范治璐,滕忠義,李衛(wèi)平

(1.大連醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院 泌尿外科,遼寧 大連 116027;2.大連醫(yī)科大學 08級碩士研究生,遼寧 大連 116044;3.大連醫(yī)科大學 藥學院,遼寧大連 116044)

魚肝油酸鈉對回腸新膀胱粘液分泌的影響

范治璐1,滕忠義2,李衛(wèi)平3

(1.大連醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院 泌尿外科,遼寧 大連 116027;2.大連醫(yī)科大學 08級碩士研究生,遼寧 大連 116044;3.大連醫(yī)科大學 藥學院,遼寧大連 116044)

[目的]了解魚肝油酸鈉和酒精對回腸新膀胱黏膜和杯狀細胞分泌功能的影響。[方法]SD大鼠 24只,體重250g,隨機分為生理鹽水對照組(A組)、75%酒精組(B組)、魚肝油酸鈉組(C組),每組 8只。大鼠回腸新膀胱模型建立后,分別第 8、11、14天新膀胱灌藥,每次灌藥后 72 h留取尿液,測定尿液蛋白濃度;第 17天處死大鼠,取新膀胱標本,光鏡和電鏡觀察形態(tài)變化,免疫組化方法檢測NF-кB表達,以評估新膀胱黏膜狀況及粘液分泌情況。[結(jié)果]與 A組新膀胱尿液中蛋白濃度(4.48±0.56)mg/m L相比,B組(1.21±0.07)mg/mL、C組(1.69±0.36)mg/mL均顯著降低(P＜0.05);光鏡下,A組新膀胱腸絨毛整齊,黏膜完整,肌層未見損傷,杯狀細胞所占比例：(0.31±0.03)/HP;B組新膀胱腸絨毛結(jié)構(gòu)紊亂,黏膜不完整,肌層有不同程度損傷,杯狀細胞所占比例(0.08±0.04)/HP,低于 A組。C組新膀胱腸絨毛無明顯異常,黏膜及肌層無明顯損傷,杯狀細胞所占比例(0.12±0.05)/HP,較 A組降低;核因子 NF-кB陽性表達細胞數(shù)為：A組(27.88±7.18)、B組(7.50±2.20)、C組(11.88±2.61),后二組均顯著降低(P＜0.05);電鏡下,A組新膀胱腸黏膜微絨毛整齊,細胞器正常;B組無微絨毛結(jié)構(gòu),大量細胞液化壞死,顆粒釋放;C組微絨毛變短、稀疏或缺失,細胞器基本正常。[結(jié)論]魚肝油酸鈉較 75%酒精更適合應用于術(shù)后灌注回腸新膀胱。

回腸新膀胱;魚肝油酸鈉;組織損傷

目前,根治性膀胱切除術(shù)已經(jīng)成為肌層浸潤性膀胱癌,高?；蛘叻磸蛷桶l(fā)的非肌層浸潤性膀胱癌治療的金標準[1,2],治愈率遠高于其他方法。膀胱全切后的尿流改道方案對患者的預后和生活質(zhì)量有著重要意義,自 1852年 Simon報道輸尿管直腸吻合以來,回腸、空腸和結(jié)腸都作為尿流改道的選擇,并在臨床中得到應用和發(fā)展。近十多年以來,原位新膀胱手術(shù)得到迅速發(fā)展,因為其功能更接近于生理性膀胱,在條件允許的情況下回腸新膀胱術(shù)已成為尿流改道的首選術(shù)式[3],但是新膀胱中的腸黏膜仍然存在分泌和吸收功能,會引起一系列的并發(fā)癥,如電解質(zhì)紊亂、尿路堵塞、殘余尿增多、結(jié)石形成、尿路感染等。本實驗嘗試通過魚肝油酸鈉和 75%乙醇灌注回腸新膀胱,使其黏膜的分泌功能減退或消失,從而減少并發(fā)癥的發(fā)生機會。

1 材料和方法

1.1 實驗動物、材料和設備

1.1.1 實驗動物：健康 Sprague-Dawley(SD)大鼠24只,體重 200～250 g,由大連醫(yī)科大學實驗動物中心提供,許可證號 SCXK(遼)2008-0002。

