(四川化工職業(yè)技術(shù)學(xué)院，四川瀘州 646005)

1 引言

生物表面活性劑(簡(jiǎn)稱BS)是細(xì)菌、真菌和酵母在特定條件下，在其生長(zhǎng)過程中分泌出的表面活性的代謝產(chǎn)物。與傳統(tǒng)的以石油為原料合成的化學(xué)表面活性劑相比，生物表面活性劑具有表面活性高，乳化能力強(qiáng);具有良好的熱穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性;不會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染和破壞，專一性強(qiáng)，生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)便;原料價(jià)廉易得。因此，隨著社會(huì)的進(jìn)步與發(fā)展和人們環(huán)保意識(shí)的增強(qiáng)，生物表面活性劑取代化學(xué)合成表面活性劑將成為必然趨勢(shì)。

2 生物表面活性劑的分類與來源

生物表面活性劑的分類主要是根據(jù)它的化學(xué)組成和微生物來源。根據(jù)親水基的不同，可將生物表面活性劑分為5類:①以糖為親水基的糖脂類，如鼠李糖脂、槐糖脂和海藻糖脂;②以低縮氨酸為親水基的含氨基酸類脂，如脂肽、脂蛋白和脂氨基酸;③以磷酸為親水基的磷脂，如磷脂酰乙醇胺;④以羧酸基為親水基的脂肪酸，如甘油酯、脂肪酸、脂肪醇和蠟;⑤結(jié)合多糖、蛋白質(zhì)及脂的聚合物，如脂多糖復(fù)合物和脂雜多糖。表1［1］列出了生物表面活性劑的種類及其微生物來源。

表1 生物表面活性劑的微生物來源

3 生物表面活性劑的生產(chǎn)工藝

生物表面活性劑的合成方法分為兩類，微生物發(fā)酵法和酶催化法。國(guó)內(nèi)外對(duì)微生物法合成生物表面活性劑已做了大量的研究，并在發(fā)酵過程中分離和鑒定了不同種類的微生物和產(chǎn)生的相應(yīng)生物表面活性劑。

3.1 微生物發(fā)酵生產(chǎn)生物表面活性劑

3.1.1 生物表面活性劑產(chǎn)生菌的選育

選育生物表面活性劑產(chǎn)生菌的關(guān)鍵在于建立有效的篩選模型。表2介紹了目前常采用的一些篩選生物表面活性劑產(chǎn)生菌的方法。

表2 生物表面活性劑產(chǎn)生菌的篩選方法

從表2中可以看出，以下方法都各有優(yōu)缺點(diǎn)。因此，在實(shí)際篩選生物表面活性劑生產(chǎn)菌的過程中，通常會(huì)將2～3種方法結(jié)合起來使用［2］。

3.1.2 生物表面活性劑的發(fā)酵工藝研究

影響生物表面活性劑的因素有培養(yǎng)基組成和環(huán)境因素。

3.1.2.1 碳源對(duì)生物表面活性劑發(fā)酵生產(chǎn)的影響

許多研究發(fā)現(xiàn)，碳源對(duì)生物表面活性劑的種類和產(chǎn)量都會(huì)產(chǎn)生重要影響。Finnerty和Singer曾報(bào)道［11］，脂肽類生物表面活性劑Surfactin中的脂肪酰部分和短肽部分都是直接從糖類合成的。Arlhrobacter paraffineus產(chǎn)生的糖脂類生物表面活性組成會(huì)隨培養(yǎng)基碳源而變化;當(dāng)碳源為果糖時(shí)，A.paraffineus就會(huì)產(chǎn)生果糖脂;當(dāng)碳源為蔗糖時(shí)，則產(chǎn)生葡萄糖脂和蔗糖脂［12］。

