陸月，劉丹，張孝任，劉雪榮，沈煒，鄭剛，柳云帆，董小巖,，吳小兵，高基民

1 溫州醫(yī)學(xué)院 浙江省模式生物技術(shù)與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，溫州 325035

2 中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所 病毒基因工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100052

3 北京五加和分子醫(yī)學(xué)研究有限公司，北京 100176

哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)具有指導(dǎo)蛋白質(zhì)的正確折疊、提供復(fù)雜的N型糖基化和準(zhǔn)確的O型糖基化等多種翻譯后加工功能。因此，對(duì)于用基因工程方法獲得結(jié)構(gòu)復(fù)雜的高等生物蛋白質(zhì)具有優(yōu)勢(shì)。哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)不僅已成為多種基因工程藥物的生產(chǎn)平臺(tái)，在新基因的發(fā)現(xiàn)、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能研究中亦起了極為重要的作用。CHO/dhfr缺陷型細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)是最為常用的哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)，用該系統(tǒng)成功地獲得了多種重組蛋白的高效表達(dá)[1-3]。然而，這種表達(dá)系統(tǒng)需要漫長(zhǎng)的篩選加壓過(guò)程才能得到高產(chǎn)量的穩(wěn)定細(xì)胞株，故不適合于短時(shí)間內(nèi)獲得較大量重組蛋白。

瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)因?qū)嶒?yàn)周期短，操作簡(jiǎn)便而受到青睞。常用的瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)有 COS-7細(xì)胞系統(tǒng)[4]、桿狀病毒載體表達(dá)系統(tǒng)[5]、腺病毒載體/HEK293細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)[6]等。

本實(shí)驗(yàn)利用重組腺病毒能高效感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞及高效表達(dá)外源基因的特點(diǎn)，擬建立一種不需要轉(zhuǎn)染和加壓篩選的腺病毒載體/BHK21細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，并用于快速制備重組可溶性腫瘤壞死因子受體與脂聯(lián)素球部融合蛋白 (sTNFRII-gAD)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、細(xì)胞及試劑

pBHGlox(delta)E1,3Cre骨架質(zhì)粒、pDC316原始質(zhì)粒、BHK21c022細(xì)胞、無(wú)血清培養(yǎng)基和磷酸鈣共沉淀轉(zhuǎn)染試劑盒由北京五加和分子醫(yī)學(xué)研究所提供；L929細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)ATCC，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)；蛋白Marker購(gòu)自Invitrogen公司；放線菌素 D購(gòu)自 Fluka；鼠抗人脂聯(lián)素單抗由譚淑萍老師提供；鼠抗人 TNFRII單抗購(gòu)自abcam公司；馬抗小鼠 IgG/磷酸酶標(biāo)記抗體購(gòu)自中杉金橋公司；BCIP/NBT購(gòu)自 Calbiochem公司；重組人TNFα標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；Superdex 200 prep grade (16/60) 購(gòu)自 GE Healthcare。

1.2 融合基因的構(gòu)建及重組腺病毒的產(chǎn)生

以融合蛋白基因 pAAV2neo-sTNFRII-gAD為模板設(shè)計(jì)引物。上游引物為5′-CGCGGATCC ATGGCG CCCGTCGCC-3′，下游引物為5′-ACGCGTCGACTC AGTTGGTGTCATG-3′，下劃線處表示酶切位點(diǎn)，上游引物的酶切位點(diǎn)為 BamHⅠ，下游引物的酶切位點(diǎn)為SalⅠ。引物合成由Invitrogen公司完成。PCR擴(kuò)增條件為：94 ℃ 5 min ；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，25個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，回收試劑盒回收目的片段，將片段用BamHⅠ、SalⅠ進(jìn)行雙酶切。再用BglⅡ和 SalⅠ雙酶切載體 pDC316。BamHⅠ和 BglⅡ是同尾酶，用T4 DNA連接酶將上述目的基因片段和pDC316片段連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，得到重組穿梭質(zhì)粒pDC316-sTNFRII-gAD。

