殷東林，祝建波，王愛(ài)英，向本春

石河子大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石河子 832000

蔗糖是植物光合作用同化產(chǎn)物最主要的轉(zhuǎn)運(yùn)形式，其轉(zhuǎn)運(yùn)的方向和速率對(duì)于高等植物的生長(zhǎng)發(fā)育至關(guān)重要[1]。蔗糖由源向庫(kù)的運(yùn)輸是通過(guò)韌皮部進(jìn)行的。光合同化物進(jìn)出韌皮部篩管分子是通過(guò)兩種不同模式轉(zhuǎn)運(yùn)的，即共質(zhì)體途徑和質(zhì)外體途徑[2]。其中蔗糖運(yùn)輸?shù)馁|(zhì)外體途徑在許多農(nóng)作物中占有重要的地位。在質(zhì)外體途徑中，蔗糖主動(dòng)越膜裝載入韌皮部進(jìn)行運(yùn)輸，然后在庫(kù)端越膜卸載進(jìn)入庫(kù)器官細(xì)胞。蔗糖的跨膜運(yùn)輸及其在植物中的分配需要依賴(lài)于膜上的蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 (Sucrose/H+cotransporters或sucrose transporters，SUCs或SUTs)，因此蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中起著極為重要的作用[3-4]。

在高等植物中，自1992年Riesmeier等[5]從菠菜Spinacia oleracea L.中克隆得到第一個(gè)蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白以來(lái)，許多蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相繼從不同植物以及不同器官克隆得到[6]。Davies等[7]于1999年從葡萄V. vinifera果實(shí)中克隆得到了3個(gè)預(yù)測(cè)為葡萄蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因 (VvSUC11、VvSUC12、VvSUC27)，其中2個(gè) (VvSUC11、VvSUC12) 在酵母中得到了功能驗(yàn)證[8]。VvSUC11和VvSUC12在葡萄果實(shí)中具有相似的表達(dá)模式，在果實(shí)成熟的過(guò)程中表達(dá)量增高，二者的主要功能被認(rèn)為是負(fù)責(zé)蔗糖從質(zhì)外體(Apoplast) 向薄壁細(xì)胞 (Parenchyma cell) 裝載[8]；而VvSUC27的表達(dá)與前兩者有顯著不同，在果實(shí)成熟過(guò)程中表達(dá)量降低[7]。VvSUC12和VvSUC27在葡萄胚性和非胚性愈傷組織中的表達(dá)也有差異[9]。最近VvSUC27的功能也在酵母中得到了驗(yàn)證[10]。

雖然這 3種蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能在酵母中得到了驗(yàn)證，并且發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因酵母提高了積累蔗糖的能力、糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在酵母中的表達(dá)有助于蔗糖的跨膜運(yùn)輸及糖轉(zhuǎn)運(yùn)功能的促進(jìn)與溫度和 pH有很大的關(guān)系[8,10]，但這3種蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在植物中的功能驗(yàn)證方面卻鮮有報(bào)道。

蔗糖通過(guò)韌皮部從源到庫(kù)的運(yùn)輸被廣泛報(bào)道[1,3]。蔗糖從源組織運(yùn)輸和裝載到韌皮部中的過(guò)程已經(jīng)研究很詳細(xì)了，而蔗糖從韌皮部卸載到諸如根、種子和塊莖等庫(kù)組織的過(guò)程研究的不夠深入。對(duì)蔗糖進(jìn)入果實(shí)即一些植物主要庫(kù)器官的機(jī)制了解還很少。

基于上述原因，本研究根據(jù)蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在糖分積累中的作用，從調(diào)控源、庫(kù)關(guān)系的角度出發(fā)，利用分子生物學(xué)手段，構(gòu)建含有甘薯的甘薯貯藏蛋白基因根部特異性啟動(dòng)子的植物表達(dá)載體pCAMBIA2301-SP1-VvSUC11-SP2-VvSUC12，把蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因VvSUC11和VvSUC12轉(zhuǎn)化到甜菜中驗(yàn)證其在植物中的功能和探索蔗糖在甜菜塊根中可能的運(yùn)輸機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒和菌種

原核表達(dá)載體pGM-T-SP1、pGM-T-VvSUC11、pGM-T-VvSUC12，以及植物表達(dá)載體 pBI121-SP2-GUS均由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存，植物表達(dá)載體pCAMBIA2301，以及大腸桿菌 Escherichia coli DH5α、根癌農(nóng)桿菌Agrobacterium tumefaciens菌株GV3101均為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 生化試劑

