王帥宇, 雷仲仁, 董保信, 任寶珍, 盧增全

(1.中國農業(yè)科學院植物保護研究所,北京 100193; 2.山東省植物保護總站,濟南 250100)

分子標記技術在斑潛蠅中的應用進展

王帥宇1,2, 雷仲仁1*, 董保信2, 任寶珍2, 盧增全2

(1.中國農業(yè)科學院植物保護研究所,北京 100193; 2.山東省植物保護總站,濟南 250100)

斑潛蠅是農作物、蔬菜和花卉等植物上的重要害蟲,尤其是美洲斑潛蠅、南美斑潛蠅和三葉斑潛蠅的入侵,給我國農業(yè)生產(chǎn)和對外貿易帶來重大損失。采用傳統(tǒng)的形態(tài)學分類特征對斑潛蠅進行鑒定極易混淆,更難進行地理分布與遺傳多樣性分析,近年來迅速發(fā)展的分子標記技術為解決斑潛蠅遺傳及鑒定等問題提供了有效的手段。本文主要概述了DNA分子標記技術在斑潛蠅的分子鑒定、地理分布及傳播途徑、種群遺傳分化及種間雜交等方面的應用現(xiàn)狀,并對其應用前景進行了展望。

分子標記技術; 斑潛蠅; 分子鑒定; 傳播途徑; 種群遺傳分化

斑潛蠅屬于雙翅目(Diptera)、潛蠅科(Agromyzidae)、植潛蠅亞科(Phytomynidae)。其中美洲斑潛蠅(Liriomyza sativae)、南美斑潛蠅(L.huidobrensis)、三葉斑潛蠅(L.tri folii)等是世界重要的檢疫性害蟲,其暴發(fā)為害時給農作物、蔬菜和花卉等帶來巨大損失,嚴重時甚至可導致作物絕產(chǎn)[1]。近年來,斑潛蠅仍在不斷擴散,目前在南、北美洲、大洋洲、非洲和亞洲等30多個國家均有發(fā)生,嚴重威脅分布地的農作物、蔬菜、花卉等安全生產(chǎn)。

由于斑潛蠅個體較小,并且很多種類形態(tài)上極其相似,僅依靠傳統(tǒng)的形態(tài)學鑒定很難區(qū)分。同時,斑潛蠅作為一種入侵害蟲,對其傳入途徑和地理分布與遺傳多樣性的了解,可為其持續(xù)控制提供更多的科學依據(jù),而獲得這些信息,傳統(tǒng)的形態(tài)學與生理生化方法很難實現(xiàn)。分子標記技術具有信息含量高、多態(tài)性好、穩(wěn)定性高、不易受環(huán)境變化和發(fā)育情況影響等優(yōu)點,在揭示物種不同水平的遺傳變異研究中有其獨特的優(yōu)勢。目前多種分子標記技術已廣泛用于昆蟲學研究[2-5],限制性內切酶片段長度多態(tài)性、隨機擴增多態(tài)性DNA以及核內與線粒體部分基因序列等已逐步應用于斑潛蠅研究[6-10]。本文概述了DNA分子標記技術及其在斑潛蠅中的應用現(xiàn)狀,并對其在斑潛蠅的應用前景進行了分析和展望。

1 DNA分子標記概述

DNA分子標記技術發(fā)展主要分為3個階段:第1代分子標記是由Botesin提出的限制性片段長度多態(tài)性(restrictionfragmentlengthpolymorphisms,RFLP)。對于RFLP而言,主要是存在大量不同識別位點的限制性內切酶與基于高變區(qū)內的大量探針可供選擇。但由于需要使用放射性標記的探針,安全性低而且試驗成本增加。改良后的PCRRFLP,雖不需要標記及探針,酶切后產(chǎn)物可直接電泳,但如果片段太小或距離過近,將會影響對試驗結果分析。第2代分子標記以PCR技術為核心,包括以隨機擴增多態(tài)性DNA(random amplified polymorphic DNA,RAPD)、擴增片段長度多態(tài)性(amplified fragment length polymorphism,AFLP)、簡單重復序列(simple sequence repeat,SSR)、簡單序列重復區(qū)間擴增多態(tài)性(inter-simple sequence repeat,ISSR)等分子標記。隨著技術的不斷發(fā)展,大大降低了對樣品數(shù)量和質量要求。方法簡單,省時省力,而且穩(wěn)定性和多態(tài)性高,為研究帶來很大便利。另外,利用PCR技術對特定DNA區(qū)域擴增,如對核糖體DNA和線粒體DNA一些基因片段的研究,因其直觀性和真實性也受到研究者的青睞,目前已得到廣泛應用。第3代分子標記以單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)為主,是個體間由完全相同序列界定的單個核苷酸的差異(單堿基轉換、顛換、插入和缺失),建立在DNA芯片技術的基礎上,與其他分子標記相比,SNP分辨率最高也最為豐富,覆蓋基因組范圍大,遺傳上也較穩(wěn)定[11-15]。

