陳華民， 何晨陽(yáng)

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，植物病蟲(chóng)害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193）

1 RNAi基因沉默機(jī)制

RNAi基因沉默 （RNA interference－mediated gene silencing）是由雙鏈RNA（ds RNA）產(chǎn)生的小RNA（s RNAs）（si RNA、ta－si RNA、ra－si RNAs、natsi RNA和mi RNA）引起的［1］，其共同過(guò)程是作為RNAi激發(fā)子的ds RNA被Dicer酶識(shí)別后、切割成21～25個(gè)核苷酸的小干擾RNA（si RNA）片段；si RNA與靶基因mRNA的相應(yīng)序列在RNA誘導(dǎo)基因沉默復(fù)合體（RISC）上進(jìn)行結(jié)合，然后這些短的ds RNAs中的反義鏈特異性地識(shí)別互補(bǔ)mRNA的靶序列，從而在其中間部位進(jìn)行切割或翻譯抑制，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因轉(zhuǎn)錄后或翻譯后調(diào)控。植物細(xì)胞質(zhì)、核中均可發(fā)生RNAi基因沉默［2］。

RNAi基因沉默機(jī)制主要包括：（1）s RNAs通過(guò)與靶標(biāo)序列結(jié)合，在識(shí)別的特異位點(diǎn)對(duì)序列進(jìn)行剪切，形成轉(zhuǎn)錄后的基因沉默［3］；（2）s RNAs通過(guò)與靶標(biāo)序列結(jié)合，造成蛋白翻譯起始障礙，形成蛋白質(zhì)翻譯的沉默［4］；（3）通過(guò)將與s RNA 同源的 DNA 區(qū)域中的胞嘧啶甲基化，形成了s RNA介導(dǎo)的DNA甲基化（Rd DM），即表觀遺傳效應(yīng)［5－7］。植物 RNAi基因沉默通常是通過(guò)剪切靶標(biāo)mRNA，使其不能作為蛋白質(zhì)翻譯的模板，從而抑制基因的表達(dá)。

2 RNAi基因沉默技術(shù)研發(fā)新策略

2．1 基因沉默效果的時(shí)空調(diào)控

由于靶基因表達(dá)需要受到精確的調(diào)控，RNAi基因沉默也需要進(jìn)行時(shí)空調(diào)控。植物體內(nèi)RNAi基因沉默／抑制通常是系統(tǒng)發(fā)生的［8－10］，但在實(shí)際需要中僅沉默部分組織中特定基因，這會(huì)引起其他組織中靶基因表達(dá)的抑制。所以有必要研發(fā)和利用組織特異性啟動(dòng)子、來(lái)調(diào)控基因的沉默效果。此外，基因沉默需要在時(shí)間和強(qiáng)度上的進(jìn)行調(diào)控。通過(guò)篩選不同強(qiáng)度的啟動(dòng)子來(lái)控制ds RNA的表達(dá)，或利用不同的同源序列來(lái)抑制靶基因，可以達(dá)到調(diào)控抑制程度的目的。

2．2 dsRNA的靶定效應(yīng)

RNAi基因沉默需要ds RNA與靶基因序列結(jié)合。如何使ds RNA有效地到達(dá)靶序列所在的部位是RNAi技術(shù)的關(guān)鍵問(wèn)題。通過(guò)沉默與癌癥、病毒侵染和自身免疫紊亂等疾病相關(guān)基因的表達(dá)，RNAi技術(shù)已成為一種有效的疾病治療新策略。在醫(yī)學(xué)和動(dòng)物疾病（尤其病毒?。┑难芯恐邪l(fā)現(xiàn)，dsRNAs可以到達(dá)癌變特異部位［11－13］，而目前在植物中尚未見(jiàn)任何類似的報(bào)道。

2．3 sRNA的人工設(shè)計(jì)

病毒抑制子可以與sRNA結(jié)合抑制后者的基因沉默功能［14］。對(duì)抑制子特異結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行修飾，使其不能與s RNA進(jìn)行正常結(jié)合，可以提高后者的沉默效率，如RHBV病毒抑制子NS3［15］。因此，研究和利用病毒抑制子結(jié)合位點(diǎn)，可以有效地提高基因沉默效率。

miRNAs通過(guò)與反向互補(bǔ)的mRNAs序列結(jié)合，在RISC中進(jìn)行剪切或翻譯后抑制。研究證明mi RNAs可能比ds RNAs更為重要?？梢赃m當(dāng)修飾mi RNA序列、特異性地沉默靶基因，而沉默效果不受影響。

