張賽，邢克克，胡亞冬，謝春芳，劉大嶺，姚冬生,3

1 暨南大學(xué) 微生物技術(shù)研究所，廣州 510632

2 廣東省生物工程藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510632

3 基因工程藥物國(guó)家工程研究中心，廣州 510632

黃曲霉毒素 (Aflatoxin，AFT) 是由黃曲霉、寄生曲霉、集峰曲霉和溜曲霉等多種真菌產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物[1-2]，其中黃曲霉毒素B1 (AFB1) 分布范圍最廣且化學(xué)性質(zhì)最穩(wěn)定[3]，具有很強(qiáng)的致癌性、致突變性和致畸性。文獻(xiàn)報(bào)道氧化還原酶是一類(lèi)對(duì)AFB1有分解轉(zhuǎn)化作用的酶。Doyle等[4]報(bào)道寄生曲霉Aspergillus parasiticus能夠產(chǎn)生降解AFB1的過(guò)氧化物酶 (Peroxidase)，過(guò)氧化物酶的量與AFB1被降解的量之間存在著直接的關(guān)系。Ueng等[5]報(bào)道細(xì)菌重組表達(dá)的人細(xì)胞色素 P450 酶 (Bacterial recombinant human cytochrome P450) 1A2轉(zhuǎn)化黃曲霉毒素 B1所形成的產(chǎn)物的基因毒性比 P450酶3A4低。Das等[6-7]報(bào)道辣根過(guò)氧化物酶 (Horse radish peroxidas) 在20 ℃、pH 6.0處理黃曲霉毒素B1 60 min，轉(zhuǎn)化黃曲霉毒素B1的效率達(dá)到38%。Alberts等[8]報(bào)道變色栓菌Trametesversicolor的真菌漆酶 (Fungal laccase) 在 30 ℃、pH 6.5處理1.4 μg/mL的黃曲霉毒素B1，72 h后的降解率可達(dá)87.34%。黃曲霉毒素解毒酶 (Aflatoxin detoxifizyme，ADTZ) 是一種來(lái)自發(fā)光假蜜環(huán)菌 Armillariella tabescens E-20，能夠在體外直接降解黃曲霉毒素，使其特征熒光吸收明顯減弱的氧化酶。但是該酶在高溫和極端pH條件下穩(wěn)定性差，易喪失活性[9]，限制了其在工業(yè)上的應(yīng)用。為了獲得更高催化效率的酶，加速其在工業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用進(jìn)程，采用定向進(jìn)化(易錯(cuò) PCR) 的方法，向該酶中隨機(jī)引入突變，建立黃曲霉毒素解毒酶基因突變文庫(kù)，再結(jié)合HRP-RBG快速高通量篩選系統(tǒng)篩選的方法，獲得了催化效率提高的黃曲霉毒素解毒酶突變株。

酶的改造可以分為理性設(shè)計(jì)和非理性設(shè)計(jì)，前者通過(guò)分析蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)，確定結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系，再通過(guò)定點(diǎn)誘變改變蛋白質(zhì)中個(gè)別氨基酸，產(chǎn)生新性狀的蛋白質(zhì)；后者不需要了解蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系，在實(shí)驗(yàn)室中模仿自然進(jìn)化的過(guò)程——隨機(jī)突變、重組和選擇，在較短時(shí)間內(nèi)完成漫長(zhǎng)的自然進(jìn)化過(guò)程，有效地改造蛋白質(zhì)[10]。利用易錯(cuò)PCR (Error prone PCR) 或 DNA改組 (DNA shuffling)對(duì)酶分子編碼基因進(jìn)行定向進(jìn)化，可獲得催化效率提高的酶蛋白，并改善酶的一系列性質(zhì)，如穩(wěn)定性[11-12]、底物特異性[13]等，是蛋白質(zhì)工程的重要研究工具。由于對(duì)黃曲霉毒素解毒酶的空間結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系尚不了解，所以采用非理性的方法 (易錯(cuò)PCR技術(shù)) 進(jìn)行改造。利用黃曲霉毒解毒酶催化黃曲霉毒素 B1時(shí)產(chǎn)生的 H2O2[14]與辣根過(guò)氧化物酶(HRP)-隱性亮綠 (Recessive brilliant green，RBG) 系統(tǒng)關(guān)聯(lián)，使隱性亮綠 (RGB) 轉(zhuǎn)化成亮綠 (Brilliant green，BG)，通過(guò)簡(jiǎn)單檢測(cè)反應(yīng)物吸光值變化對(duì)突變體進(jìn)行鑒定，并用實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的釀酒酵母附加型分泌表達(dá)載體構(gòu)成了一個(gè)突變酶的快速篩選系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)所建的突變庫(kù)進(jìn)行高通量篩選，解決了篩選時(shí)大量檢測(cè)黃曲霉毒素繁雜耗時(shí)和高成本的問(wèn)題，并達(dá)到了良好的篩選目的。

