陳寅 綜述 鐘竑 審校

肺癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率及病死率呈明顯增高的趨勢。雖然近年來在肺癌的診斷和治療上有了很大的進(jìn)展，但是肺癌患者的5年生存率仍未超過16%[1]。腫瘤干細(xì)胞學(xué)說認(rèn)為，肺癌組織中一類數(shù)量較少但具有較強的致瘤性、自我更新、無限增殖以及分化潛能的細(xì)胞是肺癌發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)、耐受放化療以及肺癌細(xì)胞具有侵襲性的主要原因，因其具有干細(xì)胞樣特性被稱為肺癌干細(xì)胞。在肺癌組織中靶定并清除這類腫瘤干細(xì)胞或許會給肺癌的治療帶來更為有效的方案[2]。近年研究發(fā)現(xiàn)在人類多種實體腫瘤中存在CD133+腫瘤干細(xì)胞，如肺癌、室管膜瘤、前列腺癌、結(jié)腸癌、肝癌、喉癌、黑色素瘤、卵巢癌、胰腺癌[3]、骨肉瘤[4]及膽囊癌[5]等。隨著在腦腫瘤干細(xì)胞中AC133/AC141陽性細(xì)胞群的發(fā)現(xiàn)，以AC133和AC141表位作為標(biāo)記已經(jīng)廣泛應(yīng)用于其他實質(zhì)性腫瘤干細(xì)胞的純化。有些機構(gòu)聯(lián)合應(yīng)用AC133和AC141表位作為腫瘤干細(xì)胞的標(biāo)記物。但已有研究[6]檢測到AC133與AC141表位表達(dá)的不一致；并且即使能夠檢測到CD133蛋白的存在其表位也可能缺失[3]。此外，有研究[7,8]顯示CD133的表達(dá)受氧濃度水平調(diào)節(jié)。此外還未確定的CD133的生物學(xué)功能、是否存在CD133陰性的肺癌干細(xì)胞以及目前流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行細(xì)胞分析時存在的潛在技術(shù)缺陷，提示若在實驗中用CD133作為肺癌干細(xì)胞的標(biāo)記物需要進(jìn)行嚴(yán)密的評估以及慎重的考慮，并且要重視其它一些直接參與保持肺癌干細(xì)胞特性的腫瘤干細(xì)胞表面標(biāo)記物。

1 干細(xì)胞與腫瘤干細(xì)胞

干細(xì)胞是一類具有自我更新、無限增殖和多向分化潛能的細(xì)胞。1959年Makino等[9]首次提出腫瘤干細(xì)胞假說，并指出腫瘤可能由腫瘤干細(xì)胞產(chǎn)生。直到2001年腫瘤干細(xì)胞這一概念才被正式提出。腫瘤干細(xì)胞學(xué)說認(rèn)為腫瘤組織中存在一類數(shù)量較少，但是具有較強致瘤性，自我更新、無限增殖以及分化潛能的細(xì)胞，因其具有干細(xì)胞樣特性被稱為腫瘤干細(xì)胞（cancer stem cell, CSC）。這類細(xì)胞是腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)、耐受放化療以及腫瘤細(xì)胞具有侵襲性的主要原因。目前研究認(rèn)為腫瘤干細(xì)胞與干細(xì)胞存在以下相似點：①均具有自我更新、無限增殖和分化潛能，不同的是干細(xì)胞的增殖具有穩(wěn)定性，當(dāng)組織處于穩(wěn)定狀態(tài)時，平均一個干細(xì)胞產(chǎn)生一個子代干細(xì)胞和一個特定分化細(xì)胞，其干細(xì)胞總數(shù)保持恒定，而腫瘤細(xì)胞無自穩(wěn)定性的特點；②均存在相似的生長調(diào)控信號通路，如Wnt/β-catenin[10]、Notch、Shh （Sonichedgehog）和Bmi-1等信號通路[11]，它們的異常表達(dá)可引起細(xì)胞過度增殖而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生；③具有端粒酶活性以及擴增的端粒重復(fù)序列，而人類終末分化體細(xì)胞不具有或者具有極低的端粒酶活性[12]；④具有比較類似的表面標(biāo)志物，如lnestin、CDl33、sox-2、musashi-1、Bmi-l、survivin、ABCG-2等；⑤干細(xì)胞具有遷移的特性，而CSCs則具有轉(zhuǎn)移的能力；⑥長期處于細(xì)胞增殖周期的靜止期（G0）；⑦均通過對稱及不對稱兩種方式分裂；⑧干細(xì)胞與CSCs在一定的條件下還可以相互轉(zhuǎn)化，如胚胎植入體內(nèi)可以誘導(dǎo)分化成畸胎瘤，而畸胎瘤細(xì)胞注入鼠囊胚內(nèi)可以形成正常胚胎。

