蔣麗娜，楊新玲，劉 華，葛麗平，孫 黎，翟登高

（1．河北北方學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗學(xué)院免疫學(xué)教研室，河北 張家口075000；2．河北北方學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗學(xué)院微生物學(xué)教研室，河北 張家口075000；3．河北北方學(xué)院生命科學(xué)研究中心，河北 張家口075000；4．河北北方學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)教研室，河北 張家口075000）

白細(xì)胞介素－12（IL－12）是主要由巨噬細(xì)胞等抗原提呈細(xì)胞產(chǎn)生的異二聚體細(xì)胞因子，是免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵調(diào)控分子，具有多重抗腫瘤生物活性，不僅對腫瘤有直接的抑制作用，而且可以調(diào)節(jié)機(jī)體免疫系統(tǒng)使其處于有效發(fā)揮抗腫瘤作用的細(xì)胞免疫應(yīng)答狀態(tài)［1］．該研究對小鼠S180實體瘤模型采用IL－12進(jìn)行免疫治療，通過T細(xì)胞亞群測定、瘤體組織學(xué)觀察，從細(xì)胞免疫的角度分析IL－12抗腫瘤作用的機(jī)制．

1 材料與方法

1．1 材 料

1．1．1 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基為美國Gibco公司產(chǎn)品．藻紅蛋白 （phycoerythrin，PE）標(biāo)記的大鼠抗小鼠CD4單克隆抗體、異硫氰酸熒光素 （fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）標(biāo)記的大鼠抗小鼠CD3單克隆抗體、別藻青蛋白 （APC）標(biāo)記的大鼠抗小鼠CD8單克隆抗體及鼠源重組IL－12試劑購自深圳晶美生物有限公司，其它試劑均為分析純．

1．1．2 動物 6～8周齡Ba LB／c系小鼠，18～20 g，雌性，由河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供．

1．1．3 細(xì)胞株 S180細(xì)胞株由河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物部提供．

1．2 方 法

1．2．1 動物模型的建立 于Ba LB／c小鼠左后肢皮下接種1×107個S180瘤細(xì)胞，荷瘤成功后，開始抑瘤實驗．

1．2．2 實驗分組和給藥 將40只荷瘤成功的小鼠隨機(jī)分為生理鹽水 （對照組）和0．5 ng／m L IL－12治療組，每組為20只．于荷瘤第7、14、21天每只小鼠瘤旁注射生理鹽水0．2 m L、0．5 ng／m L IL－12 0．2 m L．

1．2．3 抑瘤率和瘤指數(shù)的檢測 末次治療一星期后，各組動物同時全部處死，剝離瘤體稱重，計算抑瘤率和瘤指數(shù)．

1．2．4 外周血中T淋巴細(xì)胞亞群的檢測 將各組小鼠摘取的眼球抗凝血采用直接免疫熒光－流式細(xì)胞術(shù)，測定外周血中CD3＋T、CD4＋T細(xì)胞和CD8＋T細(xì)胞的百分率，計算CD4＋／CD8＋比值．

1．2．5 形態(tài)學(xué)檢查 將腫瘤組織用10%甲醛進(jìn)行固定，留作光學(xué)顯微鏡觀察形態(tài)學(xué)并拍照．

1．2．6 觀察指標(biāo) 動物的一般情況及腫瘤生長狀況的觀察：每日觀察小鼠的飲食、毛色、活動等一般狀況；開始抑瘤實驗的同時，定期 （每隔3天）用游標(biāo)卡尺測量腫瘤大小，以0．5× （長＋寬）表示［2］；并每日測量記錄每只小鼠的體重．

1．3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2．1 小鼠的一般情況觀察

自第14日后，生理鹽水組小鼠一般狀況變差，逐漸出現(xiàn)精神萎靡、行動遲緩、毛發(fā)干澀；而同期的IL－12組小鼠一般狀況明顯優(yōu)于生理鹽水組小鼠，精神一直很好，行動比較敏捷，毛發(fā)油亮．

2．2 IL－12對小鼠S180移植腫瘤生長的動態(tài)影響

各組小鼠在接種腫瘤細(xì)胞第7天左右開始觸摸到瘤塊，對照組的腫瘤生長速度快．第14天，IL－12組的腫瘤大小達(dá)到 （7．56±0．09）mm，此后逐漸縮小，到第27天時，腫瘤大小為 （5．12±1．56）mm，明顯小于生理鹽水組 （15．34±3．18）mm （P＜0．01）（見圖1）．

結(jié)果顯示，應(yīng)用IL－12有顯著的抗腫瘤效果，腫瘤生長受到明顯抑制．實驗過程中發(fā)現(xiàn)有的小鼠腫瘤局部有明顯炎癥反應(yīng)，瘤組織出現(xiàn)壞死，癌腫向下凹陷，最后腫瘤組織變硬、結(jié)痂而脫落，甚至出現(xiàn)腫瘤消退現(xiàn)象．

