張成圖,陳永忠,韓 樂,李啟成,王淑琴

(青海省西寧市畜牧獸醫(yī)站,青海西寧 810003)

豬瘟(CFS)是由黃病毒科瘟病毒屬的豬瘟病毒(CFSV)引起的豬的一種高度接觸性傳染病。各個年齡段的豬群,不分品種對其均易感,病死率高,傳播迅速,目前依然是危害我國養(yǎng)豬業(yè)主要傳染病之一。根據(jù)世界動物衛(wèi)生組織(OIE)制定的《陸生動物衛(wèi)生法典》2005版,豬瘟被列為必須報告的傳染病之一,近年來豬瘟的流行形式和發(fā)病特點都有所變化,主要表現(xiàn)為隱性感染、亞臨床感染或非典型性,使得豬瘟成為現(xiàn)代養(yǎng)豬業(yè)的重大隱患,單憑臨床診斷十分困難,必須以實驗室檢驗技術(shù)。為了有效地控制豬瘟的發(fā)生,我們于2008年對西寧市郊生豬規(guī)模養(yǎng)殖場和調(diào)進(jìn)生豬豬瘟流行情況,應(yīng)用ELISA法進(jìn)行了調(diào)查,調(diào)查結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 血液樣品的采集 來自西寧市郊3個規(guī)模養(yǎng)殖場,分為5批調(diào)進(jìn)生豬。

1.2 主要試劑 CFSV抗原、ELISA診斷試劑盒,美國IDEXX公司生產(chǎn),批號為43220-RO11。

1.3 酶標(biāo)儀 Labsystem Dragon Wellscan MK-3型。

1.4 操作方法 (1)加10倍的25μL樣品稀釋液和475μL被檢血液到微量管中進(jìn)行渦旋混合。(2)在室溫下感作1 h,也可在溫箱中渦旋相同時間,感作后可直接用于試驗,即75μL血液到檢測孔中,再加5×10μL樣品稀釋液(10×),稀釋時用相等體積的蒸餾水,混合時用全盤/條震蕩后按步驟進(jìn)行。(3)步驟:每板每孔中用移液槍嘴加入稀釋液 25 μL,加全血25μL;加豬瘟酶標(biāo)二抗25μL;加診斷液25μL,振蕩3 min后,室溫孵化 1 h。

1.5 判定標(biāo)準(zhǔn)

1.5.1 計算樣品和對照孔的吸收值(OD490)計算相對應(yīng)的樣品和對照的OD490值,樣品合乎陽性對照的平均吸收值首先要成立,正確的OD490值應(yīng)當(dāng)是樣品或陽性對照的OD490值減陰性對照的OD490值,正確OD490值=樣品OD490值-陰性對照OD490值。

1.5.2 為了使試驗數(shù)據(jù)真實可靠,陽性對照的OD490值必須大于0.50;陰性對照的OD490值應(yīng)比陰性對照OD490值的20%還低,假如得不到該值,請檢查所使用的儀器設(shè)備和操作步驟,檢查后陰性對照的OD490值仍然很高的話,請求將樣品重新10 000 r/min離心3～5 min,并重新檢測。

2 結(jié)果判定

OD490值等于或大于0.30為陽性,OD490值等于或小于0.20為陰性,OD490值介于0.2～0.3之間為可疑。

2.1 調(diào)進(jìn)生豬血清學(xué)檢測結(jié)果 128份被檢血清,檢出陽性血清15份,陽性率為11.72%。其中一批檢出陽性2份,陽性率為8.00%;二批檢出陽性2份,陽性率為8.33%;三批檢出陽性4份,陽性率為17.39%;四批檢出陽性 1份,陽性率為 3.84%;五批檢出陽性5份,陽性率為16.67%。結(jié)果見表1。

表1 調(diào)進(jìn)生豬豬瘟檢測結(jié)果

2.2 規(guī)模養(yǎng)殖場生豬血清學(xué)檢測結(jié)果 108份被檢血清,檢出陽性血清8份,陽性率7.40%,其中一場檢出陽性2份,陽性率為5.88%;二場檢出陽性3份,陽性率為11.11%;三場檢出陽性3份,陽性率為6.38%。本次檢測結(jié)果為108份被檢樣品,陽性8份,陽性率7.40%。結(jié)果見表2。

