龍 海, 李芳榮, 李一農(nóng)*, 仲建忠

(1.深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局,深圳 518001; 2.深圳市檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院,深圳 518045)

RNAi在植物寄生線蟲功能基因組研究中的應(yīng)用

龍 海1,2, 李芳榮1, 李一農(nóng)1*, 仲建忠1

(1.深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局,深圳 518001; 2.深圳市檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院,深圳 518045)

最近,南方根結(jié)線蟲(Meloidogyne incognita)和北方根結(jié)線蟲(M.hapla)的基因組測序工作已經(jīng)完成,而大豆孢囊線蟲(Heterodera glycines)和馬鈴薯白線蟲(Globodera pallida)的基因組測序工作也在進(jìn)行之中。截至2008年,Nematode.net數(shù)據(jù)庫中已經(jīng)有近500 000個(gè)表達(dá)序列標(biāo)簽ESTs序列和1 200 000個(gè)來自30種線蟲的基因組序列。如何從眾多的序列中篩選出有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值的信息是線蟲學(xué)研究面臨的一大挑戰(zhàn)。對于缺乏有效轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的植物寄生線蟲來說,RNAi無疑是研究植物寄生線蟲基因功能的有力工具。本文介紹了RNAi及其在植物寄生線蟲基因功能研究中的應(yīng)用。

植物寄生線蟲; 基因組; ESTs; 轉(zhuǎn)化系統(tǒng); RNAi

全球的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)每年因植物寄生線蟲造成的損失約為1 250億美元[1]。由于抗線蟲基因活性的喪失,高毒化學(xué)農(nóng)藥的禁用和生物防治方法的局限性,發(fā)展新的線蟲防控策略迫在眉睫。目前,科學(xué)家正在對線蟲的ESTs和基因組進(jìn)行研究分析,期望找到防控線蟲的新靶標(biāo),而RNAi在其中發(fā)揮了重要作用。

1 外源性RNAi的機(jī)制

RNA干擾(RNAi)是一種細(xì)胞機(jī)制,由雙鏈RNA(dsRNA)驅(qū)動(dòng)序列同源基因的轉(zhuǎn)錄后沉默。外源dsRNA觸發(fā)的RNAi先由主細(xì)胞群,一般是腸上皮細(xì)胞攝取外源dsRNA,接著基因沉默向較遠(yuǎn)的細(xì)胞或組織做系統(tǒng)性傳播。在秀麗小桿線蟲(Caenorhabditiselegans)中,dsRNA結(jié)合蛋白RDE-4和RNaseIII-相關(guān)酶Dicer與dsRNA結(jié)合,并將其加工成21～25個(gè)核苷酸長的初級短干擾RNA(short interfering RNAs,siRNAs)。DCR-1、RDE-4、RDE-1 和初級siRNAs一起形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RNA induced silencing complex,RISC)。RISC利用siRNAs尋找靶mRNA,將其切割或者抑制它們翻譯[2]。在植物和秀麗小桿線蟲中,RNAi的高效性有賴于RNA的擴(kuò)增[3]。在秀麗小桿線蟲中,初級siRNAs指導(dǎo)依賴RNA的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerases,RdRP)以同源mRNA作為模板,用一種不依賴Dicer的方式合成次級 siRNAs,其 5′端是三磷酸,比初級siRNAs的量大,能更有效地觸發(fā)轉(zhuǎn)錄后沉默[4]。

