青島農(nóng)業(yè)大學(xué)優(yōu)質(zhì)水禽研究所 王曉曉 王寶維* 王 鑫

青島康大分析檢測有限公司 逄淑梅

青島康大食品有限公司 孫 超

黃曲霉毒素（Aflatoxins，AF）是由某些存在于糧食和飼料上的黃曲霉菌（Aspergillus flavus）產(chǎn)生的有毒代謝產(chǎn)物，是最常見的一類真菌毒素，它具有很強(qiáng)的致癌、致畸和致突變的作用，對人和動物都有很強(qiáng)的毒性（李敏等，2008；譚清華，2008）。黃曲霉多生長在含水量高的作物中，如：玉米、稻谷、棉籽粕、豆類等，在溫暖潮濕的環(huán)境中大量繁殖并產(chǎn)生毒素（潘耀榮，2008；蔡雙雙，2007）。 目前，飼料中AF的污染現(xiàn)象普遍存在，已引起人們的廣泛關(guān)注（史瑩華，2007）。

AF是一類結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)相似的真菌次級代謝物，目前已發(fā)現(xiàn)有20種之多，已確定結(jié)構(gòu)的有黃曲霉毒素 B1（AFB1）、黃曲霉毒素 B2（AFB2）、黃曲霉毒素M1（AFM1）等18種，它們的基本結(jié)構(gòu)中都含有二呋喃環(huán)和氧雜萘鄰?fù)?，前者為其毒性結(jié)構(gòu)，后者可能與其致癌有關(guān)（馬志科，2009）。

1 對畜禽的危害

1.1 對實(shí)質(zhì)器官的損害 在AF中，已知毒性大小的排列順序?yàn)锳FB1＞AFM11＞AFG1＞AFB2＞AFG，AFB1是已知最強(qiáng)的經(jīng)口致癌物質(zhì)，以損壞動物肝臟為主要特征。AF是一種毒性極強(qiáng)的肝毒素，對所有動物都可引起肝損傷，還對腎臟等其他多種組織器官也能造成嚴(yán)重?fù)p壞。豬只中毒的主要表現(xiàn)為：肝小葉中央靜脈周圍肝細(xì)胞凝固性壞死和出血，肝臟顯著結(jié)節(jié)性增生，膽囊水腫，黏膜下肌層和漿膜下積液，最終常因嚴(yán)重肝臟出血而死亡。在家禽中毒早期肝臟先萎縮，隨著時間延長，脂肪在肝臟沉積并出現(xiàn)明顯的肝腫大。牛AF中毒時，除肝臟損傷外，皮膚對光敏感，下顎水腫，下痢，有時還出現(xiàn)嚴(yán)重的角膜結(jié)膜炎。奶牛臨床特征是消化機(jī)能紊亂、神經(jīng)癥狀和流產(chǎn)；剖檢見肝變性、壞死和纖維化硬變（高景喜等，2008）。

1.2 致癌、致畸、致細(xì)胞突變 AF具有致癌、致畸和致突變作用，其毒性是砒霜的68倍，是氰化鉀的10倍（陳麗玲和劉汝文，2006）。長期食入含有AF的飼料可使動物發(fā)生肝癌，AFB1是蛋白質(zhì)合成的有效抑制劑，能夠影響原始細(xì)胞發(fā)育和胎兒的分化，從而發(fā)揮致畸作用。AF暴露與P53基因突變一致，AFB1解毒酶變異、AFB1加成物、P53基因突變與肝癌發(fā)生有關(guān)（陸東東，2001）。據(jù)報道，黃曲霉毒素B1對大鼠致肝癌的強(qiáng)度要比二甲基亞硝胺高75倍，比二甲基偶氨苯高900倍，人的原發(fā)性肝癌也很可能與AF有關(guān)（馬文奎，2009）。