1 材料與方法

1.1 菌株和質(zhì)粒

宿主菌釀酒酵母 Saccharomyces cerevisiae BJ5465購(gòu)自Invitrogen公司；大腸桿菌DH5α由本研究室保存；大腸桿菌-釀酒酵母穿梭分泌表達(dá)質(zhì)粒pYES2/CT/α-factor (簡(jiǎn)寫(xiě)為pYCα) 系本實(shí)驗(yàn)室自行構(gòu)建[15]；pKLAC1-adtz重組質(zhì)粒為本研究室保存。

1.2 酶和試劑

PCR所用試劑為NEB公司產(chǎn)品；限制內(nèi)切酶酶XhoⅠ和NotⅠ為T(mén)OYOBO公司產(chǎn)品；小量質(zhì)粒抽提試劑盒和 PCR產(chǎn)物快速膠回收試劑盒購(gòu)自TIANGEN公司；酵母質(zhì)粒抽提試劑盒購(gòu)自Biomega公司；PCR引物合成和DNA測(cè)序委托北京奧科生物技術(shù)公司；辣根過(guò)氧化酶和亮綠購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；AFB1和二甲基亞砜(DMSO) 購(gòu)自Sigma公司；其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 培養(yǎng)基

培養(yǎng)基 LB、YPD、YPGal、SC-U-D均按《Invitrogen公司操作手冊(cè)》推薦方法配制。

1.4 易錯(cuò)PCR的擴(kuò)增與突變文庫(kù)的建立

1.4.1 易錯(cuò)PCR引物設(shè)計(jì)

根據(jù)已知adtz基因序列，使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)error-prone PCR引物。在引物的末端分別引入限制內(nèi)切酶XhoⅠ和NotⅠ的酶切位點(diǎn) (下劃線(xiàn)所示)，并分別在5′端增加3~5個(gè)保護(hù)堿基。上游引物P9A1:5′-CCCTCGAG AAAAGAGAGGCTGAAGC TATGGCCACCACAACTGTCC-3′；下游引物P9A2: 5′-AAGGAAAAAAGCGGCCGC TTACAATCGTCTC TCAATGAAACTTTC-3′。

1.4.2 易錯(cuò)PCR反應(yīng)體系

20 μL反應(yīng)體系為：10×PCR緩沖液2 μL，dATP (10 mmol/L) 和dGTP (10 mmol/L) 各0.4 μL，dCTP (10 mmol/L) 和dTTP (10 mmol/L) 各2 μL，模板pKLAC1-adtz 0.2 μL，上下游引物 (10 μmol/L) 各0.6 μL，MgCl2(25 mmol/L) 4.4 μL，MnCl2(2 mmol/L) 0、0.8、2、4、6、8 μL，Taq DNA聚合酶0.2 μL， ddH2O 8、6、4、2、0.8、0 μL。易錯(cuò)PCR 循環(huán)程序：降落PCR，94 ℃ 5 min 5個(gè)循環(huán)；94 ℃ 30 s、65 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min 45 s ，每個(gè)循環(huán)退火溫度降低1 ℃，共25個(gè)循環(huán)；94 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min 45 s，72 ℃ 10 min。

