任麗艷，關(guān) 瑾，陳 星，王慧澤

(沈陽化工大學應用化學學院，遼寧 沈陽 110142)

藥物代謝即藥物的生物轉(zhuǎn)化，是指藥物在生物體內(nèi)發(fā)生的有機化學反應，主要是指“脫毒”反應。藥物經(jīng)代謝后通常發(fā)生結(jié)構(gòu)變化，從而引起相應的藥理活性及毒性改變。通過藥物代謝研究，可以闡明藥物代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)，確定藥物生物轉(zhuǎn)化過程的代謝酶，評價母體藥物和代謝產(chǎn)物的藥理學、藥代動力學和毒理學性質(zhì)等，為進一步改造藥物的化學結(jié)構(gòu)，開發(fā)新藥提供依據(jù)和研究思路［1-2］。

目前藥物代謝研究主要有體內(nèi)和體外2種方法。體內(nèi)代謝法可以綜合考慮各種體內(nèi)因素對藥物的影響，能夠真實全面地反映藥物代謝的體內(nèi)特征。體外代謝法可在短時間內(nèi)得到大量的代謝產(chǎn)物，可以方便控制代謝條件，易于對代謝產(chǎn)物進行分離和提取，盡快確定代謝途徑及結(jié)構(gòu)變化［3］。目前常用的體外代謝方法主要有肝細胞培養(yǎng)法、肝組織切片法、肝灌流法和肝微粒法。這些方法操作繁瑣，技術(shù)要求較高［4-6］。另外，隨著分子生物學技術(shù)的發(fā)展，可利用基因重組表達的細胞色素P450(cytochrome P450，CYP450)酶系中的某個純酶進行藥物代謝研究，但目前各種純酶的商品價格非常昂貴，在一定程度上限制了重組藥物代謝酶的應用［7］。利用微生物轉(zhuǎn)化為藥物體外代謝模型則具有很多優(yōu)勢，本文對其在藥物代謝方面的應用進行綜述。

1 模擬哺乳動物藥物代謝的微生物模型

1973年，Smith等［8］通過實驗最先提出了“建立模擬哺乳動物代謝的微生物模型(microbial models of mammalian metabolism)”的概念，其核心內(nèi)容是:真菌和哺乳動物均為真核生物，因此它們在某些生化反應中有類似的酶或酶系參與?；谶@一理論，利用微生物作為模型研究哺乳動物的藥物代謝得到了廣泛的應用。

與藥物代謝的體內(nèi)和體外研究方法相比較，利用微生物作為藥物代謝研究的模型具有很多優(yōu)勢［9］:①通常情況下微生物和人體代謝途徑的相似性并不亞于哺乳動物和人，因此可以采用微生物模型模擬人體藥物代謝，推測或輔助證實哺乳動物體內(nèi)的藥物代謝途徑，從而大量減少實驗動物和實驗成本。②微生物來源廣泛，種類繁多，可提供大量的篩選模型。③可調(diào)節(jié)，通過優(yōu)化條件，可顯著提高目的代謝產(chǎn)物的收率，有助于檢測和制備毫克級甚至納克級代謝產(chǎn)物對照品并進行藥理學與毒理學研究。④建立微生物轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，成本低，操作簡單，易于控制。Foster等［10］研究發(fā)現(xiàn)，奎尼丁和金雀花堿抑制班氏小克銀漢霉(Cunninghamella bainier)對普羅帕酮及甲氧那明(甲氧苯丙甲胺)的轉(zhuǎn)化，與人體內(nèi)的代謝過程十分類似，提示真菌中具有與人體類似的藥物代謝酶，并且可以用于藥物間相互作用的研究。Davila等［11］通過研究刺孢小克銀漢霉(Cun.echinulata)對罌粟堿的轉(zhuǎn)化發(fā)現(xiàn)，利用該菌株可以評價藥物的毒性。Asha等［12］對各類細胞色素酶進行了介紹并對其各自作用的底物進行了總結(jié)，以真核微生物小克銀漢霉屬(Cunninghamella Matruchot)為例提出了微生物技術(shù)手段在未來的應用。這些研究結(jié)果表明真菌模型在藥物代謝研究中具有更為廣泛的用途。