2 CD133的發(fā)現(xiàn)

人CD133蛋白與鼠prominin-1（一種富集于神經(jīng)上皮干細(xì)胞頂端表面微絨毛上的表面蛋白）有大約60%的同源性[13]，故也稱人CD133為人prominin-1。CD133是一個5次跨膜糖蛋白，最初于1997年作為CD34陽性造血干細(xì)胞上的表面抗原被AC133單抗靶定而被發(fā)現(xiàn)[14]。與此同時測定其分子量約為97 kDa，由865個氨基酸組成[15]，包括85個氨基酸N端胞外域、5個跨膜區(qū)、2個大的胞外環(huán)（包含8個潛在的連接N端的糖基化位點）以及一個由50個氨基酸組成的胞內(nèi)尾端。有研究[14]表明AC133抗原是一個表觀分子量為120 kDa的糖基化蛋白。同年發(fā)現(xiàn)了另一個CD133糖基化表位-AC141[15]。熒光激活細(xì)胞分選術(shù)（fluorescence-activated cell sorting, FACS）顯示抗AC133抗體和抗AC141抗體能夠識別空間結(jié)構(gòu)特異的表位[14]。對經(jīng)過衣霉素處理的細(xì)胞進(jìn)行免疫沉淀試驗發(fā)現(xiàn)AC133和AC141都能夠識別糖基化的結(jié)構(gòu)[15]，提示由抗AC141抗體所識別的CD133的糖基化表位與抗AC133抗體所識別的CD133的糖基化表位空間結(jié)構(gòu)不一致，分別稱為AC133表位和AC141表位。針對AC133表位和AC141表位開發(fā)出了商業(yè)化的單克隆抗體 CD133-1和CD133-2，并被廣泛用于CD133表達(dá)的檢測[3]，可以認(rèn)為AC133和AC141只是糖基化CD133表位的兩個亞型。