1.4.3 易錯(cuò)PCR突變文庫(kù)的建立

S. cerevisiae BJ5465感受態(tài)細(xì)胞的制備：挑取S. cerevisiae BJ5465單克隆于5 mL YPD液體培養(yǎng)基中，30 ℃、250 r/min振蕩培養(yǎng)過(guò)夜；以1%接種量轉(zhuǎn)入50 mL YPD液體培養(yǎng)基，30 ℃、250 r/min培養(yǎng)至OD600約為1.0~1.5。收集菌液至50 mL離心管中，4 000 r/min離心10 min，棄上清。用溶液Ⅰ(0.1 mol/L醋酸鋰+0.01 mol/L二硫蘇糖醇+1 mol/L TE) 重懸沉淀，冰浴1 h，4 000 r/min離心10 min棄上清，25 mL冰浴無(wú)菌水重懸，4 000 r/min離心10 min棄上清，重復(fù)操作一次。用5 mL冰浴的溶液Ⅱ (1 mol/L山梨醇) 重懸沉淀，4 000 r/min離心10 min棄上清。加入200 μL冰浴的溶液Ⅱ，懸浮菌體，分裝[16]。

重組質(zhì)粒的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化：將PCR產(chǎn)物以1.2%瓊脂糖凝膠電泳純化回收，命名為adtzmut。用XhoⅠ、NotⅠ限制性?xún)?nèi)切酶純化 PCR產(chǎn)物，純化后的易錯(cuò)PCR產(chǎn)物與同樣雙酶切的穿梭分泌表達(dá)載體 pYCα混勻，用T4 DNA連接酶4 ℃過(guò)夜連接。連接產(chǎn)物熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布在含Amp的LB平板，37 ℃培養(yǎng)16 h后將平板上所有克隆轉(zhuǎn)入含有Amp的液體LB培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)過(guò)夜。提取大腸桿菌DH5α中重組質(zhì)粒，采用電轉(zhuǎn)化的方式[17-18]，轉(zhuǎn)入 S. cerevisiae BJ5465感受態(tài)細(xì)胞后迅速加入預(yù)冷1 mol/L山梨醇，涂布在SC-U-D平板上，30 ℃培養(yǎng)48 h。

1.4.4 重組子的鑒定

挑取1.4.3中平板上單克隆，提取質(zhì)粒，用限制性?xún)?nèi)切酶XhoⅠ、NotⅠ雙酶切和PCR鑒定含有突變基因的重組子pYCα-adtzmut是否構(gòu)建成功。

1.5 易錯(cuò)PCR突變文庫(kù)的篩選

1.5.1 突變酶ADTZ的初篩

挑取單克隆接種到Y(jié)PGal液體培養(yǎng)基的96 孔板中進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，30 ℃搖床培養(yǎng)72 h后取上清液。酶活力的檢測(cè)[14-19]：實(shí)驗(yàn)組 (總體系200 μL)——取20 μL培養(yǎng)上清粗酶液加入到含有 AFB1 4 μL、 pH 5.8 0.02 mol/L Na2HPO4-0.01 mol/L檸檬酸緩沖液131 μL、5 μL HRP (2.5×10?4mol/L) 和40 μL的隱性亮綠 (1.0×10?4mol/L) 的酶標(biāo)板中；對(duì)照組——把4 μL AFB1替換成4 μL甲醇，其他成分與實(shí)驗(yàn)組相同。加入酶液后立即測(cè)量630 nm 波長(zhǎng)的吸光值，然后在30 ℃溫育30 min 再次檢測(cè)630 nm波長(zhǎng)的吸光值，用△OD630表示相對(duì)酶活力的高低。為了排除HRP也能降解AFB1的干擾，分別以含有 pYCα空質(zhì)粒和攜帶野生型 adtz基因的S. cerevisiae BJ5465作為陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照，對(duì)文庫(kù)進(jìn)行定性篩選，△OD630高于野生型的克隆將進(jìn)入下一輪篩選。