Taq DNA聚合酶、限制性?xún)?nèi)切酶XbaⅠ、SacⅠ、HindⅢ、EcoRⅠ、DraⅢ、T4 DNA連接酶、反轉(zhuǎn)錄試劑盒RNA PCR Kit (AMV) 均購(gòu)于上海生物工程公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒購(gòu)自 Promega公司(美國(guó))；總RNA提取試劑盒、DNA marker購(gòu)自北京Tiangen公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純?cè)噭?/p>

1.1.3 植物材料

甜菜B. vulgaris KWS-9103品種的種子由石河子甜菜研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 雙價(jià)植物表達(dá)載體 pCAMBIA2301-SP1-VvSUC11-SP2-VvSUC12的構(gòu)建

本實(shí)驗(yàn)室已從葡萄中克隆出蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因VvSUC11和VvSUC12，從甘薯中克隆出甘薯貯藏蛋白 (Sporamin) 基因的根部特異性啟動(dòng)子[11]，本文中命名為SP1和SP2。為了構(gòu)建這個(gè)雙價(jià)載體需要構(gòu)建3個(gè)中間表達(dá)載體。

1) pCAMBIA2301-SP1載體的構(gòu)建：?jiǎn)?dòng)子SP1左右兩端的酶切位點(diǎn)分別為Hind Ⅲ和Dra Ⅲ(表 1)。用 HindⅢ/DraⅢ在 37 ℃下分別雙酶切pCAMBIA2301和pGM-T-SP1載體，回收大片段和小片段，大、小片段在 T4 DNA連接酶作用下16 ℃連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑單克隆，用SP1的引物 (表1) 進(jìn)行菌液PCR鑒定。對(duì)陽(yáng)性菌液提取質(zhì)粒用HindⅢ/DraⅢ雙酶切鑒定正確后命名為pCAMBIA2301-SP1。同時(shí)陽(yáng)性克隆的菌種和質(zhì)粒于?70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2) pCAMBIA2301-SP2-GUS-SP1載體的構(gòu)建：?jiǎn)?dòng)子SP2與啟動(dòng)子SP1的區(qū)別僅在于右端酶切位點(diǎn)不同，啟動(dòng)子SP2左右兩端的酶切位點(diǎn)是HindⅢ和XbaⅠ (表1)。用HindⅢ/EcoRⅠ在37 ℃下雙酶切載體 pCAMBIA2301-SP1多克隆位點(diǎn)，回收大片段，同時(shí)用 HindⅢ/EcoRⅠ雙酶切載體 pBI121-SP2-GUS，回收小片段得到表達(dá)框SP2-GUS-NOS，將表達(dá)框插入到載體 pCAMBIA2301-SP1多克隆位點(diǎn)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5α，挑單克隆，用 GUS的引物 (表1) 進(jìn)行菌液PCR鑒定。對(duì)陽(yáng)性菌液提取質(zhì)粒用 HindⅢ/EcoRⅠ雙酶切鑒定正確后命名為pCAMBIA2301-SP2-GUS-SP1。同時(shí)陽(yáng)性克隆的菌種和質(zhì)粒于?70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3) pCAMBIA2301-SP2-VvSUC12-SP1載體的構(gòu)建：基因GUS和VvSUC12左右兩端的酶切位點(diǎn)都是XbaⅠ和SacⅠ (表1)。用XbaⅠ/SacⅠ雙酶切上面的載體pCAMBIA2301-SP2-GUS -SP1，回收大片段。Xba I/Sac I雙酶切pGM-T-VvSUC12載體，回收小片段。小片段與大片段在T4 DNA連接酶的作用下連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化DH5α，挑單克隆，用基因VvSUC12的引物 (表 1) 菌液 PCR鑒定。對(duì)陽(yáng)性菌液提取質(zhì)粒用 XbaⅠ/SacⅠ雙酶切鑒定正確后命名為pCAMBIA2301-SP2-VvSUC12-SP1。陽(yáng)性克隆的菌種和質(zhì)粒于?70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 研究中使用的引物序列Table 1 Sequences of oligonucleotide primers used in this study