2 植物寄生線蟲的體外RNAi

通過微注射或者飼喂秀麗小桿線蟲大腸桿菌,可以將dsRNA導(dǎo)入秀麗小桿線蟲。但是對于植物寄生線蟲卻難以實(shí)現(xiàn)。植物寄生線蟲的RNAi一般通過浸泡實(shí)現(xiàn)。自從首次將RNAi用于大豆孢囊線蟲(Heterodera glycines)和南方根結(jié)線蟲(Meloidogyne incognita)以來,已經(jīng)報(bào)道了 20余例 RNAi在植物寄生線蟲上的應(yīng)用[5]。對于靜止的植物寄生線蟲,卵和2齡幼蟲J2是非寄生階段,可用于浸泡。將甘藍(lán)根結(jié)線蟲(M.artiellia)的卵浸泡在幾丁質(zhì)合成酶的dsRNA溶液中,引起幾丁質(zhì)酶轉(zhuǎn)錄物的缺失,幾丁質(zhì)的合成減少和幼蟲的孵化延遲,這說明dsRNA能透過卵的膠狀基質(zhì)和幾丁質(zhì)層進(jìn)入線蟲體內(nèi)[6]。將馬鈴薯白線蟲(Globodera pallida)的J2浸泡在FMRF酰胺類多肽基因(FMRFamide-like peptide,f lp)的dsRNA中,結(jié)果J2的f lp轉(zhuǎn)錄物減少,線蟲運(yùn)動(dòng)方式發(fā)生改變[7]。馬鈴薯白線蟲的f lp對RNAi特別敏感,dsRNA的濃度為 10-9～10-4μ g/μ L就足以觸發(fā)f lp基因沉默[7]。

很多情況下,將植物寄生線蟲J2只是浸泡在dsRNA溶液中并不足以產(chǎn)生 RANi。為了促進(jìn)南方根結(jié)線蟲攝取dsRNA,用脂質(zhì)體或膠原酶對其進(jìn)行處理,結(jié)果并沒有產(chǎn)生RNAi[8]。但是將松材線蟲(Bursaphelenchus xylophilus)的J2和J3浸泡在含有脂質(zhì)體的dsRNA溶液中,靶基因的轉(zhuǎn)錄物會減少25%～45%[9]。使用神經(jīng)興奮劑能刺激線蟲攝取dsRNA。章胺和羥色胺調(diào)節(jié)M3神經(jīng)元的活動(dòng),當(dāng)秀麗小桿線蟲取食時(shí),M3神經(jīng)元控制咽的收縮。將孢囊線蟲浸泡在含有章胺的 dsRNA溶液中,章胺會刺激線蟲吸收dsRNA,結(jié)果在多個(gè)組織中表達(dá)的基因發(fā)生沉默,包括小腸、皮下組織、精子、雌蟲生殖系統(tǒng)、側(cè)器和食道腺[10-11]。將根結(jié)線蟲的J2浸泡在含有間苯二酚、章胺或者間苯二酚加羥色胺的dsRNA溶液中,也會使在線蟲小腸和食道腺中表達(dá)的部分基因沉默。同一種根結(jié)線蟲的不同群體對神經(jīng)興奮劑的反應(yīng)不同,所以神經(jīng)興奮劑在刺激根結(jié)線蟲J2攝取溶質(zhì)時(shí)不是必須的[5]。

線蟲浸泡在dsRNA中以后,轉(zhuǎn)錄物枯竭的時(shí)間決定于靶基因的轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄物的代謝速度。在南方根結(jié)線蟲亞腹食道腺中表達(dá)的3個(gè)基因,GST、鈣網(wǎng)蛋白基因和多聚半乳糖基因分別在浸泡后1、16 h和44 h開始有效沉默,說明在一種細(xì)胞中,不同的基因開始沉默的時(shí)間不同[8,12]。線蟲浸泡之后轉(zhuǎn)錄物的枯竭只是暫時(shí)的,在大豆孢囊線蟲中,亞腹食道腺的纖維素酶轉(zhuǎn)錄物在浸泡后6～10 d開始恢復(fù)[13]。在南方根結(jié)線蟲中,GST、鈣網(wǎng)蛋白基因和多聚半乳糖基因的轉(zhuǎn)錄物在浸泡后2～3 d開始恢復(fù)[8,12]。

為了測試大豆孢囊線蟲背食道腺中表達(dá)的兩個(gè)基因能否同時(shí)發(fā)生沉默,Bakhetia等[14]將J2浸泡在靶dsRNA的混合溶液中,但是并沒有觀察到組合沉默的疊加效益表型,可能是因?yàn)閐sRNAs之間或者siRNAs之間存在競爭。