1.3 抑制免疫機(jī)能 AF主要作用于細(xì)胞免疫，AF能與DNA和RNA結(jié)合，并對其合成有抑制作用，AF影響蛋白質(zhì)合成，可能是抑制機(jī)體免疫機(jī)能的主要原因之一。AFB1通過不同方式作用于淋巴組織而影響免疫功能，主要引起胸腺萎縮和發(fā)育不良，使火雞體內(nèi)干擾素產(chǎn)生延遲、淋巴因子的激活延遲、淋巴細(xì)胞生成減少。AFB還影響肝臟和巨噬細(xì)胞功能，從而抑制補(bǔ)體（C4）的產(chǎn)生。黃曲霉毒素對仔豬免疫機(jī)能也有影響，從而使仔豬對其他疾病的抵抗力也相應(yīng)降低（王榮梅等，2010；陳興樣和黃克和，2002）。AF對豬體的毒性作用取決于攝入量，當(dāng)飼料中含有相當(dāng)數(shù)量的AF時，會出現(xiàn)臨床癥狀，豬長期攝入少量的AF，雖不會出現(xiàn)明顯的中毒癥狀，但能損害豬體的免疫機(jī)能，從而引起豬體對其他疾病的抵抗力下降，引起繼發(fā)性傳染病，影響生產(chǎn)繁殖。

1.4 降低畜禽的生產(chǎn)性能 AF中毒常見于幼齡的雞、鴨和火雞，特別是以2～6周齡的雛雞和幼鴨敏感性最高（馮梅菊，2008）。AF對家禽生產(chǎn)性能的影響主要是：動物采食量降低，家禽生長緩慢，日增重以及飼料轉(zhuǎn)化效率降低（馬志科，2009）。被霉菌污染的飼料，營養(yǎng)物質(zhì)含量降低，散發(fā)霉味，飼料感官性質(zhì)惡化，適口性差，家禽的體重和采食量下降。飼喂霉變飼料，母豬產(chǎn)仔率明顯下降，所產(chǎn)仔豬的弱仔數(shù)和死亡數(shù)相對升高。徐建雄（2003）報道，給1日齡肉雞飼喂含AF 0.75 mg/kg的日糧，28 d后即發(fā)現(xiàn)雞體增重和采食量顯著下降。給肉雞飼喂含AF 1 mg/kg的日糧，飼喂到7 d或14 d時，肉雞生長未受到明顯影響，飼喂到21 d時，肉雞增重和采食量顯著下降。可見致死量水平以下的AF，對肉雞生長的影響是長期連續(xù)攝入毒素在體內(nèi)蓄積的結(jié)果。

AF是一種高毒性、高誘變性和高致癌性的化合物，家畜的敏感順序?yàn)樽胸i ＞犢牛 ＞育肥豬（馬文奎，2009）。斷奶仔豬飼喂含AF 0.5 mg/kg的日糧28 d，采食量降低31%，日增重降低30%（李盛唐和何穎，2008；徐運(yùn)杰和方熱軍，2008）。

AF對仔豬的危害最大，死亡率較高。AF可降低淀粉酶及蛋白酶、脂肪酶在消化碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂肪和各種核酸時的作用，破壞消化酶的活性，阻礙機(jī)體對基本營養(yǎng)物的吸收，造成豬體消化機(jī)能紊亂，食欲減退，營養(yǎng)不良，貧血，增重減緩和生長發(fā)育停滯等。

1.5 破壞代謝功能 AF可引起脂類水平上升。中毒的豬表現(xiàn)出肝細(xì)胞的脂肪浸潤和脂肪沉積，這是脂肪溶解能力下降，脂類代謝受干擾的結(jié)果。毒素能使DNA和RNA的前體進(jìn)入細(xì)胞核，干擾蛋白質(zhì)的合成，造成抗體生成受阻和血凝因子水平降低。由于毒素引起消化酶合成減少，因而導(dǎo)致養(yǎng)分的消化和吸收水平降低，也使氨基酸的吸收受到干擾。由于毒素在肝臟中蓄積降低了肝微粒體葡萄糖-6-磷酸酶的活性，造成肝臟機(jī)能紊亂，從而使血清中乳酸脫氫酶、天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶、總膽紅素指標(biāo)明顯升高。

1.6 損害生殖功能 AF中毒后會引起母豬流產(chǎn)，產(chǎn)弱仔、死胎和木乃伊胎，產(chǎn)仔數(shù)減少，仔豬成活率降低（劉春凌等，2009）。母豬的卵巢畸形，子宮黏膜對雌性激素感受性受到抑制。AF還能導(dǎo)致子宮擴(kuò)張、腫脹及卵巢萎縮等癥狀，引起母豬發(fā)情周期延長、繁殖力下降，公畜睪丸萎縮，雌性化。

