孫曉梅，夏雪山，代解杰

(1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，昆明 650118;2.昆明理工大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，昆明 650224)

樹鼩馴養(yǎng)繁殖實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)及丙型肝炎動(dòng)物模型技術(shù)平臺(tái)建設(shè)的探討

孫曉梅1，夏雪山2，代解杰1

(1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，昆明 650118;2.昆明理工大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，昆明 650224)

目前用于生物醫(yī)學(xué)研究的樹鼩大多數(shù)來源于野生捕獲，由于個(gè)體間的差異較大，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果的均勻性和可重復(fù)性較差，亟待解決樹鼩人工飼養(yǎng)設(shè)施條件、繁殖關(guān)鍵技術(shù)、動(dòng)物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)等一系列基礎(chǔ)科學(xué)問題。許多文獻(xiàn)報(bào)道了樹鼩與其他實(shí)驗(yàn)動(dòng)物比較，在肝病研究中具有巨大的開發(fā)應(yīng)用潛力，在丙型肝炎動(dòng)物模型研究中，亟待解決丙型肝炎病毒(HCV)細(xì)胞培養(yǎng)體系、HCV病毒感染劑量與感染途徑、HCV病毒對(duì)樹鼩體外、體內(nèi)感染后病毒核酸檢測(cè)、抗體檢測(cè)和病理檢測(cè)等技術(shù)方法的建立及動(dòng)物模型評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)問題。本文就上述問題系統(tǒng)性地進(jìn)行初步報(bào)道，旨在為樹鼩早日實(shí)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物化和丙型肝炎疾病研究中應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

樹鼩;飼養(yǎng)繁殖;實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn);丙型肝炎;動(dòng)物模型

樹鼩(Tupaia belangeri，tree shrew)是一種形似松鼠的小型哺乳動(dòng)物。在分類學(xué)上，一直是許多學(xué)者感興趣和爭(zhēng)論的問題，一些學(xué)者根據(jù)其吻部較長(zhǎng)，指(趾)端是爪，牙齒的數(shù)目和食性等特征把它列為食蟲目(Insectivora)，另一些學(xué)者則根據(jù)其大腦比較發(fā)達(dá)而其上的嗅神經(jīng)區(qū)較小，眼眶后有骨橋并形成骨性眼眶，中耳部構(gòu)造與狐猴相似，大拇指(趾)與其他指(趾)分開及牙齒具有前臼齒等特征把它列入靈長(zhǎng)目(Primates)中的狐猴亞目。還有一些學(xué)者則提出另立新的目-攀鼩目(Scandentia)。不管樹鼩現(xiàn)在分類地位如何，自從1922年開始對(duì)它研究以來，有關(guān)樹鼩應(yīng)用于醫(yī)學(xué)和生物學(xué)的研究論文就不斷產(chǎn)生，利用樹鼩開展的研究已涉及到形態(tài)解剖學(xué)、生態(tài)學(xué)、行為學(xué)、人類學(xué)、生物化學(xué)、遺傳學(xué)、心理學(xué)、神經(jīng)生理學(xué)、繁殖生物學(xué)、胚胎學(xué)、寄生蟲學(xué)、病毒學(xué)、免疫學(xué)、病理學(xué)以及運(yùn)動(dòng)生理、急慢性壓力的影響和應(yīng)激等社會(huì)生物學(xué)的研究。

樹鼩在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用前景越來越受到世界各地相關(guān)研究者的重視。然而目前困擾學(xué)者的最大問題是，現(xiàn)在供研究的樹鼩還未實(shí)驗(yàn)動(dòng)物化，相關(guān)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)還未出臺(tái)，規(guī)?；膶?shí)驗(yàn)室馴養(yǎng)繁殖還非常少。以中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所為首的，與昆明理工大學(xué)合作，目前在樹鼩的馴養(yǎng)繁殖、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)化和樹鼩丙型肝炎動(dòng)物模型建立等方面做了很多研究與探索，已經(jīng)取得可喜得的成績(jī)。

1 樹鼩馴養(yǎng)繁殖技術(shù)、種質(zhì)資源庫建立

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所自1982～1993年就開始進(jìn)行樹鼩的馴養(yǎng)繁殖及動(dòng)物模型建立的研究，在當(dāng)時(shí)已成功建立輪狀病毒動(dòng)物模型。2006年開始進(jìn)行規(guī)?；囊吧鷺潼毜鸟Z養(yǎng)繁殖工作，經(jīng)過四年的歷程，取得非常好的成效。