2 真菌細胞色素P450

1958 年，Klingenberg［13］和 Garfinkel［14］首次發(fā)現(xiàn)一種能與一氧化碳結(jié)合的色素，Omura等［15］發(fā)現(xiàn)它是一種性質(zhì)特殊的血紅蛋白，其還原態(tài)可與一氧化碳結(jié)合，在波長450 nm處有明顯吸收峰，因而于1962年首先提出CYP450這一名稱，又稱其為混合功能氧化酶(mixed function oxidase，MFO)或單加氧酶(monooxygenase)。后陸續(xù)發(fā)現(xiàn)CYPs是參與外源化合物解毒和內(nèi)源化合物代謝的重要酶系，主要位于細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，和藥物代謝的Ⅰ相反應，和大部分臨床藥物的代謝。

真菌，尤其是絲狀真菌對許多藥物的轉(zhuǎn)化反應都是由CYP450介導的，通過使用一些經(jīng)典的CYP酶抑制劑，如美替拉酮或一氧化碳等對轉(zhuǎn)化反應的抑制作用，已經(jīng)間接證明了微生物和(或)真菌CYP酶參與了轉(zhuǎn)化反應［16-17］。小克銀漢霉屬是一類絲狀真菌，根據(jù)形態(tài)及生理特征共分為5種:刺孢(短刺)小克銀漢霉，班氏小克銀漢霉，布氏小克銀漢霉，巴西果小克銀漢霉和綺麗(雅致)小克銀漢霉。Amadio等［18］以氟比洛芬(flurbiprofen)為底物對小克銀漢霉屬不同種類進行了考察，結(jié)果表明小克銀漢霉屬具有與人體類似的藥物代謝酶。Wang等［19］利用真菌線粒體的單克隆抗體從雅致小克銀漢霉的cDNA文庫中篩選編碼473個氨基酸殘基的全長cDNA，并利用E.coli實現(xiàn)了過量表達，免疫印跡實驗表明哺乳動物CYP1A，CYP2E1和CYP3A1的抗體與表達蛋白呈陽性反應，這些研究從另一個角度說明該菌株具有與人體十分類似的CYP450。

3 小克銀漢霉屬微生物模型在體外藥物代謝中的應用

小克銀漢霉菌屬的許多菌株具有與人體類似的Ⅰ相和Ⅱ相藥物代謝酶［20］，在模擬人體的藥物代謝研究方面得到廣泛的應用。以下以幾種常用的小克銀漢霉屬微生物模型為例，介紹其在體外藥物代謝中的一些應用。

3.1 短刺小克銀漢霉屬AS3.153模型在藥物代謝中的應用

哈爾明堿(harmine)具有抗腫瘤作用，但其毒性較大，中毒劑量和最大安全劑量接近，因此有必要對哈爾明堿及其代謝產(chǎn)物的活性和毒性等方面進行研究，以探索能否找到增加其生物活性同時降低毒性的產(chǎn)物。邱彬等［21］應用短刺小克銀漢霉(Cun.blakesleeane)AS3.153對哈爾明堿的代謝轉(zhuǎn)換進行了實驗。結(jié)果表明，該菌株對哈爾明堿的代謝轉(zhuǎn)化率高，能夠特異性地制備哈爾明堿的氧去甲基化產(chǎn)物和芳環(huán)上的羥基化產(chǎn)物，并進行了結(jié)構(gòu)鑒定。到目前為止，有關(guān)哈爾明堿在人體或動物的代謝轉(zhuǎn)化的報道較少，且由于通過體內(nèi)代謝得到的產(chǎn)物量少，難以進行下一步研究。而藥物微生物轉(zhuǎn)化有利于制備足量的代謝產(chǎn)物，為進一步的藥物結(jié)構(gòu)鑒定及其藥理毒理研究奠定基礎(chǔ)。由于短刺小克銀漢霉AS3.153在藥物代謝過程中轉(zhuǎn)化率高，故其微生物代謝模型廣泛應用于藥物。目前已應用該微生物模型進行代謝研究的藥物有:維拉帕米［22］、昂丹司瓊［23］、苯丙哌林［24］、萘普生［25］、異戊他定［26］、泮托拉唑［27］、美托洛爾［28］和右美沙芬［29］等。