1.1.2 主要實驗試劑及儀器：魚肝油酸鈉注射液(上海東海制藥股份有限公司),BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天生物制藥工程公司),免疫組化試劑盒,DAB顯色試劑盒,HE染色試劑(大連醫(yī)科大學病理實驗室提供),小鼠抗大鼠 NF-кB多克隆抗體(分裝 Santan Cruz Biotechnology)。實驗操作臺、手術(shù)器械、酶標儀(大連醫(yī)科大學藥理學實驗室提供),微量電子秤 FA1104(上海精科天平)。

1.2 實驗方法

1.2.1實驗動物分組：實驗動物隨機分為 3組,每組8只 。 0.9%NaCl組(A組 )、75%酒精組(B組 )、魚肝油酸鈉組(C組)。

1.2.2 實驗過程：取下腹正中切口長約 2.5 cm,顯露腹腔,尋及回盲部及膀胱。距回盲部近端 5～7 cm處截取一段長約 4 cm的回腸,保留其血管蒂,暫時用生理鹽水紗布外敷保護。以 5～0慕絲線行小腸端端吻合,恢復其連續(xù)性。吻合完畢后將其還納于腹腔。游離小腸段以慶大霉素沖洗 30 s,兩端分別以 5～0絲線行間斷縫合。于其腸系膜對側(cè),與腸管平行剪開一長約 1 cm弧形開口,距膀胱三角區(qū)0.3 cm切除膀胱,注意勿傷及輸尿管及輸尿管口。膀胱殘端與新膀胱以 5～0可絲線線間斷吻合,查無活動性出血后逐層關閉腹部切口。術(shù)后抗感染治療3 d。

1.2.3 給藥：模型建立后的第 8、11、14天向 A組大鼠代膀胱注入生理鹽水 1m L;向 B組注入 75%酒精1m L;向 C組注入魚肝油酸鈉(5 mg/m L)1 mL。A、C組每次保留 2 h,每隔 30 min更換體位 1次,B組灌注 1min后抽出。

1.3 標本采集與指標測定

1.3.1 標本采集：每次膀胱注藥 72 h后,留取尿液標本。第 17天處死大鼠,取代膀胱組織,分別用4%中性甲醛固定及 2.5%戊二醛固定,常規(guī)石蠟包埋。

1.3.2 指標測定：組織形態(tài)學觀察及杯狀細胞計數(shù);常規(guī) HE染色,組織形態(tài)學觀察：解剖顯微鏡觀察回腸新膀胱黏膜層及黏膜下層的組織結(jié)構(gòu)變化情況。采用回腸黏膜評分判定腸黏膜損傷情況：0分：腸組織正常無壞死;1分：輕度腸上皮脫落,僅限于黏膜頂部;2分：絨毛壞死,局限于頂部;3分：絨毛中度壞死,腸隱窩清晰可見;4分：絨毛完全壞死。杯狀細胞計數(shù)：每例標本隨機選取 5個絨毛,計數(shù)每百個細胞中杯狀細胞所占比例,取平均值。電鏡觀察：觀察杯狀細胞形態(tài)及結(jié)構(gòu)變化,各細胞器的變化情況。核因子 NF-кB免疫組化染色：按說明書用SABC法進行免疫組織化學染色。每例觀察切片 1張,隨機選取 5個非重疊的視野進行觀察計數(shù),計算視野內(nèi)陽性表達細胞數(shù),取平均值。尿蛋白測定。

1.4 統(tǒng)計學方法

應用 SPSS 16.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù),計量資料以均數(shù) ±標準差(±s)表示,兩組間均數(shù)比較采用 t檢驗,多樣本均數(shù)比較的單因素方差分析(One-Way ANONA)法進行檢驗,多組連續(xù)變量資料采取秩和檢驗(Kruskal-Wallis Test),取 a=0.05為檢驗水準。

2 結(jié) 果

2.1 新膀胱組織形態(tài)學方面

C組 HE染色光鏡下可見新膀胱組織輕度炎癥性反應,黏膜杯狀細胞數(shù)量減少,組織黏膜及黏膜下層無明顯損傷,與 A組黏膜組織比較差異無顯著性意義;B組腸絨毛結(jié)構(gòu)紊亂,黏膜層不完整,固有層及肌層均有不同程度的損傷,炎癥細胞聚集,與 A組差異有顯著性意義(表 3,圖 1)。