1.1 野生樹鼩的馴化

眾所周知，樹鼩的“應(yīng)激反應(yīng)”遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過靈長(zhǎng)類動(dòng)物，野生樹鼩引種至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行人工飼養(yǎng)首先要解決動(dòng)物因應(yīng)急反應(yīng)造成的大規(guī)模死亡問題。作者應(yīng)用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)繁殖技術(shù)結(jié)合樹鼩生物學(xué)特性，創(chuàng)新性地研制了樹鼩馴化及繁殖的生態(tài)型不銹鋼籠具(尺寸：3000 mm×4000 mm×2000 mm，每籠懸掛600 mm×200 mm×400 mm巢箱4～5個(gè))，將野外引種的樹鼩按40～50只/籠放入該籠具進(jìn)行人工飼養(yǎng)馴化10～12周，可大大降低樹鼩的“應(yīng)激反應(yīng)”，同時(shí)逐步適應(yīng)人工飼養(yǎng)的環(huán)境條件和飲食習(xí)慣，死亡率可控制在5%以下。

1.2 樹鼩繁殖的關(guān)鍵技術(shù)

將馴化好的野生樹鼩轉(zhuǎn)入人工飼養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)用樹鼩專用籠具(專利號(hào)：ZL2008 2 0199835.4)進(jìn)行配對(duì)繁殖。經(jīng)過大膽嘗試和探索，室內(nèi)溫度控制在25～28℃，相對(duì)濕度30% ～50%，每天人工光照12 h，光照強(qiáng)度150～200 lx即可。飼料營(yíng)養(yǎng)配比為：水分30%、粗蛋白 25%、粗脂肪 6%、無氮浸出物24.5%、粗纖維6%、粗灰分6%、鈣1.5%、磷1%，并補(bǔ)給適量的水果、面包蟲等營(yíng)養(yǎng)品。已經(jīng)掌握了樹鼩交配規(guī)律、妊娠判定、產(chǎn)前準(zhǔn)備、圍產(chǎn)期護(hù)理等一系列關(guān)鍵技術(shù)，順利建立了種群，現(xiàn)有400余對(duì)種群，存欄量＞1000余只(其中子代樹鼩500余只)。繁殖率＞85%，成活率 ＞88.23%，每窩平均產(chǎn)仔數(shù)(3.62±0.74)只。成功建立了樹鼩繁育的關(guān)鍵技術(shù)(專利申請(qǐng)?zhí)枺?00910095042.7)。在此基礎(chǔ)上制訂了《樹鼩飼養(yǎng)管理技術(shù)規(guī)范(研究稿)》包括引種技術(shù)、馴化技術(shù)、飼養(yǎng)觀察技術(shù)、營(yíng)養(yǎng)飼料配制技術(shù)、繁殖技術(shù)、環(huán)境條件控制技術(shù)和疾病控制技術(shù)。

2 實(shí)驗(yàn)樹鼩的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

2.1 樹鼩的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制

我們對(duì)樹鼩進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究，已完成微生物學(xué)指標(biāo)本底的檢測(cè)，腸道細(xì)菌為大腸桿菌和葡萄球菌，也伴有假單胞菌、沙門氏菌、鏈球菌的感染。完成樹鼩體外寄生蟲的檢測(cè)，樹鼩體外自然感染寄生蟲主要是虱子、螨蟲，偶見蜱蟲。完成樹鼩病毒抗體的檢測(cè)，其自然感染主要是單純皰疹病毒、輪狀病毒、柯薩奇病毒血清抗體呈陽性。

2.2 樹鼩的遺傳學(xué)控制

建立了樹鼩隨機(jī)擴(kuò)增多肽RAPD遺傳標(biāo)記分析方法(40條隨機(jī)引物)，和微衛(wèi)星分子標(biāo)記(12對(duì)引物)的遺傳檢測(cè)方法，遺傳多態(tài)檢測(cè)結(jié)果表明我們飼養(yǎng)繁殖的樹鼩群體具有較好的遺傳多樣性。