2 AF的檢測方法

AF測定方法有薄層色譜法（TLC）、高效液相色譜法（HPLC），酶聯(lián)免疫法（ELASA）和放射免疫法（RIA）等。

2.1 薄層層析法 薄層層析法（TLC）是測定AF的經(jīng)典方法，其原理是將樣品經(jīng)過提取、柱層析、洗脫、濃縮、薄層分離后，在波長365 nm紫外光下產(chǎn)生藍(lán)紫色或黃綠色熒光，并根據(jù)其在薄層上顯示的最低檢出量來確定其含量。國家標(biāo)準(zhǔn) “食品中AFB的測定”以及美國藥典都采用了TLC法（單向或雙向展開）檢測。

2.2 高效液相色譜法 高效液相色譜法具有高效、快速、準(zhǔn)確性好、靈敏度高、重現(xiàn)性好、檢測限低等優(yōu)點(diǎn)，近年來在食品、飼料和中草藥材AF測定中得到越來越廣泛的應(yīng)用。樣品經(jīng)提取、凈化后，選擇適宜的流動相通過高效液相色譜柱，使多種AF同時分離出來，用熒光檢測器檢測。Manetta（2005）采用了溴化吡啶作為柱后衍生劑，HPLC結(jié)合熒光檢測器測定牛奶和奶酪中的AFM1的含量，該方法靈敏度達(dá)到1～5 ng/kg，在實(shí)現(xiàn)快速、自動化的前提下達(dá)到精確和準(zhǔn)確測定AFM1的含量。

2.3 親和柱高效液相色譜法 親和柱高效液相色譜法（IAG～HPLC）方法具有快速、高效、靈敏、準(zhǔn)確、方便、安全、易于推廣等優(yōu)點(diǎn)，因此是目前最為先進(jìn)的一種分析方法，國際標(biāo)準(zhǔn)化組織（ISO）已將該法列為國際標(biāo)準(zhǔn)方法。該方法的原理是利用抗原抗體的特異性吸附特性，親和柱只能特異性、選擇性地吸附AF而其他雜質(zhì)則順利通過柱子，然后再利用洗脫液將AF洗脫下來。該方法簡化了樣品的前處理過程，同時利用高效液相色譜進(jìn)行定量和定性，可以同時測出AF的總量和AFM1、AFB1、AFB2、AFG1、AFG2 含量。 李佐卿等（2005）采用IAG－HPLC快速測定牛奶和奶粉中的 AFM1、AFB1、AFB2、AFG1、AFG2 的含量。

2.4 競爭性酶聯(lián)免疫吸附法 ELISA法是在免疫學(xué)和細(xì)胞工程學(xué)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種微量檢測技術(shù)。其原理是將已知抗原吸附在固態(tài)載體表面，洗除未吸附抗原，加入一定量抗體與待測樣品（含有抗原）提取液的混合液，競爭培養(yǎng)后，在固相載體表面形成抗原抗體復(fù)合物。洗除多余抗體成分，然后加入酶標(biāo)記的抗球蛋白的第二抗體結(jié)合物，與吸附在固體表面的抗原抗體結(jié)合物相結(jié)合，再加入酶底物。在酶的催化作用下，底物發(fā)生降解反應(yīng)，產(chǎn)生有色物質(zhì)，通過酶標(biāo)檢測儀測出酶底物的降解量，從而推知被測樣品中的抗原量。蔡正森等（2004）對ELISA法和HPLC法測定糧油食品中AF含量進(jìn)行了比較。

3 AF的去毒方法

AF脫毒方法一般有物理脫毒法、化學(xué)脫毒法等。生物降解脫毒法是通過某些微生物的生物轉(zhuǎn)化作用，破壞霉菌毒素的化學(xué)結(jié)構(gòu)，降低霉菌毒素的毒性。大量研究表明，乳酸菌、枯草桿菌和醋酸菌具有較強(qiáng)的降解AF的能力（王寧等，2009）。

3.1 物理方法 用于AF脫毒處理的物理方法有：熱處理、微波、紫外線、漂洗、溶劑提取、脫胚處理（主要用于玉米脫毒）和吸附添加劑。生產(chǎn)中常采用的方法是在日糧中添加吸附劑來吸附動物消化道內(nèi)的AF，阻止機(jī)體對毒素的吸收，從而降低毒素對動物體的危害和毒素在動物產(chǎn)品中的殘留，常用的吸附劑有水合硅酸鈉鈣鹽、沸石、膨潤土、黏土、蒙脫石、活性炭等。

