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        獨活乙醇提取物對環(huán)氧化酶的影響

        2011-02-10 06:41:20邱建波姜笑寒
        中國醫(yī)藥導報 2011年16期
        關鍵詞:美辛塞來獨活

        邱建波,徐 清,姜笑寒

        廣東省食品藥品職業(yè)技術學校,廣東廣州 510663

        獨活為傘形科植物重齒毛當歸(Angelica pubescens Maxim.f.biserrata Shan et Yuan)的干燥根,其主要功能是祛風除濕,通痹止痛。用于風寒濕痹,腰膝疼痛,少陰伏風頭痛,風寒挾濕頭痛[1]。獨活的化學成分主要有香豆素類和揮發(fā)油類[2-4],以香豆素類為主,治療風濕多泡酒飲用。本研究擬通過獨活的乙醇提取物在體外對環(huán)氧化酶(包括COX-1和COX-2)活性的影響來探討其祛風濕的可能作用機制,為獨活的臨床應用和組方選藥提供理論依據。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        動物:SD雄性大鼠,體重180~220 g,購自中山大學實驗動物中心。

        藥物:稱取粉碎的藥材,加入適量95%乙醇室溫浸泡過夜,用索氏提取器提取1 h,減壓蒸干溶劑,用二甲基亞砜(DMSO)溶解殘留物,15 000 r/min離心 10 min,取上清,定容使其終濃度為1 g/ml(每毫升含1 g生藥),熱壓滅菌后,-20℃保存?zhèn)溆茫瑢嶒炃坝肈MSO稀釋成相應濃度。

        試劑:RPMI 1640干粉購自Gibco公司;花生四烯酸(AA)購自 Cayman 公司;脂多糖(LPS)購自 Sigma公司;胎牛血清(FCS)購自杭州四季青公司;塞來昔布(Celecoxib),輝瑞公司惠贈;吲哚美辛,為標準品,購自中國藥品與生物制品檢定所;PGE2和6-keto-PGF1α放免試劑盒購自解放軍總醫(yī)院東亞放免研究所;其他試劑為國產分析純。

        1.2 方法

        1.2.1 COX-1和COX-2模型的建立 參照文獻[5]方法制備大鼠腹腔巨噬細胞COX-1和COX-2模型。大鼠腹腔注射0.4%明膠4~5 ml,4 h后,擊頭處死大鼠。用冷Hanks液灌洗腹腔,每只10 ml,收集灌洗液,灌洗 3次,1 500 r/min離心5 min,RPMI-1640洗滌2次。調整細胞數為106個/ml,接種至96孔培養(yǎng)板,每孔0.2 ml。在37℃,5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 h,洗去未貼壁細胞,繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,換0.5%FCS的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h,作為COX-1模型。在此基礎上,再以10%FCS的RPMI-1640培養(yǎng)30 min,加入阿司匹林(終濃度1 mmol/L),繼續(xù)培養(yǎng)30 min后,棄上清,PBS沖洗。再加入0.5 μg/ml LPS 的 10%FCS 的 RPMI-1640 培養(yǎng)液 200 μl,繼續(xù)培養(yǎng)6 h后,作為COX-2模型。

        1.2.2對COX-1的影響 在COX-1模型的細胞培養(yǎng)液中加入獨活,使其終濃度分別為 0.1、1、10 g/L;或塞來昔布(COX-2選擇性抑制劑陽性對照,終濃度1×10-6mol/L)、吲哚美辛(COX-1及COX-2抑制劑陽性對照,終濃度1×10-7mol/L); 或陰性對照溶媒 DMSO,37℃,5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng) 30 min,加入底物 AA,使其終濃度為 10 μmol/L,繼續(xù)培養(yǎng) 20 min。取上清按試劑盒要求測125I-6-Keto-PGF1α的放射活性。以PGF1α生成減少的百分率來反映藥物對COX-1活性的抑制作用。抑制率(%)=(對照組PG濃度-給藥組PG濃度)/對照組PG濃度×100%

        1.2.3 對COX-2的影響 在COX-2模型的細胞培養(yǎng)液中加入獨活、塞來昔布、吲哚美辛或陰性對照溶媒,所用藥物的濃度與COX-1相同。37℃,5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)30 min,加入底物AA,使其終濃度為10 μmol/L,繼續(xù)培養(yǎng)20 min。取上清按試劑盒要求測PGE2的放射活性。以PGE2生成減少的百分率來反映藥物對COX-2活性的抑制作用。抑制率的計算公式同上述COX-1。