上述每種分子標記均有各自的優(yōu)缺點,無法滿足理想的遺傳標記的所有要求,使用中應根據(jù)研究的需要選擇相應的標記技術。

2 斑潛蠅的分子鑒定

斑潛蠅屬內有多種在形態(tài)上極其相似,如南美斑潛蠅、番茄斑潛蠅、美洲斑潛蠅、三葉斑潛蠅等,僅依靠形態(tài)學特征很難區(qū)分。并且斑潛蠅種內存在高度的遺傳分化,甚至存在隱種[9,16],正確鑒定其種類是可持續(xù)控制的基礎,對于制定科學有效的綜合治理策略具有重要的指導意義。

當前在斑潛蠅近緣種鑒定應用較多的為mtDNA基因組中的COⅠ、COⅡ基因序列和rDNA的ITS區(qū)域。其中,Ochando等和邱一中等采用RAPD-PCR方法分別得到了南美斑潛蠅的特異條帶和鑒定6種斑潛蠅的3條引物[5,7],初步實現(xiàn)了斑潛蠅的分子鑒定,但RAPD存在重復性差等缺點。Masetti等運用RFLP-PCR,以COⅠ序列為靶標,對同時發(fā)生在意大利的萵苣類作物上的南美斑潛蠅、三葉斑潛蠅和番茄斑潛蠅進行了研究,得到了南美斑潛蠅特異性酶切位點,從而可從分子水平快速有效地區(qū)分南美斑潛蠅與三葉斑潛蠅和番茄斑潛蠅[6]。管維等通過擴增三葉斑潛蠅和美洲斑潛蠅的ITS序列,進一步篩選得到了可以區(qū)分三葉斑潛蠅和美洲斑潛蠅的特異性酶切位點[11]。最近,陳萍等在原來研究的基礎上,通過分析斑潛蠅COⅡ基因序列變異,采用3種限制性內切酶,得到了三葉斑潛蠅、美洲斑潛蠅、南美斑潛蠅、番茄斑潛蠅和蔥斑潛蠅的特征酶切位點,建立了PCR-RFLP分子標記對該5種斑潛蠅種類的檢測鑒定方法[17-18],此方法比RAPD結果更穩(wěn)定可靠,但PCR擴增完成后需再進行酶切,降低了檢測的時效性。

另外,一些學者通過直接比較不同基因序列差異來獲得用于鑒定斑潛蠅的分子標記,Scheffer通過直接比較線粒體DNA中的COⅠ和COⅡ基因序列變化,證明美國南美斑潛蠅有隱種(cryptic species)存在,美國北部的南美斑潛蠅與南部和中部的南美斑潛蠅相比有明顯的變異,認為北部的斑潛蠅應為L.langei,它不是南美斑潛蠅的同物異名,而是不同種[16]。馮賢等建立了利用COⅠ序列鑒定三葉斑潛蠅的實時鑒定體系,王莉萍在ITS序列中找到了不同近緣種的特異性識別位點,可以作為美洲斑潛蠅與其他3個近緣種種間鑒別的分子標記[8]。Miura利用多重PCR對番茄上的三葉斑潛蠅和美洲斑潛蠅的COⅠ序列進行了擴增,三葉斑潛蠅可擴增出2條帶,而美洲斑潛蠅擴增出3條帶片段,而且不同地理區(qū)域,性別、發(fā)育周期結果一致,實現(xiàn)了簡單快速區(qū)分兩近緣種[19]。利用DNA直接測序,結果更直觀,更準確,但成本高、周期長。從上述研究結果可以看出,分子標記技術的發(fā)展為斑潛蠅近緣種的分子鑒定提供了豐富的證據(jù)。但這些方法各有優(yōu)缺點,今后還需要在這些結果的基礎上,進一步尋找簡便、快速、高效、準確的近緣種鑒定分子標記,實現(xiàn)通過常規(guī)PCR擴增直接檢測條帶有無或片段長度大小差異即可區(qū)分近緣種。