2.2 藥物對杯狀細胞分泌粘液的影響

與 A組新膀胱尿液中的尿蛋白濃度(4.48±0.56)mg/m L相比,B組(1.21±0.07)mg/m L、C組(1.69±0.36)mg/mL均明顯降低,差異具有顯著性意義;B組尿蛋白濃度低于 C組,差別具有顯著性意義(P＜0.05)(表 1)。

2.3 藥物對回腸杯狀細胞數(shù)目的影響

C組(0.12±0.05)、B組(0.08±0.04)每高倍視野杯狀細胞所占比例均低于 A組(0.31±0.03),差異具有顯著性意義(P＜0.05)。B、C組之間差異無顯著性意義(表 2)。

2.4 電鏡觀察情況

A組腸黏膜結(jié)構(gòu)完整,表面微絨毛整齊,杯狀細胞輕微脹大,內(nèi)充滿了分泌顆粒。C組細胞器基本正常,細胞內(nèi)粘液較對照組減少。B組少見杯狀細胞,偶有發(fā)現(xiàn)杯狀細胞液化壞死,顆粒釋放,黏膜結(jié)構(gòu)破壞嚴重(圖 3)。

2.5 核因子 NF-кB免疫組化染色陽性表達細胞數(shù)

與 A組(27.88±7.18)相比,C組(11.88±2.61)、B組(7.50±2.20)陽性細胞數(shù)均明顯降低,差別具有顯著性意義(P＜0.05)。B組陽性細胞數(shù)少于 C組,差別有顯著性意義(表 2,圖 2)。

表 1 藥物對回腸新膀胱中蛋白含量的影響Tab 1 In fluence of durgs on density ofmucus in neo-bladder

表 2 藥物對回腸杯狀細胞數(shù)目的影響Tab 2 Influence of durgs on the number of goblet cells

表 3 回腸黏膜評分Tab 3Score of the ileum mucousmembrane

圖1 回腸新膀胱組織的HE染色Fig 1 HE coloretur of Neo-b ladder

圖2 NF-кB免疫組化染色Fig 2NF-кB immunohistochem isty

圖3 電鏡觀察Fig 3Electron microscopy

3 討 論

膀胱癌是泌尿生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤。膀胱全切、回腸代膀胱術(shù)是治療浸潤性膀胱癌有效的手術(shù)方法[1],該術(shù)式可使患者術(shù)后從原尿道自行排尿,排尿方式與正常人相同,從而提高了患者術(shù)后的生活質(zhì)量。然而,由于術(shù)后代膀胱不斷分泌腸粘液,容易造成代膀胱引流管的堵塞和尿液排出不暢,導致并發(fā)癥發(fā)生。此外,代膀胱的堵塞還可使輸尿管尿液排出受阻,引發(fā)腎積水。雖然術(shù)后隨著時間的推移,腸管上皮逐漸膀胱化,粘液量會逐漸減少,黏膜的分泌功能逐漸減弱[2],但此變化出現(xiàn)一般需要1年[3]甚至更長的時間,而術(shù)后早期粘液分泌引發(fā)的問題并沒有得到解決。因此,積極抑制腸黏膜粘液分泌十分必要。目前文獻報道處理腸黏膜的方法有很多種,如機械性剝離腸黏膜[4,5],光動力法[6],酶處理法[7],但多在動物水平,且費用昂貴。應用化學試劑處理滅活腸黏膜具有簡單、方便、經(jīng)濟的特點,有臨床應用前景。目前,臨床上采用無水酒精法處理[8,9],副作用較大,損傷腸壁為不可逆性,導致腸膀胱功能受損。處理時間也無統(tǒng)一標準。本實驗采用魚肝油酸鈉處理回腸新膀胱黏膜,希望能達到既能使新膀胱黏膜減少粘液分泌,又不影響新膀胱生理功能的目的。