3.2 化學(xué)方法 在強(qiáng)堿強(qiáng)酸或強(qiáng)氧化劑等的作用下，AF結(jié)構(gòu)被徹底破壞，轉(zhuǎn)變?yōu)闊o毒或低毒物質(zhì)。谷物類的氨化處理也是一種有效的解毒方法，在一定條件下可以大大降低花生粕和棉籽粕中的AF，如果反應(yīng)時間足夠長的話，毒素結(jié)構(gòu)的變化是不可逆的。用氨鹽或氨水處理玉米、花生餅粕、棉籽可以將其霉變水平下降約99%。

3.3 生物方法 對于不宜被吸附的AF，利用微生物的轉(zhuǎn)化作用降解AF的毒性。常用的生物系菌種有乳酸菌、黑曲菌、米根霉、葡萄梨頭菌、灰藍(lán)毛菌、橙色黃桿菌等。暢曉淵等（2009）報道，通過抑菌活性試驗(yàn)，蛋白質(zhì)敏感試驗(yàn)，菌株的動力學(xué)生長曲線測定，菌株的生理生化試驗(yàn)及16 S rRNA序列鑒定試驗(yàn)，對埃及傳統(tǒng)Domiati奶酪中產(chǎn)抗AF的活性物質(zhì)進(jìn)行分離與鑒定。結(jié)果顯示，分離得到的菌株發(fā)酵上清液對多株受試真菌均有明顯抑制作用，尤其對產(chǎn)生AF的黃曲霉有很強(qiáng)的抑制效果。由此可見，許多微生物對AF的產(chǎn)生都有抑制作用或可降解AF的作用，因此可以考慮利用微生物之間的競爭作用，按比例添加到飼料中，達(dá)到預(yù)防畜禽AF中毒的目的。

生物脫霉劑含有活性乳酸菌、乳酸菌細(xì)胞壁及水合鋁硅酸鹽等有效成分，對霉變飼料的脫霉效果非常顯著。張建梅等（2009）測定了生物脫霉劑對AFB1的吸附強(qiáng)度，同時采用全收糞試驗(yàn)檢測了霉變飼料添加生物脫霉劑后家畜糞便中AFB1的排出率，結(jié)果表明，將AFB1的濃度調(diào)整為2 μg/g時，添加1.2‰的生物脫霉劑，可吸附98.34%的AFB1。全收糞試驗(yàn)表明，在霉變飼料中添加1‰的生物脫霉劑，被吸附的AFB1隨糞便的排出率為50.44%，添加2‰的生物脫霉劑，AFB1的排出率為72.30%。綜合體內(nèi)、體外生物脫霉劑對霉變飼料中AFB1的吸附性能，按照1‰的比例添加可以吸附飼料中不容易被肉眼察覺的微量霉菌毒素，達(dá)到預(yù)防霉菌毒素中毒目的；而對于輕度霉變飼料，添加1.5‰的生物脫霉劑，可以達(dá)到防霉脫毒的效果，預(yù)防家畜食用霉變飼料后發(fā)生中毒；中度以上能夠用肉眼發(fā)覺的霉變嚴(yán)重的飼料，應(yīng)當(dāng)將霉變飼料分散，降低霉菌毒素的濃度，再添加2‰的生物脫霉劑進(jìn)行脫毒。

3.4 營養(yǎng)素法 維生素缺乏，可加劇AF中毒，反之便會減弱或失活。所以在配合飼料中加倍添加維生素，尤其是維生素A、D、E、K含量更需提高，可緩解AF的中毒效應(yīng)。補(bǔ)加煙酸和煙酸胺，可以加強(qiáng)谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶的活性，增加解毒過程中與黃曲霉毒素B1的結(jié)合。

4 結(jié)語

AF污染的飼料不僅降低了飼料的營養(yǎng)價值和適口性，造成畜禽的生產(chǎn)性能下降甚至死亡，給養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的損失；而且產(chǎn)生的霉菌毒素可能會在畜類產(chǎn)品中殘留，從而影響人體健康。因此，應(yīng)加強(qiáng)飼料在生產(chǎn)、貯存、運(yùn)輸、加工過程中的管理，防止飼料原料及飼料污染和霉變，盡量減少或去除飼料中霉菌及其毒素。

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