雄性特異性基因msp在J2中沉默以后,其轉(zhuǎn)錄物在線蟲以后的發(fā)育階段中也會缺失。說明J2經(jīng)過處理后,RNAi會持續(xù)幾天[15]。靶基因Cg-1編碼無毒因子,在線蟲中表達(dá)會使線蟲對帶有Mi抗性基因的番茄表現(xiàn)出抗性。用Cg-1的特異性dsRNA處理爪哇根結(jié)線蟲(M.javanica)J2,其中約10%的J2不會誘導(dǎo)Mi抗性番茄產(chǎn)生過敏反應(yīng)(hypersensitive reaction,HR),并且能在抗性植株上正常繁殖[16]。線蟲如果在抗性植株上生長,至少在5代以內(nèi),這種表型是保守的而且顯性會不斷增強(qiáng)。線蟲如果在感病植株上生長,這種表型的顯性會降低[16]。

3 植物介導(dǎo)的RNAi

通過浸泡誘導(dǎo)RNAi的持續(xù)時(shí)間較短,解決這一問題的策略是由寄主向寄生階段的線蟲提供dsRNA。dsRNA在線蟲的取食位點(diǎn)產(chǎn)生,當(dāng)線蟲取食時(shí),dsRNA被攝取。植物介導(dǎo)的RNAi避免了人工刺激線蟲并且源源不斷地提供靶dsRNA。可以利用轉(zhuǎn)化植物實(shí)現(xiàn)植物介導(dǎo)RNAi,該轉(zhuǎn)化植物的線蟲取食位點(diǎn)能夠產(chǎn)生發(fā)卡狀的 dsRNA。發(fā)卡RNA自身互補(bǔ),含有正義和反義克隆長40～800個(gè)核苷酸的編碼區(qū),兩者由100～700個(gè)核苷酸長的非編碼區(qū)隔開。編碼區(qū)和線蟲的靶基因?qū)?yīng),并且和寄主的任何編碼序列都不匹配,避免產(chǎn)生脫靶效應(yīng)。使用這一方法,已經(jīng)使根結(jié)線蟲和孢囊線蟲食道腺中表達(dá)的3個(gè)持家基因和5個(gè)寄生基因發(fā)生了沉默。被穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的植物產(chǎn)生發(fā)卡RNA,當(dāng)線蟲取食這些植株時(shí)就可以觀察到線蟲靶轉(zhuǎn)錄物的缺失。用線蟲的寄生基因16D10的dsRNA轉(zhuǎn)化擬南芥(Arabidopsis thaliana),再接種根結(jié)線蟲,線蟲取食后,根結(jié)的數(shù)量減少了63%～90%[17]。甜菜孢囊線蟲(Heterodera schachtii)取食轉(zhuǎn)基因擬南芥也會降低靶轉(zhuǎn)錄物的量[18]。一種剪接因子和整合酶基因作為RNAi的靶基因,它們的直系同源物在秀麗小桿線蟲中的沉默會引發(fā)秀麗小桿線蟲產(chǎn)生強(qiáng)烈致死表型,植物介導(dǎo)的這兩個(gè)靶基因在南方根結(jié)線蟲中沉默后,導(dǎo)致取食線蟲的敗育[19]。用兩種不同的啟動(dòng)子構(gòu)建載體轉(zhuǎn)化植物,比較它們引起基因沉默的效果,發(fā)現(xiàn)要觸發(fā)線蟲的基因沉默,取食位點(diǎn)細(xì)胞產(chǎn)生的發(fā)卡RNA要達(dá)到一定的閾值水平[20]。目前成功的RNAi使用的都是強(qiáng)啟動(dòng)子,如花椰菜花葉病毒CAMV的35S啟動(dòng)子和擬南芥的ACT2啟動(dòng)子。植物介導(dǎo)的RNAi需要強(qiáng)啟動(dòng)子控制發(fā)卡RNA的合成和許多浸泡程序中高濃度的dsRNA相一致。還不清楚參與植物介導(dǎo)的RNAi分子的本質(zhì),植物細(xì)胞激活自身的RNAi機(jī)制對發(fā)卡 RNA作出反應(yīng),導(dǎo)致發(fā)卡RNA的剪切,并在細(xì)胞質(zhì)中積累siRNAs。已經(jīng)在轉(zhuǎn)化的植物中觀察到了全長的發(fā)卡RNA和siRNAs[17,20-22]。取食的線蟲可能會攝取發(fā)卡RNA和siRNAs。孢囊線蟲中植物介導(dǎo)的RNAi比在根結(jié)線蟲中難。目前只有兩個(gè)研究報(bào)道了在孢囊線蟲中植物介導(dǎo)的 RNAi[21-22],這可能是因?yàn)殒吣揖€蟲從細(xì)胞質(zhì)中吸取營養(yǎng)的取食管比根結(jié)線蟲的小。