魚肝油酸鈉(Sodium Morrhuate)是中國與美國目前都廣泛使用的一種海洋藥物。作為硬化藥,魚肝油酸鈉早年主要是用于下肢靜脈曲張的治療以及血管瘤[10]、內(nèi)痔[11]的治療等。其機制主要為：當藥物注入血管內(nèi)、血管周圍、囊腫腔及體腔內(nèi)時,由于化學性炎癥而產(chǎn)生血管內(nèi)膜、囊腫內(nèi)膜、漿膜的破壞而相互粘連,借以閉塞管腔或產(chǎn)生組織纖維化,以達到治療目的。除了作為硬化藥,魚肝油酸鈉同時也作為止血藥以及輔助抗腫瘤藥物應用。魚肝油酸鈉用于止血,是其新用途研究中的一個發(fā)現(xiàn),已廣泛用于體表、體腔、臟器的滲血性出血及手術(shù)創(chuàng)面出血的止血。其止血的作用機制是：(1)魚肝油酸鈉誘導血小板凝集。(2)魚肝油酸鈉能激活內(nèi)源凝血系統(tǒng)。(3)魚肝油酸鈉阻斷了微循環(huán)。(4)魚肝油酸鈉病灶基底部注射止血與硬化壓迫治療(Sclero-Pressure Therapy)機制有關[12]。與硬化劑止血作用相比較,魚肝油酸鈉在惡性腫瘤治療方面的應用尚未引起重視,1987年,李彥豪[13]經(jīng)動物實驗首次證明了 5%魚肝油酸鈉是一種有效的動脈栓塞劑可用于肝動脈栓塞治療原發(fā)性肝癌,1997年,劉利民等[14]應用超聲引導下魚肝油酸鈉乙醇混合液(SMPA)瘤內(nèi)直接注射治療肝癌,較單純乙醇注射組(PAI)對腫瘤細胞的殺滅力強,并認為魚肝油酸鈉具有改變細胞內(nèi)外環(huán)境,并調(diào)節(jié)局部免疫功能的作用。崔立剛等[15]研究發(fā)現(xiàn)魚肝油酸鈉瘤內(nèi)注射具有顯著的抗腫瘤治療效果。動物實驗研究表明[16],魚肝油酸鈉可使腫瘤組織局部發(fā)生無菌性炎癥壞死,粒細胞增多。而大量巨噬細胞的出現(xiàn),從另一方面說明了魚肝油酸鈉對腫瘤的殺傷作用。其機理為：(1)對局部的腫瘤細胞起到了殺傷作用。(2)魚肝油酸鈉被腫瘤細胞吞噬后,破壞了腫瘤細胞的內(nèi)環(huán)境,使腫瘤細胞不能生長繁殖以至壞死。(3)魚肝油酸鈉可破壞腫瘤組織血管,從而使腫瘤的血液供應發(fā)生障礙,使腫瘤細胞營養(yǎng)不良,生長緩慢,并發(fā)生壞死。魚肝油酸鈉的硬化、止血及抗腫瘤作用,對行回腸新膀胱術(shù)患者有著積極的治療作用,作為止血藥,可以減少新膀胱手術(shù)縫合區(qū)出血;作為硬化藥,又可以硬化新膀胱黏膜,減少粘液分泌;作為抗腫瘤藥,則對減少膀胱癌復發(fā)有幫助。所以本實驗選擇魚肝油酸鈉作為回腸新膀胱術(shù)后膀胱灌注藥物,以求能減少術(shù)后并發(fā)癥。同時,在同等時間條件下與 75%酒精組比較處理效果。

在本實驗中,應用魚肝油酸鈉灌注大鼠回腸新膀胱,與 75%酒精灌注大鼠回腸新膀胱進行比較。通過 HE染色觀察發(fā)現(xiàn)：75%酒精組腸絨毛結(jié)構(gòu)紊亂,黏膜層不完整,固有層及肌層均有不同程度的損傷,炎癥細胞聚集,不適合做為膀胱灌注藥物。而魚肝油酸鈉高劑量組和低劑量組組織黏膜及黏膜下層無明顯損傷,與對照組差異無顯著性意義。通過測定尿液中尿蛋白含量,發(fā)現(xiàn)魚肝油酸鈉高、低劑量組回腸新膀胱尿液中蛋白濃度顯著減低。尿液的粘度顯著下降,對減輕患者的術(shù)后并發(fā)癥,提高其生活質(zhì)量有積極的作用。電鏡觀察發(fā)現(xiàn)：對照組腸黏膜結(jié)構(gòu)完整,表面微絨毛整齊,杯狀細胞輕微脹大,內(nèi)部充滿了分泌顆粒。魚肝油酸鈉低、高劑量組細胞器基本正常,細胞內(nèi)粘液較對照組減少。75%酒精組少見杯狀細胞,偶有發(fā)現(xiàn)杯狀細胞液化壞死,顆粒釋放,黏膜結(jié)構(gòu)破壞嚴重。實驗結(jié)果表明在既能減少粘液分泌,又不損害新膀胱功能前提下,應用魚肝油酸鈉灌注膀胱要比 75%酒精更適合。