人工設(shè)計(jì)和合成amiRNAs和ana－siRNAs可以解決RNAi脫靶效應(yīng)（非靶標(biāo)基因沉默）。與傳統(tǒng)RNAi技術(shù)相比，ami RNAs特異性更高，可以更精確地預(yù)測(cè)對(duì)潛在的非特異靶標(biāo)的影響。傳統(tǒng)RNAi技術(shù)的siRNAs前體可以形成多個(gè)5′－和3′－序列不同的小RNA，而mi RNAs前體只能形成一個(gè)特定序列的高效s RNA。因此，ami RNAs技術(shù)在更大程度上規(guī)避了對(duì)相似序列的非靶標(biāo)基因的影響。此外，ami RNAs基因沉默效果不僅依賴于自身特性，而且依賴于靶標(biāo)基因mRNAs的局部結(jié)構(gòu)［16］。因此，人工設(shè)計(jì)和合成amiRNAs時(shí)，需要特別考慮靶基因序列的結(jié)構(gòu)。

ta－siRNAs是一類內(nèi)源的sRNAs，產(chǎn)生于非編碼TAS基因介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的4個(gè)家族，負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄后的基因調(diào)控［17］。ta－siRNAs的形成涉及21nt的siRNAs和miRNAs指導(dǎo)的切割，以miRNAs和siRNAs的序列為模板，聚合形成的次級(jí)RNA小片段。盡管ami RNAs載體的可預(yù)測(cè)性高、不易脫靶，但ata－siRNAs方法更為實(shí)用，因?yàn)樗子诙鄠€(gè)功能小RNAs序列融合進(jìn)一個(gè)載體中，從而可以創(chuàng)建具有多抗功能的轉(zhuǎn)基因植物［18］。

2．4 amiRNAs和ata－siRNAs的應(yīng)用

amiRNAs對(duì)病毒抑制子的沉默。與hp－RNA產(chǎn)生的沉默效果相比，靶向CMV抑制子2 b的amiRNA方法在瞬時(shí)表達(dá)、穩(wěn)定轉(zhuǎn)化方面效果更好［19］。靶向株系特異序列或不同株系間保守序列的轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)對(duì)CMV廣譜抗性［19］。擬南芥mi R159通過(guò)修飾擬南芥mi R159的前體來(lái)靶向兩個(gè)病 毒 抑 制 子 序 列 （P69、HC－Pr o）。ami RNAP69159和amiRNA－HC－Pro159轉(zhuǎn)基因植株分別具有對(duì)TYMV和Tu MV的抗性，而表達(dá)兩者的植株表達(dá)對(duì)兩個(gè)病毒都具有很強(qiáng)的抗性［20］。

ata－siRNAs對(duì)報(bào)告基因FAD2的沉默。FAD2是擬南芥基因沉默分析的報(bào)告基因，單拷貝，表型易檢測(cè)定量分析［21］。用ata－siRNAs序列沉默F(xiàn)AD2基因，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株FAD2活性水平與f ad2突變體一樣，達(dá)到了基因沉默效果［22］。

3 RNAi技術(shù)在植物抗病性遺傳改良中的應(yīng)用

RNAi技術(shù)已經(jīng)在病原物（真菌、細(xì)菌、病毒和線蟲(chóng)）基因沉默方面得到了廣泛應(yīng)用，產(chǎn)生了一批抗病性增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因植物。

3．1 植物真菌病害的抗性改良

通過(guò)表達(dá)白粉病菌致病因子Avra10的RNA同源序列，轉(zhuǎn)基因植物表現(xiàn)出對(duì)白粉病的抗性［23］。其機(jī)制是植物dsRNA分子可能進(jìn)入了病原真菌體內(nèi)，從而導(dǎo)致了真菌基因的沉默（HIGS）。這一結(jié)果提供了一個(gè)基于RNAi的植物抗真菌病害遺傳改良新策略。

3．2 植物細(xì)菌病害的抗性改良

根癌農(nóng)桿菌iaa M和ipt基因沉默后，轉(zhuǎn)基因植物對(duì)冠癭瘤形成具有較高的抗性［24］。iaa M編碼色氨酸單加氧酶，將色氨酸轉(zhuǎn)變成生長(zhǎng)素前體吲哚乙酰胺［25］；ipt編碼產(chǎn)物促成A MP和異戊烯基焦磷酸鹽的濃縮，并形成細(xì)胞分裂素（玉米素）［26］。這兩個(gè)基因的表達(dá)是冠癭瘤形成所必需的。用靶向iaa M和ipt的RNAi載體轉(zhuǎn)化擬南芥和番茄植株，轉(zhuǎn)基因植物腫瘤形成得到明顯的抑制。