表2 自繁自育豬瘟檢測結(jié)果

3 討論與小結(jié)

夾心ELISA是檢測病毒抗原的常用方法,許多文獻(xiàn)已報告了夾心ELISA方法的研究應(yīng)用。Kosmidou等(1995)使用單克隆抗體技術(shù)建立了一種豬瘟病毒抗原的ELISA方法[1],在夾心ELISA方法的建立中,制備高效價、高生物活性的包被抗體和酶標(biāo)抗體是本試驗成功的關(guān)鍵所在。本試劑盒對全血、外周血液或細(xì)胞培養(yǎng)物敏感,夾心ELISA試劑具有較高的特異性和敏感性,可用于豬瘟的診斷[2],對檢出的陽性病豬及時淘汰,從而有利于豬瘟的控制與凈化。

目前,生豬規(guī)模養(yǎng)殖場非典型豬瘟的發(fā)病數(shù)有所上升,并已成為養(yǎng)殖場常見傳染病之一,近幾年我們通過針對性調(diào)查,證實目前豬瘟的流行病學(xué)臨床癥狀、剖檢病變等方面都發(fā)生了變化,臨床檢查很難判定原因,因而易被誤診而拖延最佳防治時機(jī),必須結(jié)合實驗室檢驗方法最終確診。應(yīng)用本方法可有助于對豬瘟的流行病學(xué)調(diào)查和診斷,從而快速撲滅疫點,控制疫情[3]。

從結(jié)果看,有23例陽性,已注射過豬瘟疫苗的豬仍呈陽性,筆者初步認(rèn)為有兩個可能原因:一是由于這幾年規(guī)?；N豬場豬繁殖和呼吸道綜合征及偽狂犬病等影響和破壞豬體免疫系統(tǒng)的新發(fā)傳染病的出現(xiàn),干擾了豬瘟抗體的產(chǎn)生和維持,導(dǎo)致疫苗免疫后仍出現(xiàn)豬瘟病豬;二是豬瘟疫苗毒株和流行毒株可能存在差異,進(jìn)而導(dǎo)致免疫失敗,鑒于此,我們必須一方面對豬瘟予以高度重視,增加對可疑樣品的及時診斷和豬瘟疫情的動態(tài)監(jiān)測,以保護(hù)養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。

從調(diào)查結(jié)果來看,外省調(diào)進(jìn)的生豬豬瘟陽性高于本地自繁自育豬場,因此我們應(yīng)該加大對進(jìn)入我市的生豬加強(qiáng)監(jiān)管力度,仔豬調(diào)運嚴(yán)格實行報檢制度,販運仔豬到達(dá)后一律隔離觀察,確認(rèn)健康后方可進(jìn)入流通環(huán)節(jié),對防制和凈化本病有重要作用。

目前疫苗注射仍然是防治本病的最重要的手段之一,因此,在生豬飼養(yǎng)的各個環(huán)節(jié)注重疫苗免疫注射,注意注射方法和注射劑量,確保免疫抗體達(dá)到保護(hù)水平,對控制和凈化豬瘟具有決定性的意義。

[1] Kosmidou R,Ahi.H-J-Th,E weiland.Differentiation of classical swine fever virus(CSFV)strains using monoclonal antibodies against structu ral globulinproteins[J].Veterinary Microbiology,1995(4):111-118.

[2] 鄭長生,萬春云,王姣.ELISA和PT-PCR技術(shù)診斷豬瘟的研究進(jìn)展[J].養(yǎng)殖與飼料,2009(3):48-51.

[3] 湯賽冬,周雪芳,周光勝,等.檢測豬瘟抗原的夾心ELISA診斷試劑盒的制備標(biāo)化和應(yīng)用的研究[J].上海畜牧獸醫(yī)通訊,2002,2:14-15.