高溫 (70 ℃) 處理：取上清粗酶液，在70 ℃水浴30 min后，然后取處理過(guò)的酶液進(jìn)行酶活的測(cè)定。酶活測(cè)定的條件是在30 ℃、pH 6.0、0.04 mol/L磷酸氫二鈉-0.02 mol/L檸檬酸緩沖液環(huán)境下進(jìn)行。酸(pH 4.0) 處理：取上清粗酶液和pH 2.5緩沖液混合后，使最終體系的pH為4.0，在25 ℃水浴30 min后，再測(cè)定相對(duì)酶活力。堿 (pH 7.5) 處理：取上清粗酶液和pH 7.5緩沖液混合后，使最終體系的pH為7.5，在25 ℃水浴30 min后，再測(cè)定相對(duì)酶活力。酶活力定義：一個(gè)單位 (U) 定義為在30 ℃，pH 6.0的反應(yīng)條件下，每分鐘將AFB1轉(zhuǎn)化釋放1 pmol H2O2所需要的酶量。

1.5.2 突變酶ADTZ的復(fù)篩

將 1.5.1篩選到的優(yōu)秀克隆再在同樣條件處理后，以AFB1為底物，用HPLC測(cè)定樣品反應(yīng)組和樣品空白組中所殘留的AFB1計(jì)算突變體的酶活力。酶活力定義：一個(gè)單位 (U) 定義為在30 ℃，pH 6.0的反應(yīng)條件下，l分鐘降解l pmol AFB1所需的酶量。

1.6 酶的誘導(dǎo)表達(dá)

將經(jīng)初篩和復(fù)篩獲得的優(yōu)良性質(zhì)的S. cerevisiae BJ5465重組子接種于含2%半乳糖的YPGal培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)，誘導(dǎo)表達(dá)突變酶，取上清液，按Bradford法測(cè)定[20]其蛋白質(zhì)的含量并進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)的初步分析。

1.7 酶學(xué)性質(zhì)分析

1.7.1 溫度和pH對(duì)酶活性的影響

將突變克隆培養(yǎng)酶液分別在20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃溫度下，通過(guò)外標(biāo)法定量檢測(cè)得到樣品反應(yīng)組和樣品空白組中所殘留的 AFB1，兩者比較計(jì)算出酶活力。在不同的pH (3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0) 的緩沖液(0.04 mol/L Na2HPO4-0.02 mol/L 檸檬酸) 下，通過(guò)外標(biāo)法定量檢測(cè)得到樣品反應(yīng)組和樣品空白組中所殘留的AFB1，兩者比較計(jì)算出酶活力，以突變酶的最高酶活力為100%，計(jì)算各組酶的相對(duì)活力。

1.7.2 熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性

將突變克隆培養(yǎng)酶液分別在20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃溫度下保溫30 min，然后在pH 6.0的緩沖液下用外標(biāo)法定量檢測(cè)得到樣品反應(yīng)組和樣品空白組中所殘留的AFB1，兩者比較計(jì)算出酶活力，以突變酶的最高酶活力為100%，計(jì)算各組酶的相對(duì)活力。將突變克隆培養(yǎng)酶液分別在pH 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的緩沖液中于25 ℃保溫30 min，然后在pH 6.0的0.04 mol/L Na2HPO4-0.02 mol/L 檸檬酸緩沖液下用外標(biāo)法定量檢測(cè)得到樣品反應(yīng)組和樣品空白組中所殘留的AFB1，兩者比較計(jì)算出酶活力，以突變酶的最高酶活力為100%，計(jì)算各組酶的相對(duì)活力。

1.8 突變酶突變位點(diǎn)分析

將篩選獲得的優(yōu)良性狀突變體，進(jìn)行測(cè)序 (由北京奧科生物公司完成)，并對(duì)其關(guān)鍵氨基酸進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 易錯(cuò)PCR突變庫(kù)的建立