3 CD133陽性的肺癌細(xì)胞

Eramo等[16]檢測到肺癌組織中存在CD133陽性的腫瘤細(xì)胞，其數(shù)量較少，但與對照組的正常肺組織相比腫瘤中CD133表達(dá)的百分比總是高。選取的腫瘤組織類型包括鱗癌、腺癌、大細(xì)胞肺癌以及小細(xì)胞肺癌。進(jìn)一步定量檢測發(fā)現(xiàn)CD133表達(dá)百分比與腫瘤亞型無明顯相關(guān)性。同時檢測到CD133陽性的非小細(xì)胞肺癌表達(dá)上皮細(xì)胞粘附因子（Ep-CAM），與結(jié)腸癌相似[17]，表明肺癌中CD133陽性的腫瘤細(xì)胞與未分化的上皮細(xì)胞數(shù)量增多有關(guān)。Eramo等[16]將CD133陽性肺癌細(xì)胞和CD133陰性肺癌細(xì)胞從肺癌標(biāo)本中分離出來分別移植入小鼠中，CD133陽性的肺癌細(xì)胞能夠在小鼠中再生出原始腫瘤，但CD133陰性的肺癌細(xì)胞則缺乏這種能力。進(jìn)一步量化將104個CD133陽性肺癌細(xì)胞經(jīng)皮下注射移植入SCID小鼠可再生出原始腫瘤，但是105個CD133陰性肺癌細(xì)胞以同樣的方式移植入同樣的小鼠卻未能再生出原始腫瘤，表明CD133陽性的肺癌細(xì)胞與CD133陰性的肺癌細(xì)胞相比具有更強的致瘤能力。與其他腫瘤中發(fā)現(xiàn)的致瘤細(xì)胞類似，CD133陽性的肺癌細(xì)胞較CD133陰性的肺癌細(xì)胞具有更強的增殖及自我更新潛能。分別將CD133陰性的肺癌細(xì)胞和CD133陽性的肺癌細(xì)胞在相同的適宜培養(yǎng)條件下進(jìn)行體外培養(yǎng)，CD133陰性肺癌細(xì)胞在培養(yǎng)2周-3周后逐漸死亡，且未能獲得CD133表位表達(dá)；1個-2個月后CD133陽性肺癌細(xì)胞形成腫瘤球并繼續(xù)生長，檢測腫瘤球發(fā)現(xiàn)其含有數(shù)量較多的自我更新細(xì)胞約為5%-30%。此外，CD133陽性肺癌細(xì)胞在一定的培養(yǎng)條件下能夠生發(fā)出相應(yīng)類型的肺癌細(xì)胞，經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)其表達(dá)譜系特異的標(biāo)記物，但丟失了CD133的表達(dá)。

Bertolini等[18]也發(fā)現(xiàn)在原發(fā)非小細(xì)胞肺癌組織中CD133陽性細(xì)胞遠(yuǎn)比正常肺組織多，并且表現(xiàn)出干細(xì)胞樣特性以及對于鉑類藥物的耐受。Chen等[19]從肺癌組織樣本中分離得到CD133陽性肺癌細(xì)胞和CD133陰性細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)CD133陽性的肺癌細(xì)胞高表達(dá)Oct4。Oct4表達(dá)于多能胚胎干細(xì)胞，并可以作為多能胚胎干細(xì)胞的一個重要標(biāo)記物[20-22]。同時，Chen等[19]測得CD133陽性的肺癌細(xì)胞，高度共表達(dá)多重耐藥標(biāo)記ABCG2，并表現(xiàn)出較強的耐受放化療特性。ABCG2最早發(fā)現(xiàn)于乳腺癌細(xì)胞株MCF-7/Adr-Vp3000中，并被認(rèn)為與乳腺癌多耐藥性相關(guān)[23]。目前已被證實多種腫瘤干細(xì)胞中表達(dá)ABCG2并與其耐藥性相關(guān)。

近年來根據(jù)CD133陽性肺癌細(xì)胞存在的干細(xì)胞特性進(jìn)行了較多的研究。Woo等[24]對177例I期肺腺癌患者的樣本分析發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)CD133患者其5年無瘤生存率顯著低于低表達(dá)CD133患者，并認(rèn)為CD133陽性肺腺癌細(xì)胞表達(dá)率的高低可作為一個獨立因子來評價患者術(shù)后腫瘤的復(fù)發(fā)情況。另有報道[25]稱CD133與非小細(xì)胞肺癌耐藥性相關(guān)，但是與患者生存期無明顯關(guān)聯(lián)。隨著研究的深入或許在不久的將來CD133將成為臨床上肺癌診斷、預(yù)后的重要指標(biāo)。更為重要的是，若能夠靶定CD133肺癌細(xì)胞并抑制其活性進(jìn)而將其清除，或許將會給肺癌的臨床治療帶來新的突破[26]。