玉米油、豬油(富含非飽和及飽和脂肪)和長(zhǎng)鏈醇類能強(qiáng)化生物表面活性劑的產(chǎn)量(100～165 mg/g底物);葡萄糖和琥珀酸鹽之類的親水性碳源卻導(dǎo)致低產(chǎn)量(12～36 mg/g底物)。在Torulopsis bombicola生產(chǎn)各種槐糖脂時(shí)，在含10%D－葡萄糖的液體培養(yǎng)基中加入油性基質(zhì)植物油能夠提高生物表面活性劑產(chǎn)率，產(chǎn)量達(dá)到 80 g/L［14－15］。

3.1.2.2 氮源對(duì)生物表面活性劑發(fā)酵生產(chǎn)的影響

研究表明，氮源對(duì)微生物生產(chǎn)生物表面活性劑有關(guān)鍵作用。Peypoux和 Michel的研究表明［16］，培養(yǎng)基中L－氨基酸的濃度能夠?qū)ι锉砻婊钚詣㏒urfactin Val－7或Leu－7的生物合成結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。Yakimov等的研究也顯示，在培養(yǎng)基中添加L－谷氨酸和L－天門冬氨酸可以使Bacillus licheniformis BAS50生產(chǎn)的脂肽類生物表面活性劑lichenysin－A產(chǎn)量分別增加2倍和4倍。Pseudomonas 44T1在橄欖油中生產(chǎn)生物表面活性劑的最好氮源是硝酸鹽。

3.1.2.3 金屬陽(yáng)離子對(duì)生物表面活性劑發(fā)酵生產(chǎn)的影響

限制多價(jià)陽(yáng)離子對(duì)生物表面活性劑的產(chǎn)量有積極影響。Guerra－Santos等的研究揭示［17］，減少培養(yǎng)基中鎂離子、鈣離子、鉀離子或鈉離子的濃度能夠促進(jìn)P.aeruginosa DSM 2659合成鼠李糖脂。限制鐵離子濃度可以提高P.fluorescens［18］和P aeruginosa的生物表面活性劑產(chǎn)量。

3.1.2.4 環(huán)境因素對(duì)生物表面活性劑發(fā)酵生產(chǎn)的影響

影響生物表面活性劑產(chǎn)量較多的環(huán)境因素有pH值、溫度、氧濃度和鹽度。Desai和Banat的研究證實(shí)［19］，溫度、pH值和氧濃度等環(huán)境因素可以通過影響細(xì)胞的生長(zhǎng)和活力來影響生物表面活性劑的產(chǎn)量。鹽濃度同樣可以通過影響細(xì)胞活力的方式來影響生物表面活性劑的產(chǎn)量，但是高濃度的鹽對(duì)有些產(chǎn)物的產(chǎn)量并沒有多大影響［20］。

3.1.3 生物表面活性劑的分析

微生物產(chǎn)生的生物表面活性劑具有多種化學(xué)結(jié)構(gòu)，不同微生物產(chǎn)生的表面活性劑不同，其分析方法也是多種多樣的。生物表面活性劑的結(jié)構(gòu)分析方法主要有:薄層色譜層析、高效液質(zhì)聯(lián)用法、高效氣質(zhì)聯(lián)用法、傅里葉紅外光譜法、核磁分析等。

3.1.4 生物表面活性劑的分離和純化

用于石油工業(yè)的生物表面活性劑可以直接使用發(fā)酵液，而用于食品和醫(yī)藥等行業(yè)的生物表面活性劑則對(duì)產(chǎn)品的純度要求較高。華兆哲等［21］利用三氯甲烷和丙酮混合液作為洗脫液進(jìn)行硅膠柱層析可獲得甘露糖赤蘚糖醇脂，Kim等采用(NH4)2SO4分級(jí)分離，冷凍丙酮和正己烷處理、硅膠柱層析和Sephadex LH－20凝膠柱層析等步驟。在分離生物表面活性劑，尤其是糖脂類生物表面活性劑時(shí)，較多采用溶劑法和硅膠柱法［12］。Kuyukina發(fā)現(xiàn)用叔丁基甲醚提取生物表面活性劑時(shí)，粗提液中收率高達(dá)10 g/L，CMC達(dá)130～170 mg/L，表面張力和界面張力分別為29 mN/m和29 mN/m。