2.1.1 易錯(cuò)PCR條件的確立

在易錯(cuò) PCR反應(yīng)體系中分別加入不同體積的MnCl2，形成0、0.02、0.05、0.10、0.15、0.20 mmol/L的濃度梯度；同時(shí)MgCl2濃度增加到7 mmol/L以穩(wěn)定非互補(bǔ)的堿基對(duì)，dCTP和dTTP的濃度增加到1 mmol/L以促進(jìn)堿基錯(cuò)配的傾向性，其中 Mg2+和Mn2+的濃度被調(diào)整，可以得到不同突變頻率的文庫(kù)。從突變庫(kù)中隨機(jī)挑取10個(gè)克隆進(jìn)行測(cè)序，堿基的突變頻率為4.64%，符合EP-PCR文庫(kù)突變?cè)瓌t。

2.1.2 易錯(cuò)PCR突變庫(kù)的建立

將易錯(cuò) PCR產(chǎn)物克隆到大腸桿菌-釀酒酵母穿梭表達(dá)載體 pYCα上，重組質(zhì)粒在大腸桿菌 DH5α中擴(kuò)增后轉(zhuǎn)入釀酒酵母S. cerevisiae，結(jié)果所構(gòu)建的突變克隆庫(kù)庫(kù)容約為1.0×104。

2.2 易錯(cuò)PCR突變文庫(kù)的篩選

所建立的EP-PCR文庫(kù)按圖1的流程進(jìn)行初篩和復(fù)篩。

2.2.1 初篩

用HRP測(cè)活方法對(duì)黃曲霉毒素解毒酶EP-PCR突變文庫(kù) (約104) 克隆進(jìn)行初步篩選。ADTZ催化AFB1產(chǎn)生的H2O2能使無(wú)色的RGB轉(zhuǎn)化成BG，其直觀的顏色變化見(jiàn)圖 2，篩選得到的陽(yáng)性克隆見(jiàn)圖中標(biāo)記的。

篩選得到酶活力高于野生型約的突變體 5 000個(gè)。將這5 000個(gè)克隆分別在70 ℃、pH 4.0、pH 7.5的環(huán)境中處理30 min后測(cè)定其酶活，結(jié)果見(jiàn)圖3。

2.2.2 復(fù)篩

對(duì)通過(guò)選擇壓力初篩得到的約 500個(gè)突變體克隆進(jìn)行復(fù)篩，用HPLC檢測(cè)底物減少量的圖譜見(jiàn)圖4。突變酶A1476經(jīng)pH 4.0、30 min處理后測(cè)活，酶活力是野生型的21倍，突變酶A1773經(jīng)pH 7.5、30 min處理后測(cè)活，酶活力比野生型提高了6.5倍，突變酶A2863經(jīng)70 ℃ 30 min 處理后測(cè)活，酶活力比野生型提高了12.6倍 (表1)。

表1 突變酶在各自的選擇壓力下對(duì)底物AFB1的酶活力測(cè)定結(jié)果Table 1 The results of mutants specific activity with AFB1 in the pressure of their choice

2.3 突變酶的酶學(xué)性質(zhì)分析

2.3.1 突變酶的最適溫度和最適pH值

突變酶A1476和A1773在50 ℃和pH 4.0條件下表現(xiàn)最佳酶活，最適反應(yīng)溫度比野生型提高了10 ℃，最適pH由野生型的pH 6.0降低到了pH 4.0，而 A1476比 A1773有較寬的反應(yīng)溫度范圍，A1476殘留活性在60%以上的酶促反應(yīng)溫度范圍為30 ℃~65 ℃，而A1773殘留活性在60%以上的酶促反應(yīng)溫度范圍為35 ℃~55 ℃；突變酶A2863的最適 pH范圍擴(kuò)大到 pH 4.0~7.0，而野生型的最適pH只在pH 5.5~6.5狹窄的范圍 (圖5~6)。

圖1 易錯(cuò)PCR文庫(kù)的篩選流程圖Fig. 1 Scheme of screening EP-PCR libraries.