4) pCAMBIA2301-SP1-VvSUC11-SP2-VvSUC12載體的構(gòu)建：基因VvSUC11左右兩端的酶切位點(diǎn)都是Dra Ⅲ，但兩端的序列并不完全相同，右端酶切位點(diǎn)的序列與啟動(dòng)子 SP1右端酶切位點(diǎn)的序列相同，左端的與它們不同 (表 1)，這樣不會(huì)出現(xiàn)反向連接。用 Dra Ⅲ單酶切 pCAMBIA2301-SP2-VvSUC12-SP1載體，回收大片段，然后去磷酸化，同時(shí)用Dra Ⅲ單酶切pGM-T-VvSUC11載體，回收小片段與大片段在T4 DNA連接酶作用下16 ℃連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5α，挑單克隆，用基因VvSUC11引物 (表1) 菌液PCR鑒定。對(duì)陽(yáng)性菌液提取質(zhì)粒用 Dra Ⅲ單酶切鑒定正確后命名為pCAMBIA2301- SP1-VvSUC11-SP2-VvSUC12。同樣，陽(yáng)性克隆的菌種和質(zhì)粒于?70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 雙價(jià)植物表達(dá)載體用凍融法轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌GV3101

農(nóng)桿菌 GV3101感受態(tài)的制備及轉(zhuǎn)化，參考本實(shí)驗(yàn)室的方法[11]，并使用基因VvSUC11的引物 (表1) 進(jìn)行菌液PCR檢測(cè)。

1.2.3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化甜菜

1) 外植體的制備：將甜菜KWS-9103品種的種子用自來(lái)水浸泡1 h，在超凈工作臺(tái)中轉(zhuǎn)移到滅過(guò)菌的三角瓶中，先用10%的H2O2處理3 min，然后用0.1%的升汞處理8 min，再用無(wú)菌水漂洗5~6次。將消過(guò)毒的種子接種于含瓊脂 0.7%、蔗糖 3%的1/2 MS (pH 5.8) 基本培養(yǎng)基上，在24 ℃±2 ℃下暗培養(yǎng)，使種子萌發(fā)。取發(fā)芽10 d左右的小苗，剪掉根部，轉(zhuǎn)移至預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基 (Pre-culture medium) (表2) 中進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)50~60 d后剪甜菜的葉柄1 cm左右做外植體。甜菜的葉柄在預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基 (表 2)中再預(yù)培養(yǎng)2、4、6 d。

2) 農(nóng)桿菌的培養(yǎng)：取保存的含有目的基因的菌種GV3101在含有50 mg/L卡那霉素 (Kan)、40 mg/L利福平 (Rif) 和50 mg/L慶大霉素的LB固體培養(yǎng)基上劃線，28 ℃培養(yǎng)2 d。從平板上挑取單菌落接入10 mL含有50 mg/L Kan、40 mg/L Rif和50 mg/L慶大霉素的LB液體培養(yǎng)基中，28 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。吸取2 mL農(nóng)桿菌菌液，轉(zhuǎn)入100 mL含有50 mg/L Kan、40 mg/L Rif和50 mg/L慶大霉素的LB液體培養(yǎng)基中，28 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)4~5 h，直到菌液濃度OD600為0.6~0.7，將菌液4 ℃、4 000 r/min離心8 min，收集菌體，并將菌體重懸于已加入0、0.005%、0.01%的表面活性劑Silwet L-77的重懸培養(yǎng)基 (Suspension medium) (表2) 中，使重懸培養(yǎng)基 (表2) 的OD600為0.3、0.5、0.7、0.9。

3) 甜菜轉(zhuǎn)化：將預(yù)培養(yǎng)的葉柄浸泡到農(nóng)桿菌的重懸培養(yǎng)基 (表2) 中，搖蕩10 min后棄掉菌液；用無(wú)菌濾紙吸干表面菌液后，將葉柄接種于鋪有濾紙的共培養(yǎng)培養(yǎng)基 (Co-cultivation medium) (表2)中，暗培養(yǎng)3 d。

4) 延遲篩選、選擇培養(yǎng)及植株再生：將共培養(yǎng)后的葉柄轉(zhuǎn)接到延遲篩選培養(yǎng)基 (Delay-screening medium) (表2) 中，培養(yǎng)0 d、2 d、4 d、6 d。然后，轉(zhuǎn)接到選擇培養(yǎng)基 (Selection medium) (表2) 中進(jìn)行選擇培養(yǎng)，每隔15 d左右更換一次培養(yǎng)基。待抗卡那霉素甜菜再生芽長(zhǎng)至2~3 cm時(shí)，切下放入生根培養(yǎng)基 (Root-induction medium) (表2) 中，誘導(dǎo)生根。