將 pDC316-sTNFRII-gAD和腺病毒基因組質(zhì)粒pBHGlox(delta)E1,3Cre共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，用磷酸鈣共沉淀法進(jìn)行轉(zhuǎn)染。在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中接種HEK293細(xì)胞，5×105個(gè)細(xì)胞/孔，培養(yǎng)過(guò)夜；轉(zhuǎn)染前4~6 h換新鮮培養(yǎng)基 (含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基)；取4 μg的DNA與水混合成總體積為67.5 μL的液體加入到EP管中。然后加入2.5 mol/L CaCl27.5 μL，混勻后4 ℃孵育20 min；向EP管中貼壁加入2×HBS (4 ℃保存) 75 μL，輕柔地混勻后室溫靜置5 min。最后將150 μL液體加入6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，輕輕混勻。鏡下觀察可以看到十分細(xì)小而均勻的顆粒；37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。9 d后見(jiàn)到病毒噬斑，收集病變細(xì)胞和上清作為Ad5-sTNFRII-gAD毒種。

1.3 重組腺病毒的制備與純化

將獲得的Ad5-sTNFRII-gAD毒種委托北京五加和分子醫(yī)學(xué)研究所進(jìn)行擴(kuò)增和純化，得到滴度為1×1015vg/L的純化病毒。用TCID50方法[7]測(cè)定腺病毒的感染性滴度。

1.4 Ad5-EGFP對(duì)BHK21c022細(xì)胞的感染

在 24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中接種 BHK21c022細(xì)胞(含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基)，1×105個(gè)細(xì)胞/孔，同時(shí)按梯度加入重組腺病毒Ad5-EGFP (MOI分別為0、1、10、100、1 000)，共5個(gè)孔。12 h后換成無(wú)血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，熒光顯微鏡下觀察，在相同的曝光時(shí)間 (1/3 s) 觀察各孔中細(xì)胞的熒光強(qiáng)弱以及細(xì)胞的形態(tài)變化。

1.5 Western blotting檢測(cè)

用MOI分別為0、1、10、100、1 000的重組腺病毒Ad5-sTNFRII-gAD感染BHK21c022細(xì)胞，12 h后換成無(wú)血清培養(yǎng)基。48 h后收取細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)上清。將上清和無(wú)水乙醇按 1∶3的比例混合到一起，?70 ℃放置0.5 h。13 000 r/min 離心5 min，倒掉上清，用少量 (一般為收取上清體積的 1/10) PBS溶液溶解沉淀，用于做 SDS-PAGE及 Western blotting實(shí)驗(yàn)。

取10 μL濃縮10倍的上清，加入10 μL 2×上樣緩沖液，100 ℃沸水煮5 min，20 μL樣品上樣，12%分離膠進(jìn)行SDS-PAGE分離，然后用濕膠轉(zhuǎn)移儀將蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜。取出NC膜，用封閉液(5%脫脂牛奶，PBS配制) 37 ℃封閉NC膜1 h。棄去封閉液，加入1∶300 (用封閉液稀釋) 的鼠抗人脂聯(lián)素單抗或 1∶500 (用封閉液稀釋) 的鼠抗人TNFRII的單抗，37 ℃孵育1 h。PBS洗滌NC膜3次后，加入 1∶1 000 (用封閉液稀釋) 的馬抗小鼠IgG/磷酸酶標(biāo)記抗體37 ℃孵育1 h。PBS洗滌NC膜3次后，加入BCIP/NBT，避光顯色。約15~30 min后棄去顯色液，用超純水洗滌 NC膜中止反應(yīng)，觀察結(jié)果。

1.6 蛋白點(diǎn)雜交方法檢測(cè)sTNFRII-gAD蛋白

用MOI為100的重組腺病毒Ad5-sTNFRII-gAD感染BHK21c022細(xì)胞12 h后，換成無(wú)血清培養(yǎng)基，然后每隔48 h換液，多次收集培養(yǎng)液上清，進(jìn)行蛋白質(zhì)點(diǎn)雜交實(shí)驗(yàn)。