3 樹鼩的臨床指標(biāo)和生物學(xué)特性

建立了樹鼩血常規(guī)參數(shù)和肝功能指標(biāo)的正常值數(shù)據(jù)庫，在此基礎(chǔ)上制訂了《樹鼩生物學(xué)特性數(shù)據(jù)檢測(cè)技術(shù)規(guī)范(研究稿)》，為樹鼩在醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。下一步的目標(biāo)是建成全國(guó)的樹鼩種質(zhì)資源庫基地，為生物醫(yī)藥研究提供合格的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物化的樹鼩。

4 樹鼩的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)技術(shù)

建立了樹鼩麻醉技術(shù)，麻醉劑主要有戊巴比妥鈉(50 mg/kg)、鹽酸氯胺酮(40 mg/kg)，一定劑量的鹽酸氯胺酮和戊巴比妥鈉均能對(duì)樹鼩產(chǎn)生麻醉效果，并安全可靠;鹽酸氯胺酮顯效快、麻醉維持時(shí)間短，戊巴比妥鈉則麻醉維持時(shí)間長(zhǎng)，動(dòng)物非常安定。

建立了實(shí)驗(yàn)樹鼩保定技術(shù)(自制的捕捉保定袋)、采血技術(shù)(尾靜脈采血可達(dá)到每次1.5 mL，股靜脈采血可達(dá)到每次3 mL，心臟采血可達(dá)到每次5～6 mL)，實(shí)驗(yàn)樹鼩灌胃給藥技術(shù)。在此基礎(chǔ)上制訂了《樹鼩動(dòng)物實(shí)驗(yàn)基本操作技術(shù)規(guī)范(研究稿)》。

5 HCV感染樹鼩的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)

5.1 穩(wěn)定、高效的 HCV病毒(J6/JFH-1)細(xì)胞培養(yǎng)體系

從重組痘病毒(vTF7-3)感染的敏感細(xì)胞中選出Hela細(xì)胞作為國(guó)際公認(rèn)的HCV病毒株(J6/JFH-1)的受染細(xì)胞，通過測(cè)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞中 HCV RNA合成、結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白的表達(dá)情況以及HCVcc結(jié)構(gòu)形態(tài)，建立及優(yōu)化病毒株(J6/JFH-1)的細(xì)胞轉(zhuǎn)染體系。通過RT-PCR、Western blot及感染Huh7等方式建立每批次HCVcc的核酸、蛋白及感染效率質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，為樹鼩HCV感染模型的研究工作提供穩(wěn)定質(zhì)量控制的 HCVcc(病毒載量達(dá)到108copies/mL)，所得到的 HCV細(xì)胞培養(yǎng)病毒上清液，具有HCV病毒復(fù)制性和感染性。

5.2 樹鼩原代肝細(xì)胞分離培養(yǎng)及HCV對(duì)其感染性研究

采用活體腹腔肝臟暴露，二步灌流、膠原酶消化法獲得樹鼩原代肝細(xì)胞，每次分離的原代肝細(xì)胞產(chǎn)量達(dá)5×108以上，細(xì)胞純度達(dá)95%以上，細(xì)胞成活率為90%，通過多種培養(yǎng)基培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，建立了樹鼩原代肝細(xì)胞培養(yǎng)。結(jié)合樹鼩原代肝細(xì)胞(PTH)生長(zhǎng)曲線特征，選擇其指數(shù)生長(zhǎng)初期(2～4 d)，以高毒力J6/JFH-1嵌合型 HCVcc(病毒載量 1×108IU/mL;病毒滴度1×106ffu/mL)對(duì)子代小樹鼩原代肝細(xì)胞進(jìn)行感染獲得HCVcc感染PTH病毒增殖動(dòng)力曲線，結(jié)果顯示，病毒在PTH中隨時(shí)間的變化有明顯的增殖變化，其中第1天和9天 HCV RNA增殖最高水平可達(dá)5.5 Log10 IU/mL、5.2 Log 10 IU/mL，細(xì)胞上清RT-PCR檢測(cè)成陽性，測(cè)序結(jié)果比對(duì)分析正確，并證實(shí)該P(yáng)TH產(chǎn)生上清對(duì)人肝癌(Huh7.5.1)細(xì)胞具有較好感染性。在此基礎(chǔ)上制訂了《HCV病毒感染樹鼩原代肝細(xì)胞模型制作技術(shù)規(guī)范(研究稿)》。

