潘壽華 閻家峻 鄭專

紹興市人民醫(yī)院泌尿外科，浙江 紹興 312000

雄激素阻斷是晚期前列腺癌首選治療方法，但一般經(jīng)12～18個月的治療后會轉(zhuǎn)變?yōu)樾奂に胤且蕾囆郧傲邢侔?，患者最終往往死于雄激素不敏感癌細胞的廣泛轉(zhuǎn)移［1］。前列腺癌這種雄激素依賴性轉(zhuǎn)化的機制目前尚不完全清楚，本研究主要從AR基因表達水平變化方面來探討前列腺癌雄激素依賴轉(zhuǎn)化的可能機制，為雄激素非依賴性前列腺癌的臨床治療提供理論基礎(chǔ)。

1 資料和方法

1.1 臨床資料

所有病例均為在本院治療的晚期前列腺癌患者，共33例，均符合以下條件：⑴治療前均經(jīng)病理和影像學檢查確診為C或D期的前列腺癌患者。⑵均接受正規(guī)抗雄激素治療，方法包括雙側(cè)睪丸切除或皮下注射醋酸亮丙瑞林(商品名抑那通，日本武田制藥公司生產(chǎn))、口服比卡魯胺(商品名康士得，英國阿斯利康公司生產(chǎn))。⑶隨訪期間根據(jù)需要能前后2次獲取前列腺癌組織標本。根據(jù)是否發(fā)生雄激素依賴轉(zhuǎn)化的標準［2］分為雄激素依賴轉(zhuǎn)化組和雄激素依賴無轉(zhuǎn)化組。雄激素依賴轉(zhuǎn)化組：18例，年齡59～82歲，平均年齡69歲。內(nèi)分泌治療時間為13～36個月，發(fā)生雄激素依賴轉(zhuǎn)化時間為12～24個月。雄激素依賴無轉(zhuǎn)化組：15例，年齡60～81歲，平均年齡70歲。內(nèi)分泌治療時間為12～35個月。

1.2 RT-PCR法測定前列腺癌中AR基因表達

提取細胞總RNA，RT-PCR反應(yīng)步驟：0.5 mL離心管中加入4 μg總RNA，Oligo(dT)18 μL，加DEPC處理水至12 μL，70 ℃溫育5 min后取出冰浴，依次加入5×反應(yīng)緩沖液4 μL，10 mmol/L dNTP 2 μL，RNA酶抑制劑1 μL(20 U)，37 ℃溫浴5 min后，加1 μL(200 U)M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶，混勻后42 ℃ 溫浴1 h，70 ℃滅活10 min。PCR反應(yīng)體系為2×反應(yīng)緩沖液12.5 μL、引物正反義鏈各0.5 μL、模板DNA 2 μL以及DEPC處理水9.5 μL至終體積25 μL。AR的反應(yīng)參數(shù):93 ℃預變性3 min，93 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s；29個循環(huán)， 72 ℃終延伸10 min。β-actin的反應(yīng)參數(shù):94 ℃預變性3 min， 94 ℃變性45 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s；29個循環(huán)，72 ℃終延伸5 min。AR引物正義鏈：5’-GCAATCATTTCTGCTGGCGCA-3’，反義鏈：5’-AGCTACTCCGGACCTTACG-3’。β-actin正義鏈：5’-GTGGGGCGCCCCAG GCACCA-3’，反義鏈：5’-CTTCCTTAATG TCACGCACGATTTC-3’，引物由上海生物工程公司合成。

1.3 統(tǒng)計學處理

兩組數(shù)據(jù)均數(shù)比較采用t檢驗，數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標準差()表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

33例前列腺癌患者在研究期間有18例患者發(fā)生了雄激素依賴轉(zhuǎn)化，發(fā)生時間為(18±5)個月，15例患者未發(fā)生雄激素依賴轉(zhuǎn)化。采用RT-PCR法檢測AR基因在雄激素依賴轉(zhuǎn)化組及無轉(zhuǎn)化組前列腺癌細胞內(nèi)表達情況，雄激素依賴轉(zhuǎn)化組轉(zhuǎn)化后AR基因表達水平明顯高于轉(zhuǎn)化前［(36.7±1.8) Ctvs(28.4±3.4) Ct，t=14.43，P＜0.001］，而雄激素依賴無轉(zhuǎn)化組AR基因表達水平無明顯變化［(29.1±3.2) Ctvs(29.5±3.1) Ct，t=0.409，P＞0.05］。