將每次收集的細(xì)胞培養(yǎng)上清各取5 μL，分別點(diǎn)到NC膜上，用封閉液 (5%脫脂牛奶，PBS配制) 37 ℃封閉NC膜1 h。棄封閉液，加入1∶300 (用封閉液稀釋) 的鼠抗人脂聯(lián)素單抗，37 ℃孵育 1 h。PBS洗滌NC膜3次后，加入1∶1 000 (用封閉液稀釋) 的馬抗小鼠IgG/磷酸酶標(biāo)記抗體37 ℃孵育1 h。PBS洗滌NC膜3次后，加入BCIP/NBT，避光顯色。約15~30 min后棄去顯色液，用超純水洗滌NC膜中止反應(yīng)，觀察結(jié)果。

1.7 sTNFRII-gAD蛋白的濃縮和純化

用MOI為100的rAd5-sTNFRII-gAD感染5個(gè)轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)的 BHK21c022細(xì)胞來(lái)大量制備sTNFRII-gAD融合蛋白。每個(gè)轉(zhuǎn)瓶加無(wú)血清培養(yǎng)液100 mL，每48 h收獲上清一次并換液，反復(fù)6次收取培養(yǎng)上清。共得到約3 L含有融合蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)上清。向上清中緩慢均勻的加入硫酸銨粉末(40%，W/V)。用磁力攪拌器在4 ℃冷庫(kù)中攪拌24 h。13 000× g，1 h離心后棄去上清。用少量的PBS溶解沉淀 (3~5 mL)。然后將溶液進(jìn)行透析，除去多余的硫酸銨，得到重組融合蛋白的粗純品。依據(jù)Hiload 16/60 Superdex 200 prep grade的說(shuō)明書(shū)對(duì)得到的粗純品進(jìn)行凝膠過(guò)濾層析。將層析后各個(gè)收集峰進(jìn)行免疫印跡分析，收集含有目標(biāo)融合蛋白的峰合并獲到融合蛋白純品。

1.8 sTNFRII-gAD融合蛋白的活性測(cè)定

96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中鋪入 L929細(xì)胞，1.5×104~1.8×104個(gè)細(xì)胞/孔，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜。第2天，將sTNFRII-gAD融合蛋白純品，用含放線菌素D 20 mg/L，TNFα 20 U/mL的DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行4倍比梯度稀釋，共稀釋10個(gè)梯度；棄去96孔板中L929細(xì)胞的上清，加入前面已經(jīng)倍比稀釋好的sTNFRII-gAD融合蛋白樣品，每孔100 μL，每個(gè)梯度做3個(gè)復(fù)孔；同時(shí)加入放線菌素D 20 mg/L與TNFα 20 U/mL的DMEM培養(yǎng)液(兩者結(jié)合殺傷性最大) 作為陰性對(duì)照。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，每孔加入MTT溶液 (5 g/L) 20 μL，再培養(yǎng)4 h后，將96孔中的120 μL液體吸出，換入100 μL DMSO終止培養(yǎng)。檢測(cè)各孔的OD570值[8-9]。

2 結(jié)果

2.1 腺病毒Ad5-EGFP感染BHK21 c022細(xì)胞

分別用 MOI為 0、1、10、100、1 000的Ad5-EGFP感染BHK21 c022細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察。如圖1所示，隨著MOI的增大，熒光細(xì)胞數(shù)量和亮度逐漸增強(qiáng)，表明腺病毒載體能夠有效轉(zhuǎn)染BHK21 c022細(xì)胞，并且表達(dá)量與病毒用量呈正相關(guān)。但在MOI達(dá)到1 000時(shí)，出現(xiàn)細(xì)胞變長(zhǎng)、少數(shù)細(xì)胞死亡的現(xiàn)象。

2.2 重組載體質(zhì)粒pDC316-sTNFRII-gAD的鑒定及重組腺病毒的獲得

用 XbaⅠ和 HindⅢ雙酶切 pDC316-sTNFRII-gAD應(yīng)得到大小為3 777 bp和1 327 bp的基因片段，SalⅠ和 EcoRⅠ雙酶切應(yīng)得到3 883 bp和1 221 bp的基因片段；圖 2顯示酶切結(jié)果與預(yù)期相符，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖1 不同MOI的rAd5-EGFP對(duì)BHK21 c022細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率Fig. 1 Transduction efficiency of Ad5-EGFP virus at different MOI for BHK21 c022 cells.