3.2 酶催化法合成生物表面活性劑

酶法合成的表面活性劑分子多是一些結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單的分子。酶促反應(yīng)合成生物表面活性劑具有:①比發(fā)酵法合成品在結(jié)構(gòu)上更接近化學(xué)合成商品表面活性劑，因而可以立即應(yīng)用于化學(xué)合成產(chǎn)物原有的應(yīng)用領(lǐng)域;②通過酶法處理，可以對(duì)親油基結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾，并將之接駁到生物表面活性劑的親水基結(jié)構(gòu)上;③酶法反應(yīng)具有專一性，可在常溫和常壓下進(jìn)行，產(chǎn)物易回收，副產(chǎn)物少。

酶法生產(chǎn)表面活性劑主要有非水溶劑催化法和無溶劑法，例如:使用根霉脂肪酶、假單胞菌脂肪酶等催化生成脂肪酸甘油單酯，胰脂酶和放線菌磷脂酶生產(chǎn)磷脂;由假絲酵母、毛霉、青霉、曲霉、紫色桿菌、假單胞菌的脂肪酶、胰脂酶，甚至由枯草桿菌生產(chǎn)的一種脂肽可生產(chǎn)不同的糖酯;由毛霉、根霉和假單胞菌脂肪酶可以生產(chǎn)含氨基酸類脂等。

4 生物表面活性劑在石油化工中的應(yīng)用

生物表面活性劑應(yīng)用潛力最大的是石油工業(yè)，它對(duì)生物表面活性劑的純度和專一性要求不高，可直接使用含完整細(xì)胞的發(fā)酵液。

4.1 在石油開采中的應(yīng)用

利用微生物提高石油采收率的技術(shù)目前前景看好。通過篩選合適的采油微生物，可產(chǎn)生各種生物表面活性劑，以滿足不同原油和不同地質(zhì)的要求。本世紀(jì)初，國(guó)內(nèi)外許多油田研究機(jī)構(gòu)已成功研制出了鼠李糖脂、槐糖脂、海藻糖脂等多種糖脂型生物表面活性劑，并在現(xiàn)場(chǎng)開采過程中取得良好的效果。

據(jù)報(bào)道，大慶油田分離得到一株枯草芽孢桿菌代謝的脂肽生物表面活性劑，研究表明，該脂肽表面活性劑具有優(yōu)良的乳化和降低油水界張力的能力，并可適應(yīng)油藏中復(fù)雜環(huán)境，可提高采收率9.2%，在微生物采油中具有較好的應(yīng)用前景。Youssef等［20］的實(shí)驗(yàn)表明，在注入到石灰?guī)r油藏后，芽孢桿菌能夠產(chǎn)生生物表面活性劑并顯著提高原油的產(chǎn)量。

4.2 在石油污染生物修復(fù)技術(shù)中的應(yīng)用

有大量的研究成功地使用微生物和生物表面活性劑結(jié)合的方法來修復(fù)石油污染的土壤。P.aeruginosa產(chǎn)生的鼠李糖脂類生物表面活性劑能夠增溶烴類化合物，強(qiáng)化其生物降解過程。Das和Mukherjee的研究表明［22］，B.subtilis DM－04和 P.aeruginosa M/NM這三株表面活性劑產(chǎn)生菌能夠在原油污染的土壤中產(chǎn)生自然的、無毒的、可降解的表面活性劑;同時(shí)它們的生物表面活性劑能夠在被降解前有效增強(qiáng)原油的生物降解。Bordoloi和Konwar的研究證實(shí)［23］，生物表面活性劑可以使烴類混合物的流動(dòng)性 大 大 增 強(qiáng);P.aeruginosaMTCC7814 和MTCC7815的產(chǎn)物能夠增強(qiáng)多環(huán)芳烴的降解，它們?cè)诤蟹头频呐囵B(yǎng)基中能分別產(chǎn)生0.38 g/L和0.45 g/L的生物表面活性劑。Saeki等直接對(duì)培養(yǎng)有生產(chǎn)表面活性劑產(chǎn)生菌Gordonia sp.JE－1058的培養(yǎng)液在無菌環(huán)境下進(jìn)行噴霧干燥，制成能夠在缺少溶劑情況下有效分散泄漏原油的修復(fù)劑JE1058BS;這種修復(fù)劑不僅可以通過強(qiáng)化土著海洋微生物的活性來增強(qiáng)泄漏原油的降解，而且它的添加還可以加快原油從被污染的海邊沙灘的驅(qū)除［24］。