1.2.4 轉(zhuǎn)基因甜菜的PCR及RT-PCR檢測(cè)

待轉(zhuǎn)化的甜菜生根后，采用CTAB法提取甜菜葉片基因組 DNA。通過(guò)PCR擴(kuò)增來(lái)檢測(cè)目的基因是否整合到甜菜基因組中。用Trizol法提取PCR陽(yáng)性植株RNA，按照Tiangen公司的Trizol試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。首先反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA，然后以此為模板進(jìn)行PCR來(lái)檢測(cè)目的基因是否表達(dá)。

表2 甜菜轉(zhuǎn)化和再生培養(yǎng)基Table 2 Media used in transformation and regeneration of sugar beet

2 結(jié)果與分析

2.1 雙價(jià)植物表達(dá)載體 pCAMBIA2301-SP1-VvSUC11-SP2-VvSUC12的構(gòu)建和鑒定

2.1.1 pCAMBIA2301-SP1載體的構(gòu)建和鑒定

用 HindⅢ/DraⅢ雙酶切重組質(zhì)粒pCAMBIA2301-SP1，得到預(yù)期大小 (365 bp) 的片段 (圖1A)。

2.1.2 pCAMBIA2301-SP2-GUS-SP1載體的構(gòu)建和鑒定

用 HindⅢ/EcoRⅠ雙酶切重組質(zhì)粒pCAMBIA2301-SP2-GUS-SP1，得到預(yù)期大小 (約2.2 kb) 的片段 (圖1B)。

2.1.3 pCAMBIA2301-SP2-VvSUC12-SP1載體的構(gòu)建和鑒定

重組質(zhì)粒pCAMBIA2301-SP2-VvSUC12-SP1用XbaⅠ/SacⅠ雙酶切鑒定，得到1 850 bp大小的片段(圖1C)，與目標(biāo)片段一致。

2.1.4 pCAMBIA2301-SP1-VvSUC11-SP2-VvSUC12載體的構(gòu)建和鑒定

重組質(zhì)粒 pCAMBIA2301-SP1-VvSUC11-SP2-VvSUC12用Dra Ⅲ單酶切鑒定，得到1 547 bp大小的片段 (圖1D)，與目標(biāo)片段一致。

2.2 雙價(jià)植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌和 PCR鑒定

將 質(zhì) 粒 pCAMBIA2301-SP1-VvSUC11-SP2-VvSUC12轉(zhuǎn)化制備好的根癌農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞，在固體培養(yǎng)基 (LB+50 mg/L Kan+40 mg/L Rif+50 mg/L慶大霉素) 上篩選轉(zhuǎn)化子。隨機(jī)挑取不同單菌落接種于加有50 mg/L Kan、40 mg/L Rif和50 mg/L慶大霉素的LB液體培養(yǎng)基中，28 ℃，200 r/min培養(yǎng)大約48 h，使用基因VvSUC11的引物進(jìn)行菌液PCR鑒定，得到預(yù)期1 547 bp的片段(圖2)。

2.3 雙價(jià)植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化甜菜和甜菜遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立

2.3.1 外植體預(yù)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)抗性芽分化頻率的影響

圖1 雙價(jià)植物表達(dá)載體pCAMBIA2301-SP1-VvSUC11-SP2-VvSUC12的構(gòu)建和鑒定Fig. 1 Construction and identification of the bivalent plant expression vector pCAMBIA2301-SP1-VvSUC11-SP2-VvSUC12. (A) 1: pCAMBIA2301-SP1 is digested by Hind Ⅲ/Dra Ⅲ to get the 365 bp SP1 fragment; 2: recombined plasmid pCAMBIA2301-SP1; M: marker Ⅲ . (B) M:marker Ⅲ; 1: pCAMBIA2301-SP2-GUS-SP1 is digested by Hind Ⅲ/EcoR Ⅰto get about 2.2 kb SP2-GUS-NOS fragment. (C) 1: pCAMBIA2301-SP2-VvSUC12-SP1 is digested by Xba I/Sac I to get the 1 850 bp VvSUC12 fragment; 2: recombined plasmid pCAMBIA2301-SP2-VvSUC12-SP1; M: marker Ⅲ . (D) 1: pCAMBIA2301-SP1-VvSUC11-SP2-VvSUC12 is digested by Dra Ⅲ to get the 1 547 bpVvSUC11 fragment; M: marker Ⅲ.