圖2 pDC316-sTNFRII-gAD質(zhì)粒的酶切鑒定Fig. 2 Restriction digestion analysis of pDC316-sTNFRII-gAD plasmid. 1: DNA marker; 2: pDC316-sTNFRII-gAD digested with Sal I and EcoR I; 3: pDC316-sTNFRII-gAD digested with Xba I and Hind III; 4: pDC316-sTNFRII-gAD.

將重組穿梭質(zhì)粒 pDC316-sTNFRII-gAD與腺病毒基因組質(zhì)粒 pBHGlox(delta)E1,3Cre共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，9 d后見(jiàn)到病毒噬斑，如圖3所示。收集病變細(xì)胞和上清作為Ad5-sTNFRII-gAD毒種。大量制備和純化獲得 Ad5-sTNFRII-gAD制品。TCID50方法測(cè)定純化的Ad-sTNFRII-gAD病毒的感染性滴度為1.58×1013IU/L。

2.3 不同MOI的Ad5-sTNFRII-gAD的表達(dá)效率

將無(wú)血清培養(yǎng)48 h后的細(xì)胞培養(yǎng)上清濃縮后進(jìn)行Western blotting檢測(cè)，結(jié)果如圖4所示。用脂聯(lián)素單抗 (圖4A) 和腫瘤壞死因子單抗 (圖4B) 檢測(cè)都出現(xiàn)了一致的特異性條帶，分別為sTNFRII-gAD融合蛋白的單體、三聚體和多聚體形式，其表達(dá)效率隨著重組腺病毒MOI的提高而增加。

圖 3 共轉(zhuǎn)染 pBHGlox(delta)E1,3Cre和 pDC316-sTNFRII-gAD后產(chǎn)生重組腺病毒Ad5-sTNFRII-gADFig. 3 Plaques of recombinant virus Ad5-sTNFRII-gAD generated by co-transfection of pDC316-sTNFRII-gAD and pBHGlox(delta)E1,3Cre.

2.4 sTNFRII-gAD融合蛋白的持續(xù)表達(dá)

Ad5-sTNFRII-gAD感染無(wú)血清培養(yǎng)的 BHK21 c022細(xì)胞后，48 h收集細(xì)胞上清，連續(xù)收集6次，用蛋白點(diǎn)雜交方法檢測(cè)其中sTNFRII-gAD的表達(dá)。用已知濃度的 sTNFRII-Fc融合蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)品，分別稀釋成100、50、10、5、1 mg/L，膜上各加樣5 μL。結(jié)果如圖 5所示，可見(jiàn)經(jīng)重組腺病毒感染過(guò)的BHK21 c022細(xì)胞在2~10 d內(nèi)都持續(xù)分泌較高濃度的融合蛋白。

圖4 sTNFRII-gAD融合蛋白的免疫印跡分析Fig. 4 Western blotting analysis of sTNFRII-gAD fusion protein. (A) Western blotting of non-reduced sTNFRII-gAD fusion protein with monoclonal antibody against adiponectin. (B) Western blotting of non-reduced sTNFRII-gAD fusion protein with monoclonal antibody against TNFRII. Lane 1: Protein molecular weight standards; Lanes 2 to 6: Western blotting of non-reduced sTNFRII-gAD fusion protein at 1 000 MOI, 100 MOI 10 MOI, 1 MOI and 0 MOI of Ad5-sTNFRII-gAD.