3 討 論

前列腺癌雄激素依賴發(fā)生轉(zhuǎn)化的分子生物學機制仍不十分明了，但目前比較一致的看法是AR在這一過程中有著重要的作用［3］。過去人們曾通過研究前列腺癌的體外模型發(fā)現(xiàn)前列腺癌雄激素依賴發(fā)生轉(zhuǎn)化后常伴有AR蛋白表達下調(diào)或缺失，認為晚期前列腺癌經(jīng)內(nèi)分泌治療一段時間后表達AR的腫瘤細胞發(fā)生凋亡，而缺乏AR表達的腫瘤細胞選擇性的過度克隆增殖是導致前列腺癌雄激素依賴發(fā)生轉(zhuǎn)化的重要原因［4］。Chodak等［5］用半定量方法檢測AR在前列腺癌中的表達發(fā)現(xiàn)，AR的表達量與前列腺癌分化程度呈負相關(guān)，Greenberg等［6］在前列腺癌轉(zhuǎn)基因鼠動物模型中亦觀察到相似的結(jié)果。國內(nèi)張秉鴻等［7］使用免疫組化及圖像分析技術(shù)檢測前列腺癌中AR的含量也發(fā)現(xiàn)，隨著前列腺癌惡性程度增加，AR表達減少，發(fā)生雄激素依賴轉(zhuǎn)化后AR表達較轉(zhuǎn)化前明顯下降，而AR表達與前列腺癌的臨床分期無明顯相關(guān)性。

隨著分子生物學技術(shù)及AR基因檢測技術(shù)的不斷進展，近年來許多研究卻發(fā)現(xiàn)了與過去截然不同的結(jié)果。Linja等［8］使用實時RT-PCR法檢測一組前列腺癌標本發(fā)現(xiàn)，雄激素依賴轉(zhuǎn)化的病例AR轉(zhuǎn)錄水平較抗雄激素治療有效的病例高6倍，Brown等［9］應(yīng)用FISH法檢查18例雄激素依賴轉(zhuǎn)化前列腺癌中的AR基因和9例原發(fā)腫瘤AR基因情況，發(fā)現(xiàn)9/18的雄激素依賴轉(zhuǎn)化前列腺癌有AR基因的擴增，而未治療的原發(fā)前列腺癌中無AR基因的擴增，Chen等［10］證實雄激素依賴轉(zhuǎn)化的前列腺癌中AR cDNA、mRNA、蛋白的表達均高于雄激素依賴前列腺癌，Koivisto等［11］使用比較基因組雜交技術(shù)發(fā)現(xiàn)有30%雄激素依賴轉(zhuǎn)化前列腺癌有AR基因擴增，國內(nèi)張勇等［12］采用RBA法研究證實，雄激素依賴轉(zhuǎn)化前列腺癌患者的AR表達量高于雄激素依賴患者的AR表達量，甘道舉等［13］用免疫組化兩步法檢測15例中國人雄激素依賴抵抗性前列腺癌AR表達發(fā)現(xiàn)，僅1例AR表達陰性，其余表達均為強陽性，AR染色的平均光密度值較雄激素依賴性前列腺癌明顯升高，表明雄激素依賴轉(zhuǎn)化前列腺癌有更高的AR基因擴增率。我們通過33例病理確診并能接受正規(guī)抗雄激素治療的晚期前列腺癌患者進行較長時間隨訪，在相同隨訪時間內(nèi)共有18例患者出現(xiàn)雄激素依賴轉(zhuǎn)化，15例患者雄激素依賴無轉(zhuǎn)化。我們對前列腺癌患者在雄激素依賴轉(zhuǎn)化前后的前列腺癌組織標本行實時RT-PCR方法測定細胞內(nèi)AR基因的表達，與同時期內(nèi)雄激素依賴無轉(zhuǎn)化的前列腺癌患者標本作為對照。在雄激素治療前后標本利用實時RT-PCR方法測定細胞內(nèi)AR基因的表達，也有同樣的發(fā)現(xiàn)，雄激素依賴轉(zhuǎn)化組轉(zhuǎn)化后AR基因表達水平明顯高于轉(zhuǎn)化前[(36.7±1.8)ctvs(28.4±3.4)ct，P＜0.001]，而雄激素依賴無轉(zhuǎn)化組AR基因表達水平無明顯變化[(29.1±3.2)ctvs(29.5±3.1)ct，P＞0.05]。我們認為經(jīng)過內(nèi)分泌治療后前列腺癌細胞適應(yīng)了低水平的雄激素環(huán)境，AR轉(zhuǎn)錄水平升高，使AR對低濃度雄激素的敏感性增強，前列腺癌細胞失去對生長的調(diào)控，在極低濃度雄激素環(huán)境下仍能無限增殖，這可能是前列腺癌產(chǎn)生雄激素依賴轉(zhuǎn)化的重要機制之一。

AR因存在著組織學標本的體內(nèi)生物學差異，或體內(nèi)與體外細胞中的生物學差異，或非親本細胞株之間的基因差異等因素影響，對于前列腺癌生物學特性轉(zhuǎn)變機制的研究，由于缺乏準確模擬其臨床特點的細胞和動物模型，從而限制了相關(guān)研究的進展［14］。

本研究發(fā)現(xiàn)前列腺癌發(fā)生雄激素轉(zhuǎn)化后細胞內(nèi)AR基因表達明顯增加，提示前列腺癌發(fā)生雄激素轉(zhuǎn)化機制與AR基因擴增有關(guān)。AR作為雄激素非依賴前列腺癌治療的靶點，是以后臨床治療及藥物研制的方向。

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