圖2 雙價(jià)植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌的PCR鑒定Fig. 2 Identification of recombinant plasmid pCAMBIA2301- SP1-VvSUC11-SP2-VvSUC12 in A. tumefaciens strains GV3101 by PCR. M: marker Ⅲ; 1–7: Results of PCR of single-colony of A. tumefaciens strains GV3101 transformed by recombinant plasmid pCAMBIA2301-SP1-VvSUC11-SP2-VvSUC12; 8: PCR product of recombined plasmid pCAMBIA2301-SP1-VvSUC11-SP2-VvSUC12; 9: negative control.

取甜菜的葉柄約1 cm作外植體，在Pre-culture medium (表2) 中預(yù)培養(yǎng)2、4、6 d，進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化研究。預(yù)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)抗性芽分化率有很大的影響，預(yù)培養(yǎng)4 d抗性芽分化率最高，可達(dá)37%。預(yù)培養(yǎng)過(guò)短或過(guò)長(zhǎng)都會(huì)大大降低轉(zhuǎn)化率 (圖 3)。預(yù)培養(yǎng)過(guò)短侵染后外植體褐化嚴(yán)重，這可能是由于傷口尚未愈合的外植體對(duì)農(nóng)桿菌比較敏感，恢復(fù)農(nóng)桿菌對(duì)其的傷害能力較弱，在篩選培養(yǎng)基中褐化比較嚴(yán)重；預(yù)培養(yǎng)過(guò)長(zhǎng) (大于6 d) 抗性芽的分化頻率降低，是因?yàn)椴糠滞庵搀w在侵染前已分化產(chǎn)生不定芽，這些不定芽在以后的選擇培養(yǎng)中逐漸褐化死亡。

圖3 預(yù)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響Fig. 3 Effect of pre-culture time on transformation efficiency.

2.3.2 農(nóng)桿菌重懸液的濃度對(duì)抗性芽分化頻率的影響

不同的外植體材料對(duì)根癌農(nóng)桿菌的敏感性不同，為了確定最佳的侵染濃度，將預(yù)培養(yǎng)后的甜菜葉柄置于不同濃度的農(nóng)桿菌重懸液中進(jìn)行侵染。由圖4可知，農(nóng)桿菌重懸液濃度OD600為0.5時(shí)，侵染效果最佳，抗性芽分化率最高。菌液濃度 OD600高于 0.7時(shí)，外植體褐化加重，可能是因?yàn)楦邼舛鹊木簩?duì)葉柄細(xì)胞有毒害作用。同時(shí)菌液濃度過(guò)高暗培養(yǎng)后農(nóng)桿菌不易抑制，污染較重。

圖4 農(nóng)桿菌重懸液濃度對(duì)抗性芽分化頻率的影響Fig. 4 Effect of concentrations of Agrobacterium suspension on resistant buds rates.

2.3.3 表面活性劑Silwet L-77的濃度對(duì)抗性芽分化頻率的影響

表面活性劑Silwet L-77可以降低菌液的表面張力，增加菌液與外植體的接觸面積，從而促進(jìn)轉(zhuǎn)化。但表面活性劑濃度過(guò)大對(duì)外植體有一定的傷害，所以要確定最適宜的濃度。為此，侵染前在農(nóng)桿菌重懸液中加了0、0.005%、0.01%的表面活性劑Silwet L-77進(jìn)行試驗(yàn)。由圖5可知，當(dāng)表面活性劑Silwet L-77的濃度為0.005%時(shí)葉柄的褐化率最低，抗性芽的分化頻率最高，可達(dá)39%。

2.3.4 延遲篩選時(shí)間對(duì)對(duì)抗性芽分化頻率的影響

共培養(yǎng)后的葉柄如果立刻進(jìn)行篩選，則抗性芽的分化率比較低 (圖 6)，如果適當(dāng)在 Delayscreening medium (表2) 中，培養(yǎng)一段時(shí)間會(huì)大大增加轉(zhuǎn)化率。延遲篩選4 d，抗性芽的分化率最高，可達(dá)42%。延遲篩選時(shí)間大于4 d時(shí)，抗性芽也隨之降低 (圖6)。

2.3.5 轉(zhuǎn)化甜菜的再生

圖5 表面活性劑Silwet L-77的濃度對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響Fig. 5 Effect of concentrations of surfactant Silwet L-77on transformation efficiency.