構(gòu)建轉(zhuǎn)基因植物的另一種方法是在取食細(xì)胞中產(chǎn)生衍生自病毒的dsRNA。RNA病毒在植物中系統(tǒng)性傳播,它們復(fù)制時(shí)會介導(dǎo)dsRNA分子的合成。將線蟲特異性序列導(dǎo)入病毒載體可以使植物細(xì)胞產(chǎn)生靶dsRNA。一般選擇煙草脆裂病毒(Tobacco rattle virus,TRV)做載體,因?yàn)樗蚋恳苿?dòng),并且在根內(nèi)復(fù)制,而且不會對受侵染的組織造成傷害[23]。TRV可以在甜菜孢囊線蟲誘導(dǎo)的合胞體中有效增殖,而且不會影響線蟲在根部定殖。將甜菜孢囊線蟲的甘油三磷酸脫氫酶GAPDH基因部分序列導(dǎo)入TRV載體能夠誘導(dǎo)取食的雌蟲產(chǎn)生RNAi[24]。TRV也可以在根結(jié)線蟲誘導(dǎo)的巨細(xì)胞中增殖,南方根結(jié)線蟲在接種病毒的植物上生長,也會產(chǎn)生基因沉默[5]。

4 參與互作的植物基因的沉默

植物基因的沉默可用來評價(jià)寄主基因在植物-線蟲互作中的作用。Van de Cappelle等[25]對細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶CDKA進(jìn)行了發(fā)卡RNA介導(dǎo)的RNAi研究,CDKA在線蟲取食細(xì)胞中由WRKY23啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)發(fā)卡RNA的表達(dá),WRKY23啟動(dòng)子在線蟲取食位點(diǎn)高度活化。CDKA的有效沉默中斷了線蟲取食位點(diǎn)的發(fā)育進(jìn)而抑制了孢囊線蟲和根結(jié)線蟲的發(fā)育。

在番茄中,用病毒誘導(dǎo)的基因沉默(VIGS)來鑒定番茄抗線蟲的必需基因。利用VIGS下調(diào)糖基轉(zhuǎn)移酶基因,使Mi-1抗性番茄恢復(fù)了對南方根結(jié)線蟲的易感性。說明糖基轉(zhuǎn)移酶在Mi-1介導(dǎo)的抗性中是必需的[18]。Mi-1不僅使植株對根結(jié)線蟲有抗性而且還對馬鈴薯蚜蟲(Macrosiphum euphorbiae)和煙粉虱(Bemisia tabaci)有抗性。參與抗性早期信號傳導(dǎo)途徑的已知候選基因被 TRV介導(dǎo)的VIGS抑制,再測定植物對線蟲和蚜蟲的抗性。VIGS的靶基因選定Hsp90-1或者stg1,結(jié)果導(dǎo)致Mi-1介導(dǎo)的對線蟲和蚜蟲抗性減弱,這一結(jié)果證明通用組件參與了植物對不同病蟲害的早期防衛(wèi)反應(yīng)[26]。進(jìn)一步的研究表明有絲分裂原激活蛋白激酶MAPK及其上游激酶MAPKK,也是Mi-1介導(dǎo)的蚜蟲抗性的重要組分[27]。

