呂衛(wèi)東 張平安

特異性免疫玻片法在外周血T淋巴細胞亞群檢測中的應(yīng)用

呂衛(wèi)東1張平安2

本文2010-07-06收到,2010-10-25接受

目前,T淋巴細胞亞群(CD3+、CD4+和CD 8+)的檢測是觀察機體細胞免疫功能的重要指標[1]。流式細胞術(shù)作為 CD3+、CD4+和CD8+T細胞檢測的標準方法,由于儀器及配套檢測試劑費用昂貴,難以在基層醫(yī)院推廣和應(yīng)用。因此需要一種準確、簡便、價廉的CD3+、CD4+和CD8+T細胞檢測方法。本研究應(yīng)用免疫玻片法檢測全血CD3+、CD4+和CD8+T細胞,并與經(jīng)典的流式細胞術(shù)進行比較,考察了兩種方法的相關(guān)性,報道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象

120份全血標本來自本院住院患者和體檢人群,其中住院患者100例,涉及的疾病有腫瘤、病毒性感染、自身免疫病、創(chuàng)傷、心血管疾病和糖尿病等。體檢人群20例,為體檢中各指標均正常的健康者。

1.2 儀器和試劑

Epics XL流式細胞儀及CD3+/CD4+/CD8+檢測試劑均由美國Beckman-Coulter公司提供。CD3+、CD4+和CD 8+T細胞檢測玻片及配套試劑均由上海匯中細胞生物科技有限公司提供。Sysmex SF3000型細胞分析儀及試劑,均由日本Sysmex公司提供。

1.3 方法

1.3.1 標本采集:采集靜脈血2m l,EDTA抗凝后,2～8℃保存,分別用流式細胞術(shù)和玻片法檢測CD3+、CD4+和CD8+T細胞數(shù),同時進行全血細胞計數(shù)。

1.3.2 流式細胞術(shù)檢測T淋巴細胞亞群:取CD3-PC5/CD4-FITC/CD8-PE三色標記的單克隆抗體20μl加入Tru COUNT試管管底,然后加入抗凝新鮮全血 100μl,充分混勻,室溫避光孵育30～60min,再分別加入溶血劑、緩沖液和固定液,其間振蕩混勻,進行流式細胞術(shù)分析。檢測前用標準熒光微球通過FACS Comp軟件自動校準流式細胞儀,再上樣進行 CD3+/CD4+/CD8+檢測,得到全血中CD3+、CD4+和CD8+T細胞的百分數(shù),結(jié)合全血細胞計數(shù)結(jié)果,換算得到CD 3+、CD4+和CD8+T細胞的絕對值(個/μl)。

1.3.3 免疫玻片法檢測T淋巴細胞亞群:將20μl全血加入到 380μl磷酸鹽緩沖液中混勻,分別取5μl稀釋后全血加入到CD3、CD4和CD8抗體包被區(qū),室溫孵育40min,用磷酸鹽緩沖液對玻片進行清洗,再用過氧化酶染色液通過細胞染色去除單核細胞等非特異性細胞,然后再用復(fù)染液對CD細胞進行染色。即可采用普通光學顯微鏡或自動計數(shù)儀對其進行計數(shù),所得計數(shù)結(jié)果乘以4,即為每μl外周血中CD3+、CD4+和CD8+T細胞的數(shù)值。為保證檢測的準確性和穩(wěn)定性,檢測前用標準片上機進行測試;檢測完成后,再用標準片驗證一次,要求兩次結(jié)果均在控制范圍內(nèi)。

1.4 統(tǒng)計學處理

所有資料均輸入計算機,應(yīng)用描述性統(tǒng)計指標和t檢驗統(tǒng)計分析,并使用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件對兩種方法所測得的CD3+、CD4+和CD8+T細胞數(shù)進行Pearson相關(guān)性分析和Bland-A ltman散點圖分析。以相關(guān)系數(shù)(r)大于0.8表示兩方法之間具有顯著相關(guān)性,P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 特異性免疫玻片法和流式細胞術(shù)的檢測比較

兩種方法檢測CD3+、CD4+和CD8+T細胞的平均值、標準差以及中位數(shù)等的統(tǒng)計結(jié)果見表1。經(jīng)t檢驗,免疫玻片法和流式細胞術(shù)檢測的CD3+、CD4+和CD8+T細胞數(shù)差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

表1 兩種檢測方法的結(jié)果比較

2.2 兩種方法的相關(guān)性分析

免疫玻片法與流式細胞術(shù)檢測CD3+T細胞的r為0.96,平均絕對誤差為-21個細胞/μl;CD4+T細胞的 r為0.98,平均絕對誤差為3個細胞/μl;CD 8+T細胞的r為0.94,平均絕對誤差為26個細胞/μl,見圖1。經(jīng)統(tǒng)計學處理,兩種方法檢測的CD 3+、CD4+和CD8+T細胞數(shù)具有顯著相關(guān)性。