4.3 在原油清蠟和乳化中的應(yīng)用

原油中含蠟量較高，會(huì)析出蠟晶體固著在井壁，堵塞孔隙通道，降低原油流動(dòng)性和產(chǎn)量。生物表面活性劑可清洗井壁，溶解固形石蠟，提高原油產(chǎn)量。事實(shí)上，生物催化劑還不能完全對(duì)石蠟進(jìn)行清除，只是把石蠟中的大分子物質(zhì)分解為小分子液態(tài)有機(jī)物。開采出的原油中都含有水，水中又含鹽分和其他雜質(zhì)，會(huì)加大輸送管線及設(shè)備的負(fù)荷;同時(shí)也會(huì)造成設(shè)備的腐蝕，對(duì)后續(xù)工作及相應(yīng)設(shè)備帶來不良影響。油中含水量過高或水中含油量過高，還會(huì)帶來二次污染;因此輸出前必須進(jìn)行破乳脫水處理。

油田原油的破乳脫水技術(shù)主要應(yīng)用的是添加化學(xué)破乳劑，但一般情況下，這些化學(xué)破乳劑的適應(yīng)性差、選擇性強(qiáng)、用量大、成本高、效果不佳。生物表面活性劑具有較強(qiáng)的破乳性，不僅能乳化碳?xì)浠衔?，而且無毒，能被生物完全降解，對(duì)環(huán)境不造成污染，還能穩(wěn)定其乳化體系、分離、回收石油餾分，提高對(duì)資源的再利用。勝利油田應(yīng)用HRB－4型生物破乳劑取得了顯著的效果:原油含水低于15%，較原來降低10%，凈化油含水≤0.5%［25］。

5 展望

生物表面活性劑是最近發(fā)展起來的一類新型表面活性劑，目前除了在石油工業(yè)受到重視外，在食品工業(yè)、洗滌化妝品、環(huán)境工程、生物醫(yī)療和農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域都有廣泛的研究。今后，生物表面活性劑的發(fā)展方向主要是圍繞在優(yōu)化生產(chǎn)技術(shù)，降低成本，擴(kuò)展應(yīng)用范圍，完善作用機(jī)理，消除可能造成的二次污染等問題上。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，生物表面活性劑在各領(lǐng)域的應(yīng)用范圍必將進(jìn)一步擴(kuò)大。

［1］Muligan C N.Environmental applications for biosurfactants［J］.Environ Pollut，2005，133:183－198.

［2］Youssef N H，Duncan K E，Nagle D P，et al.Comparison of methods to detect biosurfactant production by diverse microorganisms［J］.J Microbiol Methods，2004，56:339－347.

［3］Pansiripat S，Pornsunthorntawee O，Rujiravanit R，et al.Biosurfactant production by Pseudomonas aeruginosa SP4 using sequencing batch reactors:Effect of oil－to－glucose ratio［J］.Biochem Eng J，2010，49:185－191.

［4］Mulligan C N，Cooper D G，Neufeld R J.Selection of microbes producing biosurfactants in media without hydrocarbons［J］.J Ferment Technol，1984，62:311－314.

［5］Carrillo P G，Mardaraz C，Pitta－Alvarez S I，et al.Isolation and selection of biosurfactant producing bacteria［J］.W J Microbiool Biotechnol，1996，12:82－84.

［6］Siegmund I，Wagner F.New method for detecting rhamnolipids excreted by Pseudomonas spp.during growth on mineral agar［J］.Biotechnol Tech，1991，5:265－268.