3.2 短刺小克銀漢霉AS3.910模型在藥物代謝中的應用

“馬兜鈴酸腎病”是近幾年來在國際上引起廣泛關(guān)注的一類由于中草藥的不良反應而導致腎損害。由于馬兜鈴酸類化合物在體內(nèi)代謝比較復雜，代謝產(chǎn)物又難以收集，給這類化合物代謝物的毒理學研究造成了很大的障礙。郭永超等［30］選用短刺小克銀漢霉AS3.910用微生物轉(zhuǎn)化的方法對馬兜鈴酸A進行了代謝轉(zhuǎn)化研究并比較了微生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物和哺乳動物體內(nèi)代謝產(chǎn)物的異同。短刺小克銀漢霉AS3.910可對馬兜鈴酸A進行專一性的氧去甲基化作用的結(jié)構(gòu)改造而獲得代謝產(chǎn)物，在與Krumbiegel等［31］進行的動物體內(nèi)代謝產(chǎn)物進行比較后，證明該化合物是馬兜鈴酸A在哺乳動物體內(nèi)代謝產(chǎn)物之一。經(jīng)過轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化，可以穩(wěn)定、方便地獲得這一目標代謝物，作為標準品，從而方便了對該目標代謝物的制備及其毒理和藥理學方面的研究。楊秀偉等［32］用短刺小克銀漢霉AS3.910建立了具有CYP2C9活性的微生物模型。通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基的種類和初始pH，使轉(zhuǎn)化系統(tǒng)在較高底物濃度下具有良好的轉(zhuǎn)化效果，格列本脲、雙氯芬酸和吲哚美辛總轉(zhuǎn)化率分別為90%，100%和83%，而且形成的主要轉(zhuǎn)化產(chǎn)物與人體CYP2C9產(chǎn)生的主要代謝產(chǎn)物相同。

3.3 雅致小克銀漢霉AS3.156模型在藥物代謝中的應用

萘普生是常用的非甾體類抗炎藥物，用于治療風濕或某些非風濕性疾病引起的疼痛與炎癥。該藥在人體和動物體內(nèi)的代謝途徑主要包括:①萘環(huán)C-6位甲氧基發(fā)生去甲基反應生成O-去甲基萘普生;② 母體藥物通過羧基與葡萄糖醛酸或甘氨酸結(jié)合;③ O-去甲基萘普生通過酚羥基與葡萄糖醛酸結(jié)合［33］。劉磊等［34］采用雅致小克銀漢霉(Cun.elegans)AS3.156對萘普生的微生物轉(zhuǎn)化進行了研究。雅致小克銀漢霉AS3.156可高度專一性地轉(zhuǎn)化萘普生形成O-去甲基萘普生，且產(chǎn)率高達95%以上。

4 展望

小克銀漢霉屬的許多菌株具有與人體類似的Ⅰ相和Ⅱ相藥物代謝酶，現(xiàn)在已應用于體外藥物代謝研究中。微生物轉(zhuǎn)化法具有易調(diào)節(jié)、易放大等特點，通過選擇比較理想的轉(zhuǎn)化菌株和優(yōu)化調(diào)節(jié)可以強化某些轉(zhuǎn)化途徑，用于較大規(guī)模地制備一定數(shù)量的代謝物純品，確定其化學結(jié)構(gòu)與生物學活性，為體內(nèi)藥物代謝產(chǎn)物的深入研究奠定實驗基礎(chǔ)。但由于其尚不能全面反映體內(nèi)代謝的綜合情況，與生物體內(nèi)的真實情況存在一定的差異及菌株成本較高，使得這種方法制備的代謝產(chǎn)物對照品非常昂貴，其廣泛的應用受到一定的限制。

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