5 RNAi在線蟲基因功能研究中的作用

由于植物寄生線蟲缺乏轉(zhuǎn)化系統(tǒng),而且無法產(chǎn)生和增殖突變系。所以RNAi作為一種重要的工具來分析基因的功能,評價(jià)它們作為靶標(biāo)在發(fā)展新的線蟲防控策略中的效用。在評價(jià)靶基因在某一生物學(xué)過程中的作用時(shí),RNAi引起的和線蟲寄生、發(fā)育或存活力有關(guān)的表型是重要的依據(jù)。

在寄生線蟲中使用RNAi,可能觀察不到表型,甚至是已經(jīng)確定靶轉(zhuǎn)錄物缺失,可能是因?yàn)楸惶幚砭€蟲群體中RNAi的顯性降低,或者靶轉(zhuǎn)錄物的豐度沒有降到所需的閾值水平。盡管將根結(jié)線蟲的J2浸泡在dsRNA溶液中能使靶轉(zhuǎn)錄物的量減少90%[8],但是只有在很低比例的線蟲中能觀察到表型[16]。雖然已經(jīng)確定靶轉(zhuǎn)錄物和蛋白質(zhì)被抑制,但是觀察不到相應(yīng)的表型,可能是由相似基因或相互作用基因的功能冗余造成的。例如,重復(fù)的種內(nèi)同源基因往往部分功能冗余,一個(gè)基因沉默不會產(chǎn)生表型。

對于內(nèi)寄生線蟲,很多情況下某一表型和某一基因功能之間的相關(guān)性并不是直接的。寄生階段的線蟲包埋在根組織中,很難進(jìn)行生理分析。另外對于專性寄生線蟲的表型釋義也很困難。線蟲發(fā)育依靠寄主提供的營養(yǎng)以及寄主細(xì)胞分化為成熟的取食細(xì)胞,因此,誘導(dǎo)取食細(xì)胞產(chǎn)生一個(gè)缺陷就可能導(dǎo)致寄主上寄生線蟲數(shù)量的減少或者雄蟲對雌蟲比例的增加。在寄生階段用于鑒定RNAi表型的手段比較有限。許多表型只能在線蟲發(fā)育失敗時(shí)才能觀察到。相反,非寄生的卵、1齡和2齡幼蟲的表型可以用打分的方式進(jìn)行評價(jià),這些階段的線蟲很容易收集,對靶轉(zhuǎn)錄物或蛋白質(zhì)的缺失進(jìn)行定量分析。浸泡在dsRNA溶液中的卵會出現(xiàn)孵化缺陷或幼蟲發(fā)育缺陷。孵化出的J2可以保存數(shù)天,用于篩選線蟲的存活力、熱敏感性、運(yùn)動(dòng)力或根吸附性[7,9]。在侵染早期,對根組織中運(yùn)動(dòng)的線蟲進(jìn)行染色可以評估靶基因在J2穿刺寄主或遷移中的作用。

植物介導(dǎo)的RNAi可以對取食的線蟲提供持續(xù)的RNAi觸發(fā),使線蟲在整個(gè)寄生階段發(fā)生基因沉默。將寄生線蟲的發(fā)育或寄生所必需的基因作為靶標(biāo)能夠建立防控線蟲的新方法。植物在線蟲的取食細(xì)胞中表達(dá)dsRNA或發(fā)卡 RNA是培育抗性品種的新選擇。植物寄生線蟲能夠遷移到足夠深的土層中逃避農(nóng)藥的毒殺,通過在植物中表達(dá)線蟲必需基因的靶dsRNA培育出的植株能夠吸引線蟲并且抑制線蟲發(fā)育,進(jìn)而有效降低農(nóng)田中的線蟲群體數(shù)量。目前正在利用發(fā)卡RNA介導(dǎo)的RNAi培育抗病毒和抗昆蟲的植物[28-29]。