2．3 各組小鼠抑瘤率和瘤指數(shù)的比較

IL－12實驗組的抑瘤率為 （31．85±7．24）%，見表1．

生理鹽水組小鼠瘤指數(shù)為 （7．67±0．67），IL－12組的小鼠瘤指數(shù)為 （3．95±0．49），明顯低于生理鹽水組 （P＜0．01）（見表1）．

圖1 小鼠S180移植腫瘤生長趨勢

表1 各組荷瘤小鼠的瘤指數(shù)和抑瘤率的變化比較

2．4 荷瘤小鼠外周血中T細(xì)胞亞群的變化

從表2、圖 （2、3）可見，不論是生理鹽水組還是IL－12組的小鼠外周血中CD3＋、CD4＋、CD8＋T細(xì)胞均低于正常小鼠，說明小鼠荷瘤后機(jī)體的免疫功能均下降．采用IL－12治療后，上述指標(biāo)均高于生理鹽水組 （P＜0．05），CD4＋／CD8＋比值也上升，說明通過治療，荷瘤小鼠的免疫功能得到改善．

表2 荷瘤小鼠和正常小鼠血液中T細(xì)胞亞群百分率表達(dá)的比較 ±s）

表2 荷瘤小鼠和正常小鼠血液中T細(xì)胞亞群百分率表達(dá)的比較 ±s）

注：＊與生理鹽水組相比P＜0．05

組別 n CD3＋ CD4＋ CD8＋ CD4＋／CD8＋正常小鼠 10 68．00±7．07 45．70±5．50 25．00±2．97 1．82±0．2．73±0．30 18生理鹽水組 20 40．86±4．20 28．68±4．13 11．96±1．02 2．41±0．42 IL－12組 20 55．12±6．63＊ 39．65±5．08＊ 14．53±1．73＊

圖2 流式細(xì)胞儀分析T細(xì)胞亞群結(jié)果 （對照組）

圖3 流式細(xì)胞儀分析T細(xì)胞亞群結(jié)果 （IL－12組）

2．5 腫瘤細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察

2．5．1 生理鹽水組小鼠腫瘤細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察：腫瘤細(xì)胞密集成團(tuán)，大小不等，核仁大、明顯，核內(nèi)異染色質(zhì)少，胞質(zhì)深淺不等 （見圖4）．

圖4 生理鹽水組小鼠腫瘤細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 （HE×400，↑腫瘤細(xì)胞）

2．5．2 IL－12組小鼠腫瘤細(xì)胞觀察：核固縮，細(xì)胞碎片多，出現(xiàn)大片壞死，但淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞少見（見圖5）．

圖5 IL－12組小鼠腫瘤細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 （HE×400，↑細(xì)胞壞死）

3 討 論

在眾多刺激對抗腫瘤抗原的有效免疫應(yīng)答的策略中，用適當(dāng)?shù)拿庖咦魟┘訌?qiáng)抗原的免疫原性是其中之一．最近，IL－12已被確定為多種傳染病疫苗接種模型的強(qiáng)有力佐劑．無論局部或全身給予IL－12或IL－12基因轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞疫苗，在動物的腫瘤疫苗研究中均獲得可喜成果．以人類為研究對象的實驗數(shù)據(jù)清楚地表明，IL－12能夠增強(qiáng)腫瘤特異性細(xì)胞反應(yīng)［3］．

IL－12抗腫瘤效應(yīng)涉及固有免疫和適應(yīng)性免疫效應(yīng)機(jī)理．IL－12誘導(dǎo)的IFN－γ和其它二級、三級前炎癥細(xì)胞因子級聯(lián)效應(yīng)對腫瘤細(xì)胞有直接毒性作用，或者可以激活有效的抗血管生成機(jī)制［4］．在本次研究中，采用鼠源重組IL－12瘤旁皮下注射，觀察其對荷瘤小鼠的治療效果．結(jié)果顯示，IL－12具有良好的抗腫瘤效果，能誘導(dǎo)荷瘤小鼠體內(nèi)明顯的免疫應(yīng)答．