3 斑潛蠅的地理分布與傳播途徑分析

了解斑潛蠅的地理分布及其傳播途徑,對于明確其入侵過程,尋找及引進天敵,闡明斑潛蠅在入侵過程中或入侵后的生物學變化,預測入侵定殖后的生物學特性以及借鑒有效的防治措施等具有重要的意義。

Scheffer利用 COⅠ和 COⅡ基因序列聯(lián)合分析,認為世界很多區(qū)域的南美斑潛蠅都是從美洲的南部和中部傳入的[16]。何麗萍運用線粒體DNA中的COⅡ基因序列研究南美斑潛蠅在云南的分布、起源,得出云南的南美斑潛蠅與美洲的不同種群在基因樹上聚為一類,親緣關系最近,也得出了云南的南美斑潛蠅乃是從美洲傳入的,這與Scheffer得到的結果一致[16,20]。但利用分子標記技術研究斑潛蠅的地理分布和傳播途徑分析還未見報道。另外,外來入侵種傳播方式復雜,能夠成功定殖有可能經(jīng)歷了多次入侵,而且定殖后又可能成為新的入侵源[21],這就需要進一步擴大分子標記技術在斑潛蠅研究中的應用范圍,從多方面對不同地區(qū)、不同種類斑潛蠅進行更系統(tǒng)、更深入的研究。

4 斑潛蠅種群的遺傳分化

斑潛蠅作為外來入侵物種,在入侵過程中,不同種群在食性、生長發(fā)育、繁殖、抗藥性等方面發(fā)生了很大的變化,這可能與種群基因突變、基因流動、遺傳漂變、選擇壓力等有關,對其遺傳機制的研究主要借助于分子生物學手段。而分子標記技術的發(fā)展,大大促進了斑潛蠅種群遺傳結構的研究。

Morgan首先采用RAPD-PCR分別檢測了南美斑潛蠅和三葉斑潛蠅在加利福尼亞中部和南部兩地理種群間的差異,其中南美斑潛蠅的兩個地理種群經(jīng)RAPD分析有差異,但三葉斑潛蠅不同地理種群間無差異,經(jīng)過進一步分析得出:南美斑潛蠅種群間變異主要歸因于地理分布,而三葉斑潛蠅的種群間變異與寄主偏好性相關[3]。何麗萍等擴增云南南美斑潛蠅的COⅡ基因序列發(fā)現(xiàn),云南不同地理種群無明顯差異,同時也比較了其與斯里蘭卡、以色列及印度尼西亞3個亞洲國家及厄瓜多爾、危地馬拉及美國3個美洲國家不同種群的親緣關系,分析結果認為云南的南美斑潛蠅不同種群和美洲的不同種群親緣關系最近,進而推論云南的南美斑潛蠅可能來自美洲[20]。杜予州、王莉萍等對國內美洲斑潛蠅ITS1和β-tubulin序列進行了分析,結果表明:國內不同地理種群及寄主種群均有一定分化,但分化程度較低[22-25]。馮賢比較了分別來自亞洲、歐洲、美洲8個不同國家的三葉斑潛蠅的COⅠ序列差異,認為不同國家和地區(qū)的三葉斑潛蠅種群之間目前無明顯分化[8]。而Scheffer利用COⅠ基因對三葉斑潛蠅進行了分析,認為三葉斑潛蠅種內已發(fā)生了高度分化,專食辣椒的三葉斑潛蠅可能形成了新的寄主宗甚至新種,而且不同種群的COⅠ高度多態(tài)性也表明了三葉斑潛蠅在定殖過程中經(jīng)歷了一個或多個瓶頸[9]。從以上結果可知,目前國內報道的南美斑潛蠅、美洲斑潛蠅和三葉斑潛蠅不同種群均無明顯分化,而國外已報道三葉斑潛蠅種內不同寄主種群已高度分化形成新的寄主宗,來自亞洲、歐洲、美洲等地區(qū)8個國家的三葉斑潛蠅不同地理種群無明顯分化,而來自亞洲、美洲等地區(qū)7個國家的南美斑潛蠅種群出現(xiàn)一定程度的分化。