3．3 植物病毒病害的抗性改良

水稻條紋葉枯?。≧SV）CP、SP和CP／SP蛋白、水稻矮縮病毒（RDV）Pns12蛋白、玉米矮花葉病毒（MDMV）CP蛋白、菜豆金黃花葉病毒（BGMV）復(fù)制起始因子AC1基因沉默／抑制后，轉(zhuǎn)基因植株對(duì)病毒病抗性明顯提高［27－29］。

不同編碼基因沉默導(dǎo)致的病毒抗性是有明顯差異的，靶基因的選擇至關(guān)重要。例如RSV編碼蛋白p C3和運(yùn)動(dòng)蛋白p C4沉默轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)高抗，而編碼糖蛋白p C2和無(wú)結(jié)構(gòu)蛋白p4的沉默對(duì)抗性沒(méi)有影響［30］。

病毒誘導(dǎo)的基因沉默（VIGS）常受限于病毒的寄主范圍。因此，直接噴灑原核表達(dá)的si RNAs也可誘導(dǎo)植物基因沉默，如在接種病毒前5 d，噴灑辣椒輕斑駁病毒（PMMo V）和李痘皰病毒（PPV）的ds RNA，可成功誘導(dǎo)相關(guān)基因的沉默，產(chǎn)生對(duì)病毒侵染的抗性［31］。

3．4 植物線蟲(chóng)病害的抗性改良

表達(dá)根結(jié)線蟲(chóng)基因ds RNA序列的煙草對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)的抗性高達(dá)95%以上［32］。表達(dá)線蟲(chóng)16D10基因ds RNA序列的擬南芥抑制了線蟲(chóng)蟲(chóng)癭的形成、減少了蟲(chóng)卵產(chǎn)生；轉(zhuǎn)基因植株對(duì)其他種線蟲(chóng)也具有一定的抗性［33］。

4 結(jié)束語(yǔ)

RNAi基因沉默技術(shù)因其特異性、高效性和遺傳可操作性，已經(jīng)成為當(dāng)今植物基因功能研究和作物遺傳改良的一個(gè)重要手段，正在迅速得到廣泛的應(yīng)用。近年來(lái)，隨著研發(fā)工作的不斷深入，該技術(shù)得到了極大的提高和完善。例如利用組織特異性和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，將使基因沉默的時(shí)空調(diào)控能力得以提高，從而使RNAi脫靶效應(yīng)降至最小［34］。本實(shí)驗(yàn)室正在利用從水稻葉片中克隆到的、受病原細(xì)菌和信號(hào)分子誘導(dǎo)的、維管束組織特異性表達(dá)的啟動(dòng)子Os BTF3－p［35］，驅(qū)動(dòng) RNAi基因沉默載體（待發(fā)表）。

挖掘更多組織特異性和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，將是加快RNAi技術(shù)在作物遺傳改良中應(yīng)用的重要任務(wù)之一。ami RNAs和ata－si RNAs的研發(fā)也加快了RNAi基因沉默技術(shù)的應(yīng)用［18］。

在與植物互作過(guò)程中，病原真菌可能通過(guò)吸器、線蟲(chóng)通過(guò)口針刺吸、病毒通過(guò)RNA或DNA分子進(jìn)入、根癌農(nóng)桿菌通過(guò)T－DNA整合，與寄主植物細(xì)胞進(jìn)行核酸類物質(zhì)的分子交流。這些為進(jìn)行RNAi基因沉默提供了科學(xué)基礎(chǔ)和依據(jù)。然而，至今尚不清楚其他病原細(xì)菌與植物間是否存在核酸分子的交流。對(duì)此需要進(jìn)行深入的研究，為植物抗細(xì)菌病害改良提出新的思路。

RNAi技術(shù)需要不斷地改進(jìn)和完善才能得以充分的利用。需要不斷地鑒定和發(fā)掘病原物致病因子基因、植物感病因子基因用作RNAi靶標(biāo)；構(gòu)建和設(shè)計(jì)將多個(gè)基因定位在一個(gè)RNAi載體中，有效地降低病原物變異造成的抗病性喪失的幾率，解決作物持久抗病性的改良問(wèn)題。

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