圖1 兩種方法計數(shù)CD3+、CD 4+和CD8+T細胞的相關(guān)性

2.3 重復(fù)性試驗

從120份全血標本中隨機抽取20份,應(yīng)用免疫玻片法分別檢測兩次CD3+、CD4+和CD8+T細胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn),CD3+、CD4+和CD 8+T細胞的變異系數(shù)(CV)分別＜7%、7%和12%。

3 討 論

T淋巴細胞亞群是調(diào)控細胞免疫的主要細胞,大量研究表明,其絕對數(shù)和比值是衡量個體免疫狀態(tài)及功能的重要指標[2]。流式細胞術(shù)是目前細胞CD分化抗原檢測的標準方法,但由于儀器及檢測試劑昂貴、檢測人員需經(jīng)特殊專業(yè)培訓、儀器維護復(fù)雜等原因,很難在基層醫(yī)院普遍推廣應(yīng)用。同時,流式細胞術(shù)檢測的是CD3+、CD4+和CD8+T細胞占淋巴細胞總數(shù)的百分比,只能顯示T淋巴細胞亞群的構(gòu)成比例,無法直接反映各亞群細胞的絕對水平[3],若要獲得各亞群細胞的絕對數(shù)量,需進行全血細胞計數(shù)后再換算,操作較復(fù)雜。

本研究所用的免疫玻片法突破傳統(tǒng)的特異性細胞檢測思路,采用逆向思維,即不用抗體來標記細胞,而是用事先包被有特異性抗體的玻片來捕捉游離的CD3+、CD4+和CD8+T細胞,通過洗滌除去非特異CD抗原表達細胞,再用細胞化學染色法區(qū)分T淋巴細胞與單核細胞,然后利用計算機系統(tǒng)控制普通光學顯微鏡進行 T淋巴細胞亞群計數(shù)。本文對120例不同人群全血CD3+、CD4+和CD8+T細胞檢測結(jié)果表明,免疫玻片法與流式細胞術(shù)具有顯著相關(guān)性和較小的檢測差異,而且重復(fù)性好。因此,免疫玻片法檢測T淋巴細胞亞群,具有操作簡便、經(jīng)濟適用等特點,可較好滿足健康體檢人群及貧困邊遠和衛(wèi)生資源缺乏地區(qū)對T淋巴細胞亞群檢測的需要,同時可為病人減輕經(jīng)濟負擔,使其更廣泛的應(yīng)用于免疫相關(guān)疾病的輔助診斷、病程監(jiān)測及療效評估。

本文第一作者簡介:

呂衛(wèi)東(1967～),男,漢族,主管技師

1 陳偉烈,袁小平,唐小珍,等.登革熱病毒感染者外周血 T淋巴細胞亞群數(shù)量的變化及其臨床意義.中國人獸共患病學報,2006,22(11):1 042～1 044.

2 楊 波,祁巖超,盧敏瑩,等.流式細胞術(shù)分析六類腫瘤患者外周血淋巴細胞絕對值的變化.實用腫瘤學雜志,2006,20(2):81～83.

3 Bisset LR,Lung TL,Kaelin M,et al.Reference values fo r peripheral blood lymphocy te phenol-types applicab le to the healthy adult population in Sw itzerland.Eur J Haem atol,2004,72(3):203～212.

特異性免疫玻片法在外周血T淋巴細胞亞群檢測中的應(yīng)用

呂衛(wèi)東,張平安/湖北省蘄春縣第三人民醫(yī)院檢驗科,蘄春435300

目的:探討一種非流式T淋巴細胞亞群檢測的新方法。方法:采用特異性免疫玻片法對120份全血CD3+、CD4+和CD8+T細胞進行檢測,并與流式細胞術(shù)檢測結(jié)果進行相關(guān)性分析。結(jié)果:兩種方法檢測 CD3+、CD4+和CD8+T細胞的相關(guān)系數(shù)(r)分別為0.96、0.98和0.94,平均絕對誤差分別為-21個細胞/μl、3個細胞/μl和26個細胞/μl。統(tǒng)計學處理發(fā)現(xiàn),兩種方法檢測CD3+、CD4+和CD8+T細胞的結(jié)果差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。結(jié)論:免疫玻片法可準確進行全血T淋巴細胞亞群計數(shù),并具有試劑價格低廉、操作簡單的特點,適用于基層和衛(wèi)生資源缺乏地區(qū)的醫(yī)療機構(gòu)。

R331.3+5

A

1005-1740(2011)01-0051-03

1湖北省蘄春縣第三人民醫(yī)院檢驗科,郵政編碼 蘄春435300;2武漢大學人民醫(yī)院檢驗科; 通訊作者:張平安,E-mail:zhangpingan@yahoo.com.cn

免疫玻片法 細胞形態(tài)學分析 T淋巴細胞亞群