圖6 延遲篩選時(shí)間對(duì)抗性芽分化頻率的影響Fig. 6 Effect of delay-screening time on resistant buds rates.

甜菜葉柄預(yù)培養(yǎng)4 d (圖7A)，在OD600為0.5的含有 0.005% Silwet L-77的農(nóng)桿菌 Suspension medium中侵染10 min；轉(zhuǎn)入Co-cultivation medium中培養(yǎng)3 d，轉(zhuǎn)入Delay-screening medium中培養(yǎng)4 d；移入Selection medium中選擇培養(yǎng)30 d，得到抗性芽 (圖7B)。待抗性芽長(zhǎng)至2~3 cm時(shí)，切下放入Root-induction medium中生根 (圖7C、D)。

2.4 轉(zhuǎn)基因甜菜的PCR及RT-PCR檢測(cè)

2.4.1 轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測(cè)

取 6株轉(zhuǎn)化甜菜和 1株對(duì)照甜菜的葉片提DNA，分別用基因VvSUC11和VvSUC12的引物 (表1) 進(jìn)行PCR檢測(cè)。有4株檢測(cè)到基因VvSUC11的活性 (圖8A)，有3株檢測(cè)到基因 VvSUC12活性 (圖8B)。PCR結(jié)果表明，在 6株轉(zhuǎn)化甜菜中有3株是VvSUC11和 VvSUC12共整合到甜菜基因組中 (圖9A、B)。

2.4.2 轉(zhuǎn)基因植株的RT-PCR檢測(cè)

以3株同時(shí)轉(zhuǎn)化了2個(gè)基因的甜菜植株為材料，用基因 VvSUC11和 VvSUC12引物 (表 1) 進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)。有 2株甜菜在根和莖中都檢測(cè)到VvSUC11和VvSUC12的活性 (圖9A、B)，這可能是因?yàn)橐话闱闆r下，甘薯的甘薯貯藏蛋白(Sporamin) 基因的根部特異性啟動(dòng)子主要在塊根中起作用[12]，而在含蔗糖的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的植物莖部也有其活性[13]。

圖7 轉(zhuǎn)化甜菜的再生Fig. 7 Regeneration of transformation sugar beet. (A) Pre-culture of petioles. (B) Regeneration of resistant buds. (C, D) Induced roots.

圖8 轉(zhuǎn)化甜菜的PCR檢測(cè)結(jié)果Fig. 8 Identification of transformed sugar beets by PCR. (A) M: marker Ⅲ ; 1?6: PCR results of transformed sug ar beets using the primers of VvSUC11; 7: PCR results of wild-type sugar beet using the primers of VvSUC11; 8: PCR results of plasmid carrying VvSUC11 using the primers of VvSUC11. (B) M: marker Ⅲ ; 1?6: PCR results of transformed sugar beets using the primers of VvSUC12; 7: PCR results of wild-type sugar beet using the primers of VvSUC12; 8: PCR results of plasmid carrying VvSUC12 using the primers of VvSUC12.

圖9 轉(zhuǎn)化甜菜的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果Fig. 9 Identification of transformed sugar beets by RT-PCR. (A, B) M: marker Ⅲ ; 1?3: RT-PCR results of root, stem, leaf of the fist transformed sugar beet respectively using the primers of VvSUC11and VvSUC12; 4?6 : RT-PCR results of root, stem, leaf of the second transformed sugar beet respectively using the primers of VvSUC11and VvSUC12; 7?9: RT-PCR results of root, stem, leaf of the third transformed sugar respectively using the primers of VvSUC11and VvSUC12; 10: RT-PCR results of wild-type sugar beet respectively using the primers of VvSUC11and VvSUC12; 11: RT-PCR results of plasmid pCAMBIA2301-SP1-VvSUC11-SP2-VvSUC12 respectively using the primers of VvSUC11and VvSUC12.