圖5 蛋白點(diǎn)雜交分析驗(yàn)證融合蛋白的持續(xù)表達(dá)Fig. 5 Confirmation of continuous expression of the fusion protein sTNFRII-gAD by protein dot blotting with monoclonal antibody against TNFRII. (A) Lanes 1 to 5: positive controls at 5 μL of 100 μg/L, 50 μg/L, 10 μg/L, 5 μg/L and 1 μg/L; (B) Lanes 1 to 5: detection of sTNFRII-gAD fusion protein in the supernatants of BHK-21S cells after the culture of 48 h, 96 h, 144 h, 192 h and 240 h.

2.5 sTNFRII-gAD的分子篩層析純化及生物學(xué)活性鑒定

分子篩純化重組融合蛋白時(shí)，出現(xiàn) 2個(gè)比較明顯的峰，如圖6所示。第1個(gè)峰為外水峰 (峰1)，是分子量相對(duì)較大的高聚體峰。而第 2個(gè)峰主要為融合蛋白的三聚體峰 (峰 2)，收集該峰，并測(cè)定其對(duì)TNFα殺傷L929細(xì)胞的中和活性。結(jié)果顯示，通過(guò)腺病毒表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)出來(lái)的融合蛋白sTNFRII-gAD具有中和TNFα的活性 (圖7)，且其抑制TNFα殺傷L929細(xì)胞的活性呈劑量依賴性。

圖6 sTNFRII-gAD融合蛋白的分子篩層析Fig. 6 Map of size exclusion chromatography of sTNFRII-gAD fusion protein. Peak1: multimers of sTNFRII-gAD in external solution; Peak2: trimer of sTNFRII-gAD.

3 討論

目前利用哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)高生物學(xué)活性的蛋白是獲得重組蛋白最為廣泛的方式。其中應(yīng)用最普遍的是 CHO/dhfr?表達(dá)系統(tǒng)[10-11]。CHO細(xì)胞很少分泌內(nèi)源蛋白，利于外源蛋白的表達(dá)和分離純化，而且表達(dá)的外源蛋白保持天然的空間結(jié)構(gòu)和生物學(xué)活性。所以 CHO表達(dá)系統(tǒng)常用于長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)重組蛋白。但是得到高效穩(wěn)定表達(dá)重組蛋白的 CHO細(xì)胞株需要漫長(zhǎng)的加壓過(guò)程，不能滿足短期快速得到蛋白純品的要求。

圖7 sTNFRII-gAD融合蛋白拮抗TNFα的活性測(cè)定Fig. 7 TNFα neutralizing activity of the purified sTNFRII-gAD fusion protein.

病毒載體因能高效感染宿主細(xì)胞及表達(dá)外源基因而被用于瞬時(shí)高效表達(dá)[12]。常用的病毒載體有桿狀病毒載體、甲病毒SFV (semliki森林病毒) 載體、腺病毒載體等。其中腺病毒表達(dá)載體系統(tǒng)因安全性好、高效感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞、高效表達(dá)外源基因等優(yōu)點(diǎn)而在重組蛋白制備方面得到應(yīng)用。尤其是該表達(dá)系統(tǒng)對(duì)重組蛋白的糖基化、磷酸化等翻譯后加工等過(guò)程與人體天然過(guò)程相似，因此表達(dá)的蛋白具有高生物活性[13-14]。

sTNFRII-gAD融合蛋白是一種雙功能蛋白質(zhì)分子，sTNFRII可以與TNFα結(jié)合，減輕炎癥的發(fā)生，達(dá)到治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病的目的。已經(jīng)上市的 TNFα拮抗藥物 sTNFRII-Fc是二聚體形式的sTNFRII。但 TNFα天然狀態(tài)下是三聚體形式，重組蛋白sTNFRII-gAD是利用了脂聯(lián)素球部自動(dòng)形成三聚體的特性而設(shè)計(jì)的，預(yù)計(jì)獲得的三聚體化sTNFRII-gAD融合蛋白拮抗TNFα的活性將比二聚體化 sTNFRII-Fc更高。本研究嘗試用重組腺病毒載體/BHK21細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)來(lái)制備三聚體化的sTNFRII-gAD融合蛋白。