5.3 樹鼩IgG抗體的制備

采用辛酸-硫酸銨沉淀并結(jié)合Sephacryl-S200凝膠過濾層析和DEAE-Sephadex A-50陰離子交換層析分離純化樹鼩血清免疫球蛋白G(IgG)，樹鼩血清中IgG的分子量約為160×103，其重鏈分子量為53.5×103，輕鏈分子量為28.4×103。成功的制備了特異性好、質(zhì)量高的兔抗樹鼩IgG的多克隆抗體其效價(jià)達(dá)1∶25 600;同時(shí)得到了大量的高濃度鼠抗樹鼩的IgG單克隆產(chǎn)量約為1～5 mg/mL。在已得到的樹鼩IgG多抗和單抗的基礎(chǔ)上，建立了ELISA和Western blotting的檢測(cè)方法。申請(qǐng)發(fā)明專利：抗樹鼩 IgG單克隆抗體的制備方法(申請(qǐng)?zhí)枺?00910094864.3)

5.4 樹鼩中HCV受體和抗體的研究

為了從樹鼩中HCV的受體的角度進(jìn)一步證實(shí)其作為HCV的感染動(dòng)物模型的可能性和初步對(duì)HCV的慢性感染機(jī)制。以樹鼩肝組織中提取的核酸為模板，擴(kuò)增了CD81(711 bp)、SR-BI(1041 bp)、Claudin-1(636 bp)三個(gè)受體基因片段，并以各受體基因片段PCR產(chǎn)物通過TA克隆完成測(cè)序，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了它們和不同物種間的保守性和序列差異性分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與人相比較，核苷酸序列同源性CD81、SR-BI、Claudin-1分別為 91.4%、87.5% 和90.9%;氨基酸序列同源性三個(gè)分子分別為96.2%、88.0%和93.4%。經(jīng) HCV感染受體關(guān)鍵位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)，CD81分子與人有9個(gè)差異性位點(diǎn)，6個(gè)在胞外大環(huán)區(qū)(LEL區(qū))，HCV感染所需的關(guān)鍵位點(diǎn)與人基本一致;Claudin-1共有14氨基酸位點(diǎn)與人類有差異，胞外大環(huán)區(qū)有3個(gè)。SR-BI受體氨基酸序列與人有較大差異，61個(gè)差異位點(diǎn)中LEL區(qū)有44個(gè)。相比而言，所研究的樹鼩的CD81和 SR-BI受體更接近于靈長(zhǎng)類動(dòng)物而遠(yuǎn)于鼠類。

5.5 樹鼩CD81熒光實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)

根據(jù)CD81核苷酸序列，設(shè)計(jì)并合成了引物和Taqman探針，并對(duì)其反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在25 μL反應(yīng)體系中，反應(yīng)主要條件為退火溫度60℃、引物濃度 200 nmol/L、探針濃度100 nmol/L。經(jīng)已知拷貝數(shù)標(biāo)本(103、104、105、106、107拷貝)進(jìn)行檢測(cè)，繪制了標(biāo)準(zhǔn)曲線，CT值與拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值之間有很好的相關(guān)性(R2=0.9996)。通過批間、批內(nèi)、組間、組內(nèi)四個(gè)水平對(duì)該方法進(jìn)行了重復(fù)性、穩(wěn)定性評(píng)價(jià)，確定該方法具有較高的穩(wěn)定性和可重復(fù)性，各項(xiàng)變異系數(shù)均小于5%。經(jīng)檢測(cè)靈敏性評(píng)價(jià)，該方法可以檢測(cè)到每個(gè)反應(yīng)相當(dāng)于1×102copies CD81核酸分子。對(duì) HCV感染不同時(shí)間(8、12、16、20 h和24 h)的樹鼩原代肝細(xì)胞(PTH)，進(jìn)行了HCV-RNA檢測(cè)，并用該方法檢測(cè)了其CD81分子表達(dá)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在HCV感染不同時(shí)間的PTH中可以檢測(cè)到HCV-RNA，隨著HCV的感染和增殖，樹鼩中CD81的表達(dá)量下降，下降曲線無規(guī)律性。該方法已申請(qǐng)發(fā)明專利：以樹鼩CD81基因構(gòu)建的質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)品的Taqman探針熒光定量PCR方法(申請(qǐng)?zhí)枺?00810233735.3)。