3 討論

根據(jù)系統(tǒng)發(fā)生學(xué)的分析，所有已知的蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白類(lèi)似蛋白可以分為 3個(gè)亞群：SUT1、SUT2和SUT4；VvSUC11屬于SUT4亞群，VvSUC12 屬于SUT2亞群[14]。SUT4亞群中的成員一般都具有低親和性/高轉(zhuǎn)運(yùn)能力 (Low-affinityhigh-capacity，LAHC)[14]。盡管該類(lèi) SUT對(duì)蔗糖的親和力要弱一些，但在蔗糖濃度高時(shí)卻有助于大量蔗糖的轉(zhuǎn)運(yùn)。它們主要參與高濃度蔗糖的轉(zhuǎn)運(yùn)步驟，向庫(kù)組織大量轉(zhuǎn)運(yùn)蔗糖，在決定庫(kù)容大小上起主要作用，還可能參與蔗糖吸收效率的調(diào)控[15]。SUT2亞族或?yàn)闊o(wú)蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)能力、可能具有蔗糖信號(hào)感應(yīng)(Sucrose sensing) 功能的類(lèi)蔗糖載體蛋白[4]，或?yàn)榈陀H和性/高轉(zhuǎn)運(yùn)能力的蔗糖載體蛋白[16-17]。Manning等[8]研究表明，VvSUC11和VvSUC12在葡萄果漿中作用是負(fù)責(zé)蔗糖從質(zhì)外體向薄壁細(xì)胞裝載?？梢?jiàn)，VvSUC11和VvSUC12決定著葡萄漿果的糖含量。

植 物 SUC 屬 于 MFS (Major facilitator superfamily) 中的糖轉(zhuǎn)運(yùn)家族的一個(gè)中等規(guī)模的亞家族[18]。屬于 MFS 的膜蛋白，通過(guò)寡聚化(Oligomerization) 而形成同源二聚體、異源二聚體、甚至四聚體等是一種非常普遍的現(xiàn)象，這可能是其調(diào)節(jié)自身轉(zhuǎn)運(yùn)活性的一種方式[19]。根據(jù)不同蔗糖載體蛋白在植株中的分布和組織細(xì)胞定位、不同的動(dòng)力學(xué)特征及表達(dá)調(diào)控模式等推測(cè)，寡聚化可能也是植物對(duì)其蔗糖載體轉(zhuǎn)運(yùn)活性進(jìn)行精確調(diào)控的一種主要方式[20]。Davies等[7]研究發(fā)現(xiàn)，VvSUC11 和VvSUC12在葡萄漿果中的表達(dá)模式一致，當(dāng)己糖開(kāi)始在液泡中積累的時(shí)候，VvSUC11和VvSUC12在漿果中的表達(dá)增加。這暗示了 VvSUC11和 VvSUC12在功能上可能存在著互作?；谶@種考慮，本研究構(gòu)建了含這兩個(gè)基因的雙價(jià)植物表達(dá)載體。

農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，為了獲得高產(chǎn)，不僅要設(shè)法提高光合作用形成的生物學(xué)產(chǎn)量，而且要通過(guò)一定的措施來(lái)提高經(jīng)濟(jì)學(xué)產(chǎn)量。本研究把甘薯的甘薯貯藏蛋白 (Sporamin) 基因的根部特異性啟動(dòng)子構(gòu)建到載體上用于啟動(dòng)VvSUC11和VvSUC12基因的表達(dá)，就是根據(jù)蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在糖分積累中的作用，從調(diào)控源到庫(kù)關(guān)系的角度出發(fā)，來(lái)定向的提高甜菜的經(jīng)濟(jì)學(xué)產(chǎn)量，為通過(guò)基因工程的方法來(lái)提高農(nóng)作物的產(chǎn)量提供新的思路。

本研究成功構(gòu)建了含有甘薯的甘薯貯藏蛋白基因根部特異性啟動(dòng)子的植物表達(dá)載體 pCAMBIA2301-SP1-VvSUC11-SP2-VvSUC12；并首次將VvSUC11和VvSUC12基因轉(zhuǎn)化到甜菜中使其表達(dá)，來(lái)研究其能否提高甜菜的含糖量，為利用蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白來(lái)提高農(nóng)作物的有效的經(jīng)濟(jì)學(xué)產(chǎn)量奠定堅(jiān)實(shí)理論和應(yīng)用基礎(chǔ)。建立了高效的甜菜遺傳轉(zhuǎn)化體系，為通過(guò)基因工程的方法來(lái)改良甜菜的品質(zhì)提供方便。

REFERENCES

[1] Kühn C, Barker L, Bürkle L, et al. Update on sucrose transport in higher plants. J Exp Bot, 1999, 50: 935?953.

