邱建波，徐 清，姜笑寒

廣東省食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)校，廣東廣州 510663

獨(dú)活為傘形科植物重齒毛當(dāng)歸（Angelica pubescens Maxim.f.biserrata Shan et Yuan）的干燥根，其主要功能是祛風(fēng)除濕，通痹止痛。用于風(fēng)寒濕痹，腰膝疼痛，少陰伏風(fēng)頭痛，風(fēng)寒挾濕頭痛[1]。獨(dú)活的化學(xué)成分主要有香豆素類和揮發(fā)油類[2-4]，以香豆素類為主，治療風(fēng)濕多泡酒飲用。本研究擬通過獨(dú)活的乙醇提取物在體外對(duì)環(huán)氧化酶（包括COX-1和COX-2）活性的影響來探討其祛風(fēng)濕的可能作用機(jī)制，為獨(dú)活的臨床應(yīng)用和組方選藥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

動(dòng)物：SD雄性大鼠，體重180～220 g，購自中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

藥物：稱取粉碎的藥材，加入適量95%乙醇室溫浸泡過夜，用索氏提取器提取1 h，減壓蒸干溶劑，用二甲基亞砜（DMSO）溶解殘留物，15 000 r/min離心 10 min，取上清，定容使其終濃度為1 g/ml（每毫升含1 g生藥），熱壓滅菌后，-20℃保存?zhèn)溆?，?shí)驗(yàn)前用DMSO稀釋成相應(yīng)濃度。

試劑：RPMI 1640干粉購自Gibco公司；花生四烯酸（AA）購自 Cayman 公司；脂多糖（LPS）購自 Sigma公司；胎牛血清（FCS）購自杭州四季青公司；塞來昔布（Celecoxib），輝瑞公司惠贈(zèng)；吲哚美辛，為標(biāo)準(zhǔn)品，購自中國藥品與生物制品檢定所；PGE2和6-keto-PGF1α放免試劑盒購自解放軍總醫(yī)院東亞放免研究所；其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 COX-1和COX-2模型的建立 參照文獻(xiàn)[5]方法制備大鼠腹腔巨噬細(xì)胞COX-1和COX-2模型。大鼠腹腔注射0.4%明膠4～5 ml，4 h后，擊頭處死大鼠。用冷Hanks液灌洗腹腔，每只10 ml，收集灌洗液，灌洗 3次，1 500 r/min離心5 min，RPMI-1640洗滌2次。調(diào)整細(xì)胞數(shù)為106個(gè)/ml，接種至96孔培養(yǎng)板，每孔0.2 ml。在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 h，洗去未貼壁細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，換0.5%FCS的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，作為COX-1模型。在此基礎(chǔ)上，再以10%FCS的RPMI-1640培養(yǎng)30 min，加入阿司匹林（終濃度1 mmol/L），繼續(xù)培養(yǎng)30 min后，棄上清，PBS沖洗。再加入0.5 μg/ml LPS 的 10%FCS 的 RPMI-1640 培養(yǎng)液 200 μl，繼續(xù)培養(yǎng)6 h后，作為COX-2模型。

1.2.2對(duì)COX-1的影響 在COX-1模型的細(xì)胞培養(yǎng)液中加入獨(dú)活，使其終濃度分別為 0.1、1、10 g/L；或塞來昔布（COX-2選擇性抑制劑陽性對(duì)照，終濃度1×10-6mol/L）、吲哚美辛（COX-1及COX-2抑制劑陽性對(duì)照，終濃度1×10-7mol/L）； 或陰性對(duì)照溶媒 DMSO，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng) 30 min，加入底物 AA，使其終濃度為 10 μmol/L，繼續(xù)培養(yǎng) 20 min。取上清按試劑盒要求測(cè)125I-6-Keto-PGF1α的放射活性。以PGF1α生成減少的百分率來反映藥物對(duì)COX-1活性的抑制作用。抑制率（%）=（對(duì)照組PG濃度-給藥組PG濃度）/對(duì)照組PG濃度×100%

1.2.3 對(duì)COX-2的影響 在COX-2模型的細(xì)胞培養(yǎng)液中加入獨(dú)活、塞來昔布、吲哚美辛或陰性對(duì)照溶媒，所用藥物的濃度與COX-1相同。37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)30 min，加入底物AA，使其終濃度為10 μmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)20 min。取上清按試劑盒要求測(cè)PGE2的放射活性。以PGE2生成減少的百分率來反映藥物對(duì)COX-2活性的抑制作用。抑制率的計(jì)算公式同上述COX-1。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，所有結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

塞萊昔布僅對(duì)COX-2有抑制作用，對(duì)COX-1的抑制作用與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而吲哚美辛對(duì)COX-1和COX-2都有抑制作用。獨(dú)活則對(duì)COX-1和COX-2都有不同程度的抑制作用，并且可以發(fā)現(xiàn)抑制率隨劑量的增加而增大，存在一定的量效關(guān)系。另外，在劑量相同時(shí)，獨(dú)活對(duì)COX-2的抑制率大于COX-1。見表1。

3 討論

前列腺素（PGs）是一種與炎癥緊密相關(guān)的重要介質(zhì)，COX為PGs生物合成的重要限速酶，隨著COX-2的發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)在普遍認(rèn)為COX-1為結(jié)構(gòu)型，它產(chǎn)生的PG參與機(jī)體正常生理過程和保護(hù)功能，而COX-2則是為誘導(dǎo)型，是經(jīng)刺激迅速產(chǎn)生的誘導(dǎo)酶，參與炎癥反應(yīng)，抑制COX-2可以發(fā)揮抗炎作用[6]。本研究采用的是基于大鼠腹腔巨噬細(xì)胞的COX-1/-2抑制劑篩選模型[5,7]。在該模型中，低血清（0.5%FCS）的RPMI-1640培養(yǎng)時(shí)，COX-2不被誘導(dǎo)，只有COX-1起作用，這時(shí)加入底物AA，測(cè)定培養(yǎng)基中125I-6-Keto-PGF1α的濃度，可用于COX-1活力的測(cè)定。巨噬細(xì)胞受LPS誘導(dǎo)后，開始表達(dá)COX-2，而COX-1活性很低，利用阿司匹林乙?；疌OX-1，使COX-1失去活性，這時(shí)加入底物AA，測(cè)定培養(yǎng)基中PGE2的濃度，可用于COX-2活力的測(cè)定。獨(dú)活的主要功能是祛風(fēng)除濕，通痹止痛，在臨床上主要入復(fù)方治療骨性關(guān)節(jié)炎[8]和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[9]。本實(shí)驗(yàn)表明，獨(dú)活在3個(gè)不同劑量都對(duì)COX-2有抑制作用，并隨劑量的增加而作用有增強(qiáng)的趨勢(shì)，推測(cè)抑制環(huán)氧化酶可能是其祛風(fēng)濕的作用機(jī)制之一。

表1 獨(dú)活對(duì)COX-1和COX-2的影響(±s，n=3)

注：與 DMSO 比較：*P＜0.05，**P＜0.01

藥物 劑量 PGF1α(μg/L) 抑制率(%)PGE2(μg/L) 抑制率(%)DMSO塞來昔布吲哚美辛獨(dú)活--10-6mol/L 10-7mol/L 0.1 g/L 1 g/L 10 g/L 3.89±0.74 3.53±0.81 1.65±0.34**2.78±0.65 2.24±0.42*1.91±0.46*-95 8 29 42 51 82.32±8.84 46.43±5.75**36.26±5.42**53.38±8.51*38.02±7.73**26.69±8.36**44 56 35 54 68

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