Kanagawa等研究表明，在IL－12無效的小鼠Meth－A腫瘤模型局部注射IL－12能夠引起對腫瘤細(xì)胞的局部和系統(tǒng)免疫應(yīng)答，并誘導(dǎo)機(jī)體免疫應(yīng)答和改變腫瘤微環(huán)境的協(xié)調(diào)效應(yīng)，而改變腫瘤微環(huán)境可以增強(qiáng)淋巴細(xì)胞浸潤，導(dǎo)致抗腫瘤效應(yīng)［5］．本實驗結(jié)果顯示，荷瘤小鼠外周血中CD3＋T、CD4＋T、CD8＋T細(xì)胞所占百分比均顯著低于正常小鼠 （P＜0．01），說明荷瘤小鼠不論是治療組還是生理鹽水組其機(jī)體免疫功能低于正常小鼠．采用IL－12進(jìn)行免疫治療后，外周血中CD3＋T、CD4＋T、CD8＋T細(xì)胞所占百分比均較生理鹽水組有顯著提高 （P＜0．05），提示IL－12治療對惡性腫瘤小鼠體內(nèi)的細(xì)胞免疫能力有恢復(fù)作用，使機(jī)體的免疫功能有明顯的改善．一般認(rèn)為，CD8＋T細(xì)胞在殺傷腫瘤細(xì)胞中起主要作用，CD4＋T細(xì)胞在腫瘤免疫中起重要的輔助作用，而CD4＋／CD8＋的比值的大小直接反映出機(jī)體細(xì)胞免疫的功能強(qiáng)弱［6，7］．本實驗發(fā)現(xiàn)IL－12治療組的CD4＋／CD8＋的比值高于生理鹽水組 （P＜0．01），這提示小鼠的機(jī)體可能通過增強(qiáng)細(xì)胞免疫功能來實現(xiàn)抗腫瘤的．體內(nèi)和體外研究揭示，IL－12能夠快速改變腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞和腫瘤浸潤巨噬細(xì)胞的功能［8］．本實驗發(fā)現(xiàn)，生理鹽水組的腫瘤組織，腫瘤細(xì)胞密集成團(tuán)，核仁大、明顯，大小不一，具有核分裂像；IL－12治療小鼠的腫瘤組織中可見大片腫瘤細(xì)胞壞死，但很少見到炎性細(xì)胞，但可見到核固縮、核碎裂和許多細(xì)胞碎片，提示IL－12可能通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來實現(xiàn)抗腫瘤的作用．

本實驗結(jié)果表明IL－12在體內(nèi)具有良好的抗腫瘤作用，經(jīng)其治療后，細(xì)胞免疫方面的指標(biāo) （CD3＋T、CD4＋T、CD8＋T、CD4＋／CD8＋）均得到明顯改善，提高了細(xì)胞免疫功能，因此認(rèn)為IL－12的抗腫瘤作用主要是通過調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能來實現(xiàn)的．Cao等研究揭示IFN－γ信號轉(zhuǎn)導(dǎo)直接引起Treg細(xì)胞周期停滯，IL－12——IFN－γ軸能夠抑制腫瘤誘導(dǎo)的Treg細(xì)胞增殖，這一機(jī)制可以抵消體內(nèi)Treg細(xì)胞促進(jìn)腫瘤生長的能力［9］．我們課題組將通過進(jìn)一步檢測Treg細(xì)胞及血清中IFN－γ、IL－2等深入研究IL－12的抗腫瘤機(jī)制．

［1］ Kilinc MO，Aulakh KS，Nair RE，et al．Reversing tumor immune suppression with intratumoral IL－12：Activation of tumor－associated T effector／memory cells，induction of T suppressor apotosis，and infiltration of CD8＋T effedctors［J］．J Immunol，2006，177 （10）：6962－6973

［2］ 張建華，趙德礦，王青青，等．IL－12基因聯(lián)合CD40L基因治療小鼠黑色素瘤的實驗研究 ［J］．中國免疫學(xué)雜志，2007，23 （05）：426－429

［3］ Portielje JE，Gratama JW，van Ojik HH，et al．IL－12：a promising adjuvant for cancer vaccination ［J］．Cancer Immunol Immun，2003，52 （03）：133－44

［4］ Colombo MP，Trinchieri G．Interleukin－12 in anti－tumor immunity and immunotherapy ［J］．Cytokine Growth Factor Rev．2002，13 （02）：155－68

［5］ Kanagawa N，Gao JQ，Motomura Y，et al．Anti－tumor mechanism of intratumoral injection with IL－12－expressing adenoviral vector against IL－12－unresponsive tumor ［J］．Biochem Biophys Res Commun，2008，372 （04）：821－825

［6］ Wang S，Zheng Z，Weng Y，et al．Angiogenesis and anti－angiogenesis activity of Chinese medical herbal extracts ［J］．Life Sci，2004，74 （20）：2467－2478

［7］ Waldmann TA．Effective cancer therapy through immunomodulation ［J］．Annu Rev Med，2006，57：65－81

［8］ Watkins SK，Egilmez NK，Suttles J，et al．IL－12 rapidly alters the functional profile of tumor－associated and tumor－infiltrating macrophages in vitro and in vivo ［J］．J Immunol，2007，178 （03）：1357－62

［9］ Cao X，Leonard K，Collins LI，et al．Interleukin 12 stimulates IFN－gamma－mediated inhibition of tumor－induced regulatory T－cell proliferation and enhances tumor clearance ［J］．Cancer Res，2009，69 （22）：8700－8709