        1.3 統(tǒng)計學處理

        數據用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件處理,所有結果用均數±標準差(±s)表示,比較采用獨立樣本t檢驗。

        2 結果

        塞萊昔布僅對COX-2有抑制作用,對COX-1的抑制作用與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義;而吲哚美辛對COX-1和COX-2都有抑制作用。獨活則對COX-1和COX-2都有不同程度的抑制作用,并且可以發(fā)現(xiàn)抑制率隨劑量的增加而增大,存在一定的量效關系。另外,在劑量相同時,獨活對COX-2的抑制率大于COX-1。見表1。

        3 討論

        前列腺素(PGs)是一種與炎癥緊密相關的重要介質,COX為PGs生物合成的重要限速酶,隨著COX-2的發(fā)現(xiàn),現(xiàn)在普遍認為COX-1為結構型,它產生的PG參與機體正常生理過程和保護功能,而COX-2則是為誘導型,是經刺激迅速產生的誘導酶,參與炎癥反應,抑制COX-2可以發(fā)揮抗炎作用[6]。本研究采用的是基于大鼠腹腔巨噬細胞的COX-1/-2抑制劑篩選模型[5,7]。在該模型中,低血清(0.5%FCS)的RPMI-1640培養(yǎng)時,COX-2不被誘導,只有COX-1起作用,這時加入底物AA,測定培養(yǎng)基中125I-6-Keto-PGF1α的濃度,可用于COX-1活力的測定。巨噬細胞受LPS誘導后,開始表達COX-2,而COX-1活性很低,利用阿司匹林乙?;疌OX-1,使COX-1失去活性,這時加入底物AA,測定培養(yǎng)基中PGE2的濃度,可用于COX-2活力的測定。獨活的主要功能是祛風除濕,通痹止痛,在臨床上主要入復方治療骨性關節(jié)炎[8]和類風濕性關節(jié)炎[9]。本實驗表明,獨活在3個不同劑量都對COX-2有抑制作用,并隨劑量的增加而作用有增強的趨勢,推測抑制環(huán)氧化酶可能是其祛風濕的作用機制之一。

        表1 獨活對COX-1和COX-2的影響(±s,n=3)

        注:與 DMSO 比較:*P<0.05,**P<0.01

        藥物 劑量 PGF1α(μg/L) 抑制率(%)PGE2(μg/L) 抑制率(%)DMSO塞來昔布吲哚美辛獨活--10-6mol/L 10-7mol/L 0.1 g/L 1 g/L 10 g/L 3.89±0.74 3.53±0.81 1.65±0.34**2.78±0.65 2.24±0.42*1.91±0.46*-95 8 29 42 51 82.32±8.84 46.43±5.75**36.26±5.42**53.38±8.51*38.02±7.73**26.69±8.36**44 56 35 54 68

        [1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典2010年版一部[S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010:246.

        [2]張才煜,張本剛,楊秀偉.獨活化學成分的研究[J].解放軍藥學學報,2007,23(4):241-245.

        [3]楊秀偉,郭慶梅,張才煜,等.獨活化學成分的進一步研究[J].解放軍藥學學報,2008,24(5):389-392.

        [4]丁希飛,馮煦,董云發(fā),等.中藥獨活化學成分的研究[J].中藥材,2008,31(4):516-518.

        [5]潘獻柱,王林,程潔,等.選擇性環(huán)氧合酶-2抑制劑體外篩選模型的建立[J].中國新藥雜志,2006,15(23):2024-2027.

        [6]Marx J.Anti-inflammatories inhibit cancer growth--but how[J].Science,2001,291(5504):581-582.

        [7]潘獻柱,汪曉慶,謝琳琳,等.選擇性環(huán)氧合酶-2抑制劑篩選模型的驗證[J].安徽醫(yī)藥,2009,13(8):879-881.

        [8]吳國芬.獨活寄生湯加味內服外洗治療膝關節(jié)骨性關節(jié)炎[J].浙江中醫(yī)藥大學學報,2010,34(2):205-206.

        [9]楊新玲,宋曉莉.獨活寄生湯治療類風濕性關節(jié)炎68例[J].陜西中醫(yī),2010,31(4):439-440.

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