［7］Mokikawa M，Ito M，Imanaka T.Isolation of a new surfactin producer Bacillus pumilus A－1，and cloning and nucleotide sequence of the regulator gene，psf－1［J］.J Ferm Bioeng，1992，74:255－261.

［8］Mutalik S R，Vaidya B K，Joshi R M，et al.Use of response surface optimization for the production of biosurfactant from Rhodococcus spp.MTCC 2574［J］.Bioresour Technol，2008，99:7875－7880.

［9］Morikawa M，Hirata Y，Imanaka T.A study on the structure－function relationship of lipopeptide biosurfactants［J］.Biochem Biophy Acta，2000，1488:211－218.

［10］Jain D K，Collins－Thompson D L，Lee H，et al.A drop－collapsing test for screening surfactant－producing microorganisms［J］.J Microbial Methods，1991，13:271－229.

［11］Bodour A A，Miller－Maier R M.Application of modified drop－collapse technique for surfactant quantization and screening of biosurfactant－producing microorganisms［J］.J Microbial Methods，1998，32:273－280.

［12］Finnerty W R，Singer M E.Microbial biosurfactantphysiology，biochemistry and applications［J］.Dev Ind Microbiol，1985，25:31－40.

［13］Suzuki T，Tanaka H，ltoh S.Sucrose lipids of Arthrobacteria，Corynebaeteria and Nocardia grown on sucrose［J］.Agric Biol Chem，1974，38:557－563.

［14］Asmer H J，Lang S，Wagner F，et al.Microbial production，structure，elucidation and bioconversion of sophrose lipid［J］.J Am Oil Chem Soc，1988，65:1460－1466.

［15］Cooper D G，Eccles E R A，Sheppard J G.The effect of surfactants on peat dewatering［J］.Can J Chem Eng，1988，66:393－397.

［16］Peypoux F，Michel G.Control biosynthesis of Val－7 and Leu－7 surfactins［J］.Appl Microbiol Biotechnol，1992，36:515－517.

［17］Guerra－Santos L H，Kappeli O，F(xiàn)lechter A.Dependence of Pseudomonas aeruginosa continuous culture biosurfactant production on nutritional and environmental factors［J］.Appl Microbiol Biotechnol，1986，24:443－448.

［18］Persson A，Molin G，Weibull C.Physiological and mor phological changes induced by nutrient limitation of Pseudomonas fluorescens 378 in continuous culture［J］.Appl Environ Microbiol，1990，56:686－692.

［19］Abu－Ruwaida A S，Banat I M，Hadirto S，et al.Isolation of biosurfactant producing bacteria－product characterization and evaluation［J］.Acta Biotechnol，1991，11:315－324.

［20］Youssef N，Simpson D R，Duncan K E，et al.In situ biosurfactant production by bacillus strains injected into a limestone petroleum reservoir［J］.Environ Microbiol，2007，73:1239－1247.

［21］華兆哲，陳 堅(jiān)，朱文昌，等.新型生物表面活性劑甘露糖赤蘚糖醇脂 MEL的分離與表面性質(zhì)研究［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，1999，11(3):13－16.

［22］Noordman W H，Janssen D B.Rhamnolipid stimulates uptake ofhydrophobiccompoundsbypseudomonas aeruginosa［J］.Appl Environ Microbiol，2002，68:4502－4508.

［23］Saeki H ，Sasaki M，Komatsu K，et al.Oil spill remediation by using the remediation agent JE1058BS that contains a biosurfactant produced by Gordonia sp.strain JE－1058［J］.Bioresour Technol，2009，100:572－57.

［24］刁虎欣，王 踐，張心平，等.假單胞菌231菌株烴代謝產(chǎn)生有機(jī)酸和氣體的研究［J］.微生物學(xué)通報(bào)，2000，27(6):413－416.

［25］楊葆華，黃翔峰，聞 岳，等.生物表面活性劑在石油工業(yè)中的應(yīng)用［J］.氣田環(huán)境保護(hù)，2005，(03):17－20.