]。羧甲基纖維素是非常廉價的聚陰離子電解質,也可與殼聚糖、聚賴氨酸等聚陽離子電解質形成多電解質絡合膜實現(xiàn)酶的固定化,但以羧甲基纖維素和殼聚糖為原料進行膠囊法固定酶的研究未見報道。本試驗以殼聚糖和羧甲基纖維素為原料制備羧甲基纖維素-殼聚糖膠囊并用其固定蔗糖酶,考察羧甲基纖維素-殼聚糖膠囊固定化蔗糖酶的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料和藥品

酵母;羧甲基纖維素鈉(化學純);殼聚糖(自制,脫乙酰度大于 80%);冰醋酸(分析純);無水乙醇(分析純);十二烷基硫酸鈉(SDS);葡萄糖(分析純);氫氧化鈉(分析純);3,5-二硝基水楊酸(化學純);蔗糖(分析純);醋酸鈉(分析純);丙三醇(分析純)等。

1.2 試驗方法

1.2.1 羧甲基纖維素-殼聚糖膠囊的制備 用 6號注射器的針頭將殼聚糖溶液滴入到 100mL的 CMC溶液中,硬化24 h后濾出,用 pH 4.6醋酸緩沖溶液洗滌后得羧甲基纖維素-殼聚糖膠囊。實驗中重點考察殼聚糖濃度、CMC濃度、硬化時間、固定化溫度對膠囊形成效果的影響。

1.2.2 蔗糖酶的制備 SDS(十二烷基硫酸鈉)抽提法[13]。稱取酵母 10 g,加入 60 mL 0.3mmol/L的SDS溶解,40℃水浴 12 h后取出,4℃,12 000 r/min離心 15min,上清液即為粗制酶液。在粗制酶液中加入乙醇使其質量分數(shù)達 0.30,4℃放置過夜,然后在 4℃下 12 000 r/min離心 15min,取上清液,追加乙醇使其終質量分數(shù)達 0.50,4℃放置 1 h,在 4℃下 12 000 r/min離心 15m in,棄上清液,沉淀分為兩部分,一部分干燥后測定沉淀中粗酶含量;另一部分用 pH 4.6醋酸緩沖溶液配制成含粗酶 0.3%的酶液,4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 羧甲基纖維素-殼聚糖膠囊固定化蔗糖酶的制備 取 1.2.2制備的粗酶液與 10.0 mL質量分數(shù)為 0.02的殼聚糖溶液充分混合,按 1.2.1相同的方法制備羧甲基纖維素-殼聚糖膠囊固定化蔗糖酶。固定化蔗糖酶在 pH 4.6的醋酸緩沖溶液中,4℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 羧甲基纖維素-殼聚糖膠囊的表征 ①羧甲基纖維素-殼聚糖膠囊形貌觀察:將膠囊用刀片切開后平鋪在載玻片上晾干,用 SEM觀察膠囊表面形貌。②膠囊強度的測定:將膠囊置于離心管中,在 3 000轉/min離心 30 min后觀察膠囊的破碎或保持完整性情況來表征膠囊的膜強度。

1.2.5 酶和固定化酶活性的測定 以煮沸酶液作對照,以 1m in內催化釋放 1μmol還原糖的酶量為 1個酶活單位(U)。取 2.0mL粗酶液與 2.0m L蔗糖溶液(0.2 g/L,pH 4.6醋酸溶液)混合均勻,于 37℃反應 15 min。用 DNS法測定反應液中還原糖的量[13～14]。固定化酶酶活測定同游離酶。取適量固定化酶與底物混合,均勻震蕩 15min后,取上清液用 DNS法測反應液中還原糖的量。試驗中重點考察緩沖溶液的 pH值、反應溫度對游離酶和固化酶活性的影響。

游離酶和固定化酶的米氏常數(shù)通過 Lineweaver-Burk作圖法(即雙倒數(shù)作圖法)測定。以 1/V對 1/[S]作圖,根據(jù)直線在橫軸上的截距(-1/Km)求出米氏常數(shù) Km。

2 結果與分析

2.1 膠囊形貌

膠囊的形貌表面的微細結構見圖1。從圖 1可以看出,羧甲基纖維素-殼聚糖膠囊球形規(guī)整,分散性好,粒徑均在 3mm左右(左上角 a為膠囊照片)。SEM觀察可以看出,膠囊表面較均勻地分布許多孔徑在 100～300 nm的微孔,這是反應底物和產(chǎn)物能有效遷移通過囊膜的基礎。