線蟲門中,對線蟲生物學(xué)起重要作用的基因都是保守的,其中一些在秀麗小桿線蟲中有RNAi表型。研究南方根結(jié)線蟲的基因組發(fā)現(xiàn)了1 083個(gè)基因家族,在秀麗小桿線蟲中它們的種間同源性基因都有RNAi致死表型[30]。如果沒有基因組可用,對EST數(shù)據(jù)庫進(jìn)行研究也可以鑒定防治線蟲的靶基因,利用這種方法從香蕉穿孔線蟲(Radopholus similis)和大豆孢囊線蟲中分別鑒定了659和1 508個(gè)候選靶基因[31-32]。

線蟲建立寄生所必需的基因也可以作為植物介導(dǎo)的RNAi的靶標(biāo)[17]。這一方法的優(yōu)點(diǎn)是許多寄生必須的基因都是特異性的。另外,對取食細(xì)胞形成起關(guān)鍵作用的植物基因發(fā)生沉默也可以有效降低線蟲的群體數(shù)量[25,33]。但是要求嚴(yán)格控制靶dsRNA的表達(dá),避免對植物發(fā)育造成傷害;還要求對線蟲反應(yīng)高度特異的啟動(dòng)子,這樣的啟動(dòng)子可能存在于對線蟲的侵染進(jìn)行上調(diào)的基因中[33]。

6 結(jié)語

植物寄生線蟲的基因組信息越來越多,需要新技術(shù),如比較基因組學(xué)和功能基因組學(xué),從中篩選有價(jià)值的信息。目前正在研究線蟲寄生的進(jìn)化和關(guān)鍵的生物學(xué)過程,包括如何適應(yīng)寄生生活。RNAi雖然有局限性,但是有助于分析功能缺陷表型,是功能基因組學(xué)的一大突破,特別是對缺乏有效轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的線蟲來說更是如此。RNAi有助于研究線蟲寄生的關(guān)鍵因子,為鑒定新的靶標(biāo),建立新的線蟲防控方法提供了可能。但是不同的屬之間,RNAi的效率不同。目前,利用轉(zhuǎn)基因植物介導(dǎo)的RNAi防控根結(jié)線蟲比防控孢囊線蟲更成功。對植物寄生線蟲RNAi機(jī)制的研究有助于提高 RNAi的效率,進(jìn)行大規(guī)模RNAi表型試驗(yàn)。利用多種方法確定基因功能,例如基因沉默,基因表達(dá)圖譜,蛋白質(zhì)活性,鑒定線蟲泌出蛋白的植物配體等更有利于從線蟲基因組中尋找有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值的信息。

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RNA interference(RNAi)and its application to the study of functional genomics in plant parasitic nematodes

Long Hai1,2, Li Fangrong1, Li Yinong1, Zhong Jianzhong1
(1.Shenzhen Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Shenzhen518001,China;2.Shenzhen Academy of Inspection and Quarantine,Shenzhen518045,China)

Recently,the genome sequences ofMeloidogyne incognitaandM.haplahave been published.The sequencing project forHeterodera glycinesandGlobodera pallidais also underway.As of 2008,there has been over 500 000 ESTs and 1.2 million genome sequences from more than 30 nematodes in Nematode.net.Plant nematology is now facing the challenge of developing new technology for screening the practical benefits out of the increasing amounts of genomic information.Given the absence of a transformation system for plant parasitic nematodes,RNAi is likely to be an important tool for the study of functional genomics in phytoparasitic nematode.RNAi and its application to the study of functional genomics in plant parasitic nematodes are introduced in this paper.

phytoparasitic nematode; genomics; ESTs; transformation system; RNAi

S 41-30;S 432.45

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2011.04.002

2010-07-01

2010-10-14

*通信作者E-mail:ly_yinong@126.com