制備腺病毒載體最常見(jiàn)的生產(chǎn)細(xì)胞是 HEK293細(xì)胞[15]，它能夠反式提供E1基因功能，使E1基因缺失的重組腺病毒能夠高效復(fù)制和產(chǎn)生子代病毒，在這個(gè)過(guò)程中外源基因也得到高效表達(dá)。故目前也常用腺病毒載體/HEK293細(xì)胞來(lái)生產(chǎn)重組蛋白[16]。然而，利用重組腺病毒感染HEK293細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生明顯的細(xì)胞病變，只能一次性收獲產(chǎn)物，而不能較持續(xù)地表達(dá)外源蛋白及反復(fù)多次收獲細(xì)胞上清來(lái)制備目標(biāo)蛋白。另外利用HEK293細(xì)胞生產(chǎn)重組蛋白的同時(shí)，會(huì)產(chǎn)生子代病毒，具有感染性，并且病毒自身的蛋白會(huì)影響重組蛋白的純化。

本研究采用了 BHK21細(xì)胞作為重組蛋白的生產(chǎn)細(xì)胞。BHK21c022細(xì)胞是一種從BHK21細(xì)胞中單克隆化挑選并且無(wú)血清馴化的懸浮適應(yīng)細(xì)胞株，生長(zhǎng)迅速，適應(yīng)性強(qiáng)，既可以在含有血清的培養(yǎng)液中貼壁生長(zhǎng)，又可以在無(wú)血清的培養(yǎng)液中懸浮生長(zhǎng)。為了觀察腺病毒載體對(duì)于 BHK21c022細(xì)胞的轉(zhuǎn)染和表達(dá)效率以及細(xì)胞毒性，我們用不同量的rAd5-EGFP病毒感染BHK21c022細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：雖然該細(xì)胞是小鼠來(lái)源的細(xì)胞，但對(duì)rAd5-EGFP病毒感染仍然十分敏感，并且感染和表達(dá)效率隨著病毒MOI的增加而明顯增加。細(xì)胞毒性只有在很高的用量 (MOI=1 000) 時(shí)才明顯 (圖1)。這為我們建立腺病毒載體/BHK21細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)以及選擇病毒的用量提供了依據(jù)。

同理，我們構(gòu)建并重組獲得了 rAd5-sTNFRII-gAD病毒。用該重組病毒感染BHK2c022細(xì)胞，在上清中成功檢測(cè)到了 sTNFRII-gAD融合蛋白的表達(dá)，并且發(fā)現(xiàn)：rAd5-sTNFRII-gAD病毒用量的增加，上清中的 sTNFRII-gAD表達(dá)量也呈明顯增加趨勢(shì)(圖4)；利用轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)，在換成無(wú)血清培養(yǎng)基后連續(xù)培養(yǎng)了 12 d，反復(fù) 6次收集上清；且 6次上清中sTNFRII-gAD蛋白表達(dá)量相對(duì)穩(wěn)定 (圖5)，這說(shuō)明腺病毒載體表達(dá)系統(tǒng)可以短期穩(wěn)定表達(dá)重組蛋白。另外。用復(fù)制缺陷型腺病毒載體感染BHK21c022細(xì)胞，再用LK021培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，由于LK021是無(wú)血清、無(wú)蛋白和多肽的化學(xué)成分限定的培養(yǎng)液，收獲的培養(yǎng)上清中雜蛋白很少，對(duì)純化非常有利。因此，BHK21c022細(xì)胞是用腺病毒載體表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)重組蛋白的理想細(xì)胞株。

總而言之，本實(shí)驗(yàn)建立了一種用腺病毒載體/ BHK21細(xì)胞系統(tǒng)表達(dá)和制備重組 sTNFRII-gAD融合蛋白的方法，從而為快速高效獲得較大量 (毫克級(jí))、結(jié)構(gòu)復(fù)雜并具有生物學(xué)活性的重組蛋白提供了有力工具。

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