4 CD133作為肺癌干細(xì)胞表面標(biāo)記物的局限性

4.1 AC133和AC141作為腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記表位的爭論 到目前為止，幾乎所有CD133相關(guān)的實驗都運用到抗AC133抗體和抗AC141抗體這兩種單克隆抗體，其最初是用來純化和標(biāo)記造血干細(xì)胞及其前體細(xì)胞，后來用作鑒定CD133表面抗原[14]。雖然運用抗AC133和抗AC141單抗來純化和鑒定肺癌干細(xì)胞群的成功報道越來越多，但是在解讀這些結(jié)果的時候需要考慮以下幾點：①目前已經(jīng)證實AC133和AC141是兩個空間結(jié)構(gòu)不同的糖基化表位[14,15]，但是AC133和AC141在分子水平上的屬性還沒有確切的證據(jù)，在CD133蛋白上被AC133、AC141單抗靶定的氨基酸殘基的精確定位還沒有十分明確[3]；②雖然AC133和AC141單抗常規(guī)用以分析以及提純細(xì)胞，但是在骨髓增生異常綜合征和急性髓系白血病患者中其骨髓前體細(xì)胞和外周血干細(xì)胞上的AC133和AC141表位表達(dá)不一致[6]。有研究[27,28]表明AC133和AC141表位獨立于CD133蛋白或其mRNA而表達(dá)下調(diào)，并且發(fā)現(xiàn)CD133蛋白的mRNA其組織分布的廣度更甚于AC133表位的表達(dá)范圍[15]；③CD133存在諸多亞型，人類CD133基因包括在4號染色體上至少152 kb長的37個外顯子，迄今已有報道過人和鼠中存在數(shù)個CD133的亞型[29-31]，如一種CD133亞型（稱為CD133-2）缺乏外顯子4，導(dǎo)致其胞外域N端缺失9個氨基酸，但被認(rèn)為是造血干細(xì)胞上主要的CD133亞型，并且推測其能夠被AC133和AC141單抗所識別。AC133和AC141只是CD133蛋白的兩個糖基化表位，目前對于缺失AC133和/或AC141表位的CD133亞型是否存在還是一個未知數(shù)，以及不能完全排除 AC133/AC141抗體還可識別CD133以外其他分子上的糖基化表位的可能[5]。有研究[28]采用非糖基化依賴的CD133抗體，發(fā)現(xiàn)分化后的Caco2細(xì)胞仍然恒定表達(dá)CD133未明顯降低。因此，沒有經(jīng)過確切檢測CD133蛋白或mRNA水平而把AC133或AC141表位陰性的細(xì)胞稱之為CD133陰性細(xì)胞不合理，將CD133的糖基化表位作為腫瘤干細(xì)胞的標(biāo)記比CD133蛋白水平可能要更確切[3]；④AC141單抗與細(xì)胞角蛋白18存在交叉反應(yīng)[32]，這對經(jīng)過固定的細(xì)胞或者破壞了細(xì)胞膜的細(xì)胞進(jìn)行免疫組化研究時將會是一個干擾因素[3]。

4.2 CD133的生物學(xué)功能尚不明確 目前對CD133或其糖基化表位在調(diào)節(jié)腫瘤干細(xì)胞表型時是否起著直接的作用還不清楚，對于CD133的生物學(xué)功能還知之甚少[3]。CD133位于各類細(xì)胞中質(zhì)膜的突出部，其與膜部膽固醇相互作用，并且作為脂微域的標(biāo)記物[33]。推測這些膜微域中富含維持干細(xì)胞特性的組分，一旦通過細(xì)胞的不對稱分裂將其丟失，或許會促進(jìn)細(xì)胞的分化[34]。有研究[35]證明單個核苷酸的缺失會造成CD133的縮短從而導(dǎo)致視網(wǎng)膜變性。迄今為止尚缺乏定向敲除CD133的研究，對AC133/AC141陽性的肺癌干細(xì)胞進(jìn)行定向敲除CD133，然后檢測其致瘤能力，這或許會在確定CD133是否在肺癌干細(xì)胞的致瘤性中扮演重要角色提供進(jìn)一步的實驗依據(jù)[3]。