實驗還發(fā)現(xiàn)：魚肝油酸鈉高、低劑量組大鼠的NF-кB入核率較對照組明顯降低(圖 5,6,7)。據(jù)文獻報道：在靜息狀態(tài)下,細胞中 NF-KB存在于胞漿中,被激活后 NF-κB將移入核內(nèi),與 MUC5AC啟動子近側(cè)的核轉(zhuǎn)錄因子 -κB結(jié)合位點結(jié)合,激活轉(zhuǎn)錄因子,啟動子活化,引起 MUC5AC基因轉(zhuǎn)錄、蛋白表達增多[17]。徐治波,游明元等[18]發(fā)現(xiàn) NF-κB的活化與粘蛋白 Muc5ac的表達呈正相關。歐雪梅等[19]在大環(huán)內(nèi)酯類抗生素對氣道粘液分泌影響的研究中也發(fā)現(xiàn),羅紅霉素對氣道粘液高分泌的調(diào)控作用,其分子機制與核因子 NF-KB的活動有關。本實驗結(jié)果與相關文獻報道相一致。由此可以推測回腸新膀胱粘液分泌減少,與腸柱狀粘液上皮細胞核因子 NF-кB的表達受抑制具有相關性。

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Influence of soduim morrhuate onm ucus production of neo-bladder of rats

FAN Zhi-lu1,TENG Zhong-yi2,LIWei-ping3
(1.Department of Urinary Surgery,the Second Affiliated Hospital of Dalian Medical University,Dalian 116027;2.Da lian Medical University Student at Grade 2008,Dalian 116044,China;3.Pharmaceutical College,Dalian Medical University,Dalian 116044,China)

[Objective]To investigate the effects ofmorrhate sodium and 75%alcohol on the intestinalmucosa and goblet cells of neo-bladder in ratmodel.[Methods]SD rats of 24 weighing about 250 gramswere randomly divided into saline(A),morrhate sodium(B),and 75%alcohol(C)groups.The d rugswere injected to the neo-bladders at the 8 th,11 th,and 14 th day after the operation of neo-bladder reformation from ileum,and the urine in neo-b ladderwere collected at72 hours following drug injection.The rats were terminated at the 17 th day.The neo-bladder tissueswere observed under the lightmicroscopy and electron microscopy,and NF-кB expression in the tissues were detected by immunohistochemisty for comparing the degree of in jury.[Results]Protein concentrations of group A were(4.48±0.56)mg/mL,group B were(1.21±0.07)mg/mL,and group C were(1.69±0.36)mg/mL,respectively(P＜0.05).Microscopy,in group A,the intestinalmucosa was comp lete and intestinal villus was regular,muscu lar layer in jury was not clear,the proportion of goblet cellswas(0.31±0.03)/HP,in group B,the intestinalmucosa was not complete,and intestinal villus was disorder,the muscu lar layer have different degrees of damage,the p roportion of goblet cellswas(0.08±0.04)/HP,and in group C,the intestinalmucosa and muscular layer had a few of injury,the p roportion of goblet cellswas(0.12±0.05)/HP.The number of NF-кB positive cellswere(27.88±7.18)in group A,(7.50±2.20)in group B,and(11.88±2.61)in group C,respectively(P＜0.05).Under electronmicroscopy,in group A：the structure ofm icrovilliwere comp lete,organelle injury was not clear.In Group B：microvilliwerenot completeand cytoplasma werenot clear.And in group C：m icrovillibecame smaller and organelles injury was not clear.[Conclusion]Themorrhate sodium is more suitable for irrigation of bladder of Neobladder than the alcohol.

neo-b ladder;Morrhate Sodium;injury

R 737.14

A

1671-7295(2011)01-0040-06

2010-11-11;

2010-12-29

范治璐(1955-),男,湖北武漢人,教授。