5.6 HCV病毒體內(nèi)感染模型

用國(guó)際公認(rèn)的(J6/JFH1)標(biāo)準(zhǔn)毒株培養(yǎng)的HCV病毒培養(yǎng)液(HCVcc)靜脈或肝臟注射等方式，在具有生物安全保護(hù)的專用實(shí)驗(yàn)籠具——獨(dú)立換氣樹鼩專用隔離籠具(專利申請(qǐng)?zhí)枺?01020242799.2)體內(nèi)感染F1代仔樹鼩，約20% ～25%的樹鼩在2～18周相繼出現(xiàn)病毒血征或呈慢性持續(xù)性感染癥狀，病毒載量在102～105copies/mL之間，肝功能中 ALT指標(biāo)最高可達(dá)到265 U/L，進(jìn)一步證實(shí)樹鼩可作為HCV病毒感染研究的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。對(duì)感染樹鼩進(jìn)行肝臟活體病理學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，肝細(xì)胞損傷或部分組織纖維化，進(jìn)一步證實(shí)樹鼩可作為HCV病毒感染研究的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。在此基礎(chǔ)上制訂了《HCV病毒感染樹鼩模型制作技術(shù)規(guī)范(研究稿)》。

6 問題與展望

樹鼩能否替代黑猩猩成為HCV疾病動(dòng)物模型研究、抗HCV藥物和疫苗篩選與評(píng)價(jià)的理想實(shí)驗(yàn)動(dòng)物?必須解決樹鼩的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物化標(biāo)準(zhǔn)的一系列基礎(chǔ)科學(xué)問題，尤其是遺傳學(xué)特性研究，對(duì)于提高目前樹鼩對(duì)HCV病毒感染率不高將有重要意義。同時(shí)，HCV感染樹鼩后，樹鼩的細(xì)胞免疫和體液免疫的檢測(cè)技術(shù)方法的建立，是評(píng)價(jià)病毒感染樹鼩免疫機(jī)制的重要的技術(shù)手段。相信在不遠(yuǎn)的將來，樹鼩將會(huì)成為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物家族中的一個(gè)新成員，為人類健康做出應(yīng)有的貢獻(xiàn)。

Exploration of laboratory animal standard of domesticated and bred Tupaia belangeri and construction of a technology platform of a Tupaia belangeri model of hepatitis C virus(HCV)infection

SUN Xiao-mei1，XIA Xue-shan2，DAI Jie-jie1
(1.Institute of Medical Biology，Chinese Academy of Medical Science and Peking Union Medical College，Kunming 650118，China;2.Faculty of Life Science and Technology，Kunming University of Science and Technology，Kunming 650224)

At present，the Tupaia belangeri used for biomedical studies is mainly sourced from wild field capture.Due to the variation of interindividual differences，there are still some shortages in the homogeneity and the repeatability of experiments on those animals.There are problems demanding prompt solution on a series of basic scientific questions such as the management，critical techniques for breeding and the animal quality control standard in Tupaia belangeri.A lot of researches have reported that the Tupaia belangeri has a huge exploitation potential on the liver disease research compared with other laboratory animals.In the studies of animal models of hepatitis，there are problems need to be solved promptly on the cell culture system of HCV(hepatitis C virus)，the infection dosage and route of HCV infection，the RNA，the antibody and the pathological examination after HCV infection in vivo and in vitro，and also how to evaluate the animal model.This paper will briefly discuss the above mentioned questions，in order to provide a scientific basis for implementing experimental animalization and the use of the Tupaia belangeri in HCV disease studies.

Tupaia belangeri，Domestication;Breeding;Standard of experimental animals，Hepatitis C，Animal model

Q95-33

A

1005-4847(2011)02-0172-04

10.3969/j.issn.1005-4847.2011.02.017

國(guó)家科技支撐計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(批準(zhǔn)號(hào)：2009BAI83B02)，云南省科技基礎(chǔ)條件平臺(tái)建設(shè)計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)：2006PT07-2)。

孫曉梅(1963-)，女，研究方向：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)及疾病動(dòng)物模型。Email：sxm@imbcams.com.cn

代解杰，研究員，項(xiàng)目負(fù)責(zé)人。Email：lzldjj@gmail.com夏雪山，教授。Email：oliverxia2000@yahoo.com.cn

2010-12-27