4.3 CD133陰性的肺癌干細(xì)胞 因為存在很多影響CD133表達(dá)的因素，所以不能完全排除存在CD133陰性的肺癌干細(xì)胞的可能性。有多項研究[36-39]認(rèn)為存在CD133陰性膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的可能性。董強剛等[40]檢測了A549和SPC-A1肺腺癌細(xì)胞，未檢測到CD133特異性mRNA，進(jìn)一步采用流式細(xì)胞術(shù)也未檢測到CD133蛋白表達(dá)，表明可能存在CD133陰性的肺癌干細(xì)胞。Meng等[41]檢測A549和H445肺癌細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，CD133陰性細(xì)胞和CD133陽性細(xì)胞一樣具有成瘤、自我更新、增殖、分化、侵襲以及耐受化療的特性，并認(rèn)為A549和H446肺癌細(xì)胞中CD133陰性細(xì)胞和CD133陽性細(xì)胞均包含有肺癌起始細(xì)胞即肺癌干細(xì)胞。

4.4 氧濃度水平調(diào)節(jié)CD133的表達(dá) 有研究[7,8]發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)髓母細(xì)胞瘤和神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞時降低給氧量（20%降至2%-3%）能夠增加AC133和AC141的表達(dá)及CD133mRNA的水平，并且已經(jīng)證明低氧能夠促使CD133陽性的胰腺癌細(xì)胞更具侵襲性以及增殖能力[42]。在體外進(jìn)行腫瘤干細(xì)胞培養(yǎng)時的氧濃度水平約在20%左右，肺癌在人肺組織中生長環(huán)境的氧濃度水平以及將CD133陽性肺癌細(xì)胞通過皮下注射移植入SCID鼠建立腫瘤再生模型時，其生長環(huán)境的氧濃度水平目前還沒有一個確切的數(shù)據(jù)，可能會因為氧濃度水平的不同導(dǎo)致CD133的表達(dá)水平有所差異，并因此影響其致瘤潛能。因此，今后需要進(jìn)一步的實驗測定不同環(huán)境的氧濃度以及氧濃度在腫瘤干細(xì)胞試驗中是否為一個重要的實驗變量。

4.5 流式細(xì)胞術(shù)的局限性 目前流式細(xì)胞術(shù)廣泛應(yīng)用于檢測CD133，被認(rèn)為具有高精確性及高特異性[43]，但仍存在一定的局限性，包括以下幾方面：①有研究[15,44]稱CD133的865個氨基酸的序列中存在79個胰酶切割位點，其中亦包括多個存在于CD133糖基化胞外域中的位點，胰酶消化分離細(xì)胞可能會影響CD133的形態(tài)結(jié)構(gòu)和/或功能，從而影響其分選；②有報道[44]在胞漿中發(fā)現(xiàn)存在CD133蛋白，而這部分蛋白不會被流式細(xì)胞儀所檢測出來，導(dǎo)致CD133的檢出率下降；③有研究[45]認(rèn)為經(jīng)過流式細(xì)胞術(shù)分選的CD133陽性細(xì)胞在進(jìn)行體外培養(yǎng)時會影響其以腫瘤球的形式生長；④對CD133表達(dá)程度的描述存在主觀性。

綜上所述，在當(dāng)前肺癌干細(xì)胞的研究中CD133充當(dāng)著十分重要的角色，但是CD133作為肺癌干細(xì)胞標(biāo)記物仍存在諸多的疑問和未知。由于影響因素較多且較為復(fù)雜，甚至可能很多影響因素還未被意識到，當(dāng)應(yīng)用CD133對肺癌干細(xì)胞進(jìn)行鑒定提純時，要持有謹(jǐn)慎的態(tài)度。目前多種實體腫瘤已聯(lián)合應(yīng)用多個標(biāo)記物來鑒定提純腫瘤干細(xì)胞，這在當(dāng)前的肺癌干細(xì)胞研究中亦不失為一種嘗試。當(dāng)然，尋找特異性的肺癌干細(xì)胞標(biāo)記物和基因表達(dá)譜仍是今后努力的方向，并期望由此給臨床肺癌的診斷和治療開創(chuàng)新的局面。