圖2 HRP-RBG系統(tǒng)對(duì)ADTZ突變體的初篩結(jié)果Fig. 2 Results of HRP-RBG screening. The areas of A1-H1, A2-H2 and A3-H3 are standard curve, the areas of ellipse are positive clones.

圖3 EP-PCR突變庫(kù)篩選結(jié)果Fig. 3 Results of EP-PCR screening mutants. X: thermal (70 °C) stability; Y:weak alkaline (pH 7.5) stability; Z: acid (pH 4.0) stability. ★ : XYZ; ▲: XY;□: ZX; ○: YZ.

圖4 HPLC檢測(cè)AFB1的圖譜Fig. 4 Map of AFB1 detected by HPLC. The black line is the control group; The red line is the experimental group.

圖5 溫度對(duì)突變酶的酶活力影響Fig. 5 Effect of temperature on the activity of evolved enzymes.

圖6 pH對(duì)突變酶的酶活力影響Fig. 6 Effect of pH on the activity of evolved enzymes.

2.3.2 突變酶的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性

突變酶A1773在50 ℃~70 ℃有較好的穩(wěn)定性，突變酶A1773在70 ℃溫浴30 min，殘留酶活力仍達(dá)到90%，而野生型酶在40 ℃以上酶活力喪失超過(guò)了50%。野生型的酶在pH 6.0和30 ℃表現(xiàn)出最好的穩(wěn)定性，而在其他環(huán)境下，酶活力下降得很快。A1476和A2863在酸性環(huán)境有較好穩(wěn)定性，經(jīng)pH 4.0處理30 min，殘留酶活力仍達(dá)80%以上；A2863經(jīng)pH 7.5處理30 min，殘留活力仍達(dá)80%，pH穩(wěn)定性擴(kuò)大到pH 7.5 (圖7~8)。

圖7 突變酶的溫度穩(wěn)定性Fig. 7 Thermal stability of evolved enzymes.

圖8 突變酶的pH穩(wěn)定性Fig. 8 pH stability of evolved enzymes.

2.4 突變酶的突變位點(diǎn)分析

經(jīng)過(guò)測(cè)序結(jié)果，分析突變位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)：2個(gè)克隆均存在Ile307Leu的突變，我們推測(cè)307位點(diǎn)與酸性穩(wěn)定性有關(guān)；推測(cè)第 127位的 Lys和第 613位的Arg與熱穩(wěn)定有關(guān)，推測(cè)第73位可能與堿性穩(wěn)定性有關(guān)。

