劉穎 程朱

(1.長(zhǎng)春醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校 長(zhǎng)春 130031; 2.長(zhǎng)春市兒童醫(yī)院 長(zhǎng)春 130021)

近年來(lái),對(duì)腫瘤細(xì)胞死亡的研究越來(lái)越引起重視,用AS2O3治療急性白血病已有了突破的進(jìn)展,其治療機(jī)制是誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡主要表現(xiàn)在細(xì)胞核超微結(jié)構(gòu)改變。最近我們發(fā)現(xiàn)AS2O3重點(diǎn)在線粒體的形態(tài)改變及bcl-2、bax的表達(dá),以闡明AS2O3引起胃癌凋亡的作用點(diǎn),并證實(shí)AS2O3是一種線粒體毒性藥物。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和用藥方法

細(xì)胞為北京腫瘤研究所人胃癌細(xì)胞株,將細(xì)胞培養(yǎng)在培養(yǎng)瓶和培養(yǎng)板,內(nèi)置蓋玻片,每孔接種細(xì)胞5×104個(gè),分1、23umol/L濃度AS2O3及1組對(duì)照組,在第2,4,6,12,24h取標(biāo)本檢查。

1.2 透射電鏡檢查

收獲細(xì)胞離心團(tuán),2.5%戊二醛固定,常規(guī)電鏡制樣,日立H-300電鏡檢查。

1.3 流式細(xì)胞儀檢查

DNA倍體測(cè)定按常規(guī)制樣,碘化丙錠染色,檢查細(xì)胞周期和凋亡峰。Annexin-v檢測(cè),取培養(yǎng)細(xì)胞106用PBS洗,離心。Annexin-v-fluos標(biāo)記試劑盒購(gòu)自Boehringer Mannheim公司,按試劑盒方法作活細(xì)胞染色,流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.4 羅達(dá)明123(Rhodamin123)熒光探針標(biāo)記

Rho123,w381,MolecularProbes公司產(chǎn)品。細(xì)胞在24孔板蓋玻片上生長(zhǎng)。1,2,3umol/L AS2O3作用,定時(shí)取片,Rho123(10ug/mL)染色,CO2培養(yǎng)箱溫育,在落射熒光顯微鏡下檢查,激發(fā)光505nm,發(fā)射光534nm。

1.5 免疫組織化學(xué)檢查

用細(xì)胞離心機(jī),收集脫落細(xì)胞,4%甲醛固定。bcl-2、bax免抗人多克隆抗體及SP免疫組織化學(xué)試劑盒(Santaruz公司產(chǎn)品),按試劑盒操作方法。

2 結(jié)果

2.1 凋亡細(xì)胞的形態(tài)改變

培養(yǎng)細(xì)胞加不同濃度AS2O3后24h均出現(xiàn)細(xì)胞凋亡,多數(shù)細(xì)胞核染色質(zhì)凝集靠邊呈典型凋亡細(xì)胞核改變。

2.2 細(xì)胞凋亡的指標(biāo)

1umol/L AS2O3作用早期凋亡細(xì)胞較少,AS2O32umol/L作用4h Annexin-v顯示早期凋亡占7.1%。DNA組方圖顯示凋亡峰,12h凋亡細(xì)胞7.5%,24h凋亡細(xì)胞占35%,3umol/L AS2O3作用細(xì)胞易進(jìn)入凋亡后期改變。

2.3 線粒體熒光標(biāo)記

加藥2h線粒體數(shù)目增加,4h出現(xiàn)粗大線粒體,多在胞質(zhì)外帶。12h及24h線粒體外形結(jié)構(gòu)不清。

2.4 細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變

不同濃度AS2O3作用2～4h,有的線粒體腫脹,內(nèi)嵴減少,有電子密度高的不定形物質(zhì)沉淀,細(xì)胞核染色質(zhì)開始凝集。作用6h可見(jiàn)線粒體嵴消失;12h外膜消失,基質(zhì)呈氣球樣,并可見(jiàn)自噬泡。作用24h細(xì)胞皺縮,核變圓,染色質(zhì)凝聚靠邊,出現(xiàn)凋亡改變。

2.5 bcl-2和bax表達(dá)

不同濃度 AS2O3作用2、6、12、24h時(shí)收集細(xì)胞,bcl-2蛋白產(chǎn)物免疫組織化學(xué)檢測(cè)呈陰性,bax蛋白產(chǎn)物免疫組織化學(xué)染色呈深褐色,為高度表達(dá)。

3 討論

細(xì)胞凋亡是一個(gè)發(fā)展的過(guò)程,有其早、中、晚期的改變,不同濃度AS2O3作用于癌細(xì)胞4～6h時(shí)出現(xiàn)凋亡早期改變;3umol/L AS2O3作用24h凋亡細(xì)胞出現(xiàn)晚期改變,多數(shù)細(xì)胞死亡,出現(xiàn)細(xì)胞皺縮,染色質(zhì)凝集靠邊,核膜不完整。線粒體空泡化和外膜破裂呈氣球狀,胞質(zhì)呈退行性變。線粒體是細(xì)胞進(jìn)行呼吸鏈、電子傳遞、三羧酸循環(huán)和氧化磷酸化的場(chǎng)所,其病變影響到細(xì)胞各成分的協(xié)調(diào)并危及細(xì)胞生命活動(dòng)[1]。線粒體膜通透性改變和跨膜電位改變使線粒體腫脹,位于線粒體內(nèi)外間隙的細(xì)胞色素C進(jìn)入胞質(zhì),激活某些蛋白酶系統(tǒng)[2],是凋亡產(chǎn)生的起源。細(xì)胞核改變是核酸酶進(jìn)入核內(nèi)使染色質(zhì)致密化和DNA斷裂。

通過(guò)我們的實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)了bcl-2表達(dá)下調(diào)和bax表達(dá)增加,證實(shí)這兩者參與了細(xì)胞凋亡的過(guò)程。bcl-2可以預(yù)防細(xì)胞凋亡,bax能促進(jìn)線粒體膜通透性改變,使其細(xì)胞色素C釋放,引起細(xì)胞凋亡。我們研究證明誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,線粒體在藥物作用4h內(nèi)即開始改變,也可使bcl-2和bax表達(dá)異常而產(chǎn)生細(xì)胞凋亡,因此認(rèn)為AS2O3具有線粒體毒性作用,可用于治療胃癌。

[1]Kunz-S,chaghartLA,HabbersettRC,et al.Mitochondrial function in oncogenttransfected rat fibroblasts isolated from multicellular spheroids[J].Am Jphysiol,1997,273(5pt1):1487～1495.

[2]Basse-wetzelE,NewneyerDD,Grean DR.mitochondrial cytochrome crelease in apoposis occers upstream of DEVD-specific caspase activation and independently of mitochondrial transmenbrane depolarization[J].EMBOJ,1998,17:37～49.