2.2 影響膠囊形成的因素

2.2.1 殼聚糖和羧甲基纖維素濃度對膠囊形成的影響 將殼聚糖溶液和羧甲基纖維素溶液按不同的濃度組合制備膠囊,固化 24 h后觀察成球情況;再經(jīng) 3 000 r/m in離心半小時。當殼聚糖的質量分數(shù)為0.02,CMC的質量分數(shù)為 0.015時,制得的膠囊其成球性好,球形規(guī)則,機械強度最好,高于或低于此濃度時均不能得到理想的膠囊。

2.2.2 固定化時間對成球效果的影響 以質量分數(shù)為 0.02的殼聚糖溶液,質量分數(shù)為 0.015的 CMC溶液制備膠囊,在室溫下固化不同時間,經(jīng) 3 000 r/min離心半小時后觀察膠囊的變形情況。試驗中發(fā)現(xiàn),隨著固化時間的延長,囊膜強度逐漸增強,固定化時間為 24 h后的囊膜強度基本不再變化,處理過程中不再有皺縮或粘連的現(xiàn)象。

2.3 固定化酶的性質

2.3.1 pH值對固定化酶活性的影響 蔗糖酶在 pH 4.6時活性最大,試驗中為考察固定化酶的耐酸堿性能,分別將游離酶和固定化酶在任意 pH值時的活性與各自在 pH 4.6時活性的比值的變化來表征游離酶或固定化酶活性受酸堿度的影響,測試溫度 40℃(圖2)。由圖 2可知,游離蔗糖酶在 pH 4.6～5.0范圍內活性最高,偏離這一 pH值范圍其活性快速下降;當體系的 pH 5.5時游離蔗糖酶的活性僅為最高時的 18%,當 pH 3.6時其活性為最高時的 63%。而殼聚糖 -羧甲基纖維素膠囊固定化蔗糖酶的活性在 pH 4.6的偏酸性范圍內隨酸度增加,活性只是略有減低。當 pH值高于 5.0后固定化酶的活性才明顯降低,但其幅度也明顯低于游離酶,說明蔗糖酶固定化后其耐酸堿性能明顯提高。

2.3.2 固定化酶的最適溫度 體系的 pH 4.6時,蔗糖酶在 50℃表現(xiàn)出最高的催化活性。游離蔗糖酶和羧甲基纖維素-殼聚糖膠囊固定化蔗糖酶在不同溫度時相對于各自在 50℃的活性如圖 3所示。在低于 50℃時,體系的溫度變化對游離蔗糖酶和固定化蔗糖酶的活性影響基本相同;高于 50℃時,隨體系溫度升高,游離酶的失活作用明顯快于固定化酶,可見經(jīng)羧甲基纖維素-殼聚糖膠囊包封后的蔗糖酶耐熱性能有明顯提高。

2.3.3 米氏常數(shù)(Km)與最大反應速度 分別以不同濃度蔗糖溶液在 37℃,pH 4.6下測定酶活力,以1 min時測定的酶活力代表酶促反應初速度,按 Lineweaver-Burk作圖法作圖(圖 4)。根據(jù)直線在橫軸上的截距(-1/Km)求出固定化酶的米氏常數(shù)(Km=54.11 mmol/L)較游離酶(Km=35.62mmol/L)大。這說明固定化酶對底物的親和力相對較小,這與囊膜對底物和產(chǎn)物的擴散限制有關。也正是基于此原因,試驗中固定化酶中還原糖的最大反應速度為 10.82mg/(m L·min),低于游離酶中的還原糖 Vmax=12.72 mg/(mL· min)。

圖 1 羧甲基纖維素-殼聚糖膠囊表面的 SEM照片

圖 2 pH值對游離酶和固定化酶活力的影響

圖 3 溫度對游離酶和固定化酶活力的影響

圖 4 底物濃度與速率的關系

3 結 論

羧甲基纖維素-殼聚糖膠囊固定蔗糖酶耐酸性、耐熱性明顯增強,固定化酶的米氏常數(shù)(Km=54.11 mmol/L)大于游離酶的米氏常數(shù)(Km=35.62mmol/L);制備固定化酶的最佳工藝為:將酶溶于質量分數(shù)為 0.02的殼聚糖溶液中,滴入質量分數(shù)為 0.015的羧甲基纖維素溶液中固化 24 h。

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(責任編輯:石瑞珍)