表2 突變酶堿基和氨基酸變化Table 2 Nucleotide substitution and amino acid change of mutants

3 討論

由于對(duì)黃曲霉毒素解毒酶的三維結(jié)構(gòu)以及催化機(jī)制等信息了解得還不夠充分，對(duì)其進(jìn)行理性設(shè)計(jì)存在很大難度，因此不可能利用傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)工程方法對(duì)黃曲霉毒素解毒酶進(jìn)行改造。定向進(jìn)化能夠快速鑒定適應(yīng)性突變，以最小的序列變化產(chǎn)生大的表型差異，從而使氨基酸序列差異與蛋白質(zhì)功能差異之間的真正相互關(guān)系變得明朗，相當(dāng)大地簡(jiǎn)化了序列比較分析工作。在隨機(jī)突變實(shí)驗(yàn)中，要考慮的重要因素是突變頻率。本研究設(shè)置不同濃度的Mn2+進(jìn)行易錯(cuò)PCR，同時(shí)控制Mg2+的濃度，得到不同突變頻率的多樣性文庫(kù)，一般為每個(gè)基因1~5個(gè)堿基，對(duì)應(yīng)的氨基酸突變數(shù)是 1~2個(gè)，控制合適的突變率為0.5%~2%之間。由于突變體的表達(dá)系統(tǒng)是分泌型釀酒酵母，雖然解決了外源蛋白直接分泌到培養(yǎng)基中利于快速篩選，但因釀酒酵母轉(zhuǎn)化率低，需要經(jīng)過(guò)多次的基因操作來(lái)擴(kuò)大庫(kù)容。本實(shí)驗(yàn)從感受態(tài)的制備和轉(zhuǎn)化條件兩方面優(yōu)化，摸索了 7種條件，最終確定醋酸鋰法制備感受態(tài)和電轉(zhuǎn)化結(jié)合的方案。AFB1的檢測(cè)不僅是一個(gè)耗時(shí)、高成本、而且是毒性危險(xiǎn)性高的操作，為了解決定向進(jìn)化過(guò)程海量檢測(cè)的問(wèn)題，根據(jù)前期研究的結(jié)果表明[14]：黃曲霉毒素解毒酶催化AFB1時(shí)會(huì)產(chǎn)生H2O2，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了以隱性亮綠 (RBG) 為檢測(cè)系統(tǒng)易化篩選方法，即：以隱性亮綠 (RBG) 為底物，在pH 5.0~6.0條件下經(jīng)辣根過(guò)氧化物酶 (HRP) 催化RBG使其氧化為染料亮綠 (BG)，染料亮綠 (BG) 及酶催化反應(yīng)產(chǎn)物的最大吸收峰均位于630.6 nm處，可通過(guò)簡(jiǎn)單的測(cè)定630 nm處的吸光值變化來(lái)估算黃曲霉毒素解毒酶的活力。利用該系統(tǒng)大大地加快了篩選效率，并收到了良好的效果。

本研究采取易錯(cuò)PCR對(duì)黃曲霉毒素解毒酶adtz基因進(jìn)行定向進(jìn)化，建立了簡(jiǎn)單、快速的高通量篩選方法，并且成功地獲得了pH 4.0穩(wěn)定和pH 7.5穩(wěn)定性的突變酶A1476、A2863，其中A2863在pH 4.0穩(wěn)定和 pH 7.5均表現(xiàn)出較好的穩(wěn)定性，突變酶A1773在70 ℃有較好的穩(wěn)定性。從突變酶的序列分析可看出：A1476和A2863均具有pH 4.0的穩(wěn)定性的性質(zhì)，兩個(gè)克隆均存在Ile307Leu的突變，我們推測(cè)307位點(diǎn)與酸性穩(wěn)定性有關(guān)。突變酶A1773存在Glu127Lys、Gln613Arg突變，因此，我們推測(cè)第 127位的Lys和第613位的Arg與熱穩(wěn)定有關(guān)，A2863出現(xiàn) Gly73Ser、Ile307Leu、Val596Ala和Gln613Arg的突變，它存在Gln613Arg位點(diǎn)的突變，而沒(méi)有出現(xiàn)熱穩(wěn)定的性質(zhì)，可能由于突變的位點(diǎn)比較多，其他位點(diǎn)的突變導(dǎo)致喪失該性質(zhì)。與其他突變體比較A2863出現(xiàn)Gly73Ser位點(diǎn)的突變，而具有pH 7.5的穩(wěn)定性，因此，推測(cè)第73位可能與堿性穩(wěn)定性有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)為了便于篩選，選擇了釀酒酵母為宿主菌和采用附加型表達(dá)質(zhì)粒，目標(biāo)蛋白的表達(dá)量偏低，用培養(yǎng)基上清測(cè)定突變體酶活的比活仍較低，在以后的研究中可通過(guò)將這些突變酶的基因轉(zhuǎn)入畢赤酵母等高表達(dá)系統(tǒng)來(lái)提高目標(biāo)蛋白的表達(dá)量。致謝：暨南大學(xué)再生醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室蔡冬青老師實(shí)驗(yàn)室在本工作的完成過(guò)程中提供 Bio-Tek多功能酶標(biāo)儀給課題組使用，使高通量篩選工作效率得到極大提高，在此表示衷心地感謝。

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