[2] Buchanan BB, Gruissem W, Jones RL. Biochemistry & Molecular Biology of Plants. Rockville: American Society of Plant Physiologists, 2000: 748?776.

[3] Williams LE, Lemoine R, Sauer N. Sugar transporters in higher plants-a diversity of roles and complex regulation. Trends Plant Sci, 2000, 5(7): 283?290.

[4] Barker L, Kühn C, Weise A, et al. SUT2, a putative sucrose sensor in sieve elements.Plant Cell, 2000, 12(7): 1153?1164.

[5] Riesmeier JW, Willmitzer L, Frommer WB. Isolation and characterization of a sucrose carrier cDNA from spinach by functional expression in yeast. EMBO J, 1992, 11(13): 4705?4713.

[6] Lalonde S, Boles E, Hellmann H, et al. The dual function of sugar carriers: transport and sugar sensing. Plant Cell, 1999, 11(4): 707?726.

[7] Davies C, Wolf T, Robinson SP. Three putative sucrose transporters are differentially expressed in grapevine tissues. Plant Sci, 1999, 147(2): 93?100.

[8] Manning K, Davies C, Bowan HC, et a1. Functionalcharacterization of two ripening-related sucrose transporters from grape berries. Ann Bot, 2001, 87(1): 125?129.

[9] Chen S, Zeng L, Chen SW, et a1. Differentiated expression of VvSUC12 and VvSUC27 in embryogenic and nonembryogenic calli of Vitis vinifera L. Chin J Biotech, 2010, 26(4): 530?537.陳思, 曾磊, 陳尚武, 等. 蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因 VvSUC12和VvSUC27在葡萄胚性和非胚性愈傷組織中的差異表達(dá). 生物工程學(xué)報(bào), 2010, 26(4): 530?537.

[10] Zhang YL, Meng QY, Zhu HL, et al. Functional characterization of a LAHC sucrose transporter isolated from grape berries in yeast. Plant Growth Regul, 2008, 54(1): 71?79.

[11] Zhang YW. Preliminary studies of sucrose transporter function in improving the yield of sugar of sugar beet [D]. Shihezi: Shihezi University, 2009.張彥偉. 蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因在提高甜菜含糖量中的初步研究[D]. 石河子: 石河子大學(xué), 2009.

[12] Hattori T, Nakamura K. Genes coding for the major tuberous root protein of sweet potato: identification of putative regulatory sequence in the 5’upstream region. Plant Mol Biol, 1988, 11(4): 417?426.

[13] Ohta S, Hattori T, Morikami A, et al. High-level expression of a sweet potato sporamin gene promoter: β-glucuroidase (GUS) fusion gene in the stems of transgenic tobacco plants is conferred by multiple cell type-specific regulatory elements. Mol Gen Genet, 1991, 225(3): 369?378.

[14] Kühn C, Hajirezaei MR, Fernie AR, et al. The sucrose transporter StSUT1 localizes to sieve elements in potato tuber phloem and influences tuber physiology and development. Plant Physiol, 2003, 131(1): 102?113.

[15] Weise A, Barker L, Kühn C, et al. A new subfamily of sucrose transporters, SUT4, with low affinity/high capacity is localized in enucleate sieve elements of plants. Plant Cell, 2000, 12(8): 1345?1355.

[16] Schulze W, Weise A, Frommer WB, et al. Function of the cytosolic N-terminus of sucrose transporter AtSUT2 in substrate affinity. FEBS Lett, 2000, 485(2/3): 189?194.

[17] Meyer S, Melzer M, Truernit E, et al. AtSUC3, a gene encoding a new Arabidopsis sucrose transporter, is expressed in cells adjacent to the vascular tissue and in a carpel cell layer. Plant J, 2000, 24(6): 869?882.

[18] Lemoine R. Sucrose transporters in plants: update on function and structure. BBA Biomembranes, 2000, 1465(1/2): 246?262.

[19] Veenhoff LM, Heuberger EHML, Poolman B. The lactose transport protein is a cooperative dimer with two sugar translocation pathways. EMBO J, 2001, 20(12): 3056?3062.

[20] Reinders A, Schulze W, Kühn C, et al. Protein-protein interactions between sucrose transporters of difierent affinities colocalized in the same enucleate sieve element. Plant Cell, 2002, 14(7): 1567?1577.