5 種間雜交分析

不同種類斑潛蠅在生態(tài)適應性方面有明顯差異[25],種間雜交有可能結合兩種的優(yōu)勢而產(chǎn)生新的適應性更強的種類,給防治帶來困難,所以監(jiān)測其種間雜交情況具有非常重要的意義。不同的分子標記技術可以有效地鑒別物種的種間雜交,但目前在斑潛蠅中的研究還處于起步階段,僅Sakamaki研究了美洲斑潛蠅和三葉斑潛蠅的雜交行為。結果表明雜交僅發(fā)生于美洲斑潛蠅雌蟲和三葉斑潛蠅雄蟲,后代全為雌蟲,利用ITS序列和COⅠ序列分別對三葉斑潛蠅和美洲斑潛蠅雜交后代作了分析,后代同時具有美洲斑潛蠅和三葉斑潛蠅的分子特征,證明后代確實是雜交產(chǎn)生,而不是孤雌生殖的后代[26]。

6 展望

目前國內外關于斑潛蠅DNA分子標記應用的研究主要集中在rDNA的ITS序列和mtDNA的COⅠ和COⅡ基因序列,由于很多種斑潛蠅屬于重要的世界檢疫性害蟲,這就要求對其分子鑒定必須快速、準確、經(jīng)濟、簡便?，F(xiàn)在雖有一些研究工作得到了可區(qū)分近緣種的分子標記,但缺乏普遍公認的可同時鑒別多個近緣種的簡便且有效的分子鑒定技術。近年來迅速發(fā)展起來的DNA條形碼技術被公認為能夠準確地進行物種鑒定,而且操作快速簡便[27],DNA條形碼技術的關鍵是DNA條形碼的確立,可以通過遺傳多態(tài)性分析和比較基因組學的方法找到合適的DNA序列作為DNA條形碼用于斑潛蠅的分子鑒定。另外,對于斑潛蠅種間雜交、種群分化、起源及傳播途徑等方面的研究,可采用具有試驗程序簡單、快速、穩(wěn)定性高、重復性好、多態(tài)性豐富、遺傳信息量大等優(yōu)點的SSR標記和ISSR標記等技術,獲得有關斑潛蠅入侵的來源、雜交和基因滲透、瓶頸效應以及入侵因素、物種進化和系統(tǒng)發(fā)生等等多方面信息[12-13]。在今后的研究中,可針對斑潛蠅研究的不同目標,借鑒其他入侵生物研究中的分子標記技術應用經(jīng)驗,采用高效的DNA分子標記技術對斑潛蠅進行更全面、更深入的研究,從分子水平為斑潛蠅研究提供有益的補充和佐證。

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App lications of molecular markers in Liriomyza

W ang Shuaiyu1,2, Lei Zhongren1, Dong Baoxin2, Ren Baozhen2, Lu Zengquan2
(1.State Key Laboratory for Biology o f Plant Diseases and Insect Pests,Institute of Plant Protection,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Beijing100193,China;2.The General Station o f Plant Protection in Shandong,Ji’nan250100,China)

The leaf m iners are the main pest of farm and horticultural crops.A fter invading China,Liriomyza sa

tivae,L.huidobrensisandL.trifo liihad caused great losses in agricultural p roduction and export trade.It is very difficult to identify closely-related species and analyze the geographical distribution and genetic diversity o f populations only based on the morphological charac ters.Mo lecu lar m arkers have been imp roved rapidly in recent years,w hich are ef ficient in solving some essential issues in the identification of related species and genetic differentiation inLiriomyza.In this paper,the applications of m olecular m arker techniques in m olecular identification,geographic distribution,sp read pattern,population genetic variation and hybridization ofLiriomyzawere reviewed,and the application prospects are also discussed.

molecular m arker technique;Liriomyza; molecular identification; spread path; population genetic differen tiation

Q 969.464.2

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2011.02.001

2010-03-11

2010-03-30

國家重點基礎研究發(fā)展計劃(“973”)項目(2009CB119000);國家科技支撐計劃(2006BAD08A 17,2006BAD08A08);國家大宗蔬菜產(chǎn)業(yè)技術體系(gw zj)

*通信作者E-mail:leizhr@sina.com