陳 靚，朱秀清,2**，竇巍巍，夏明敬，王 玲

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，哈爾濱 150030；2.國家大豆工程技術(shù)研究中心，哈爾濱 150030）

大豆分離蛋白（soybean protein isolated,SPI）是利用高科技從脫脂大豆中除去大豆纖維和水溶性的非蛋白部分后所得[1]，它不僅以其營養(yǎng)價值高、資源豐富、成本低而倍受青睞，更為重要的是大豆蛋白還具有與食品的嗜好性、加工性等相關(guān)的各種功能特性，包括乳化性、起泡性、保水性、凝膠性等多種功能特性[2]。因此大豆蛋白被廣泛應(yīng)用于飲料、焙烤食品、乳品、蛋白替代品、肉制品等食品工業(yè)領(lǐng)域。然而，大豆分離蛋白在現(xiàn)代食品加工中的應(yīng)用受到一定的限制，這是因?yàn)槠浔旧淼墓δ苄再|(zhì)還不能完全滿足現(xiàn)代食品加工的需求，不同食品的加工對大豆分離蛋白功能性質(zhì)的要求不同，部分功能性需要加強(qiáng)或減弱。因此，對大豆分離蛋白的改性，提高大豆制品營養(yǎng)成分的生物有效利用性成為食品加工工業(yè)亟待解決的問題。

酶法改性是一種常用的改性方法，酶水解程度不同導(dǎo)致大豆分離蛋白結(jié)構(gòu)等方面的改變也不同，通過酶改性可得到滿足不同需求的功能性大豆分離蛋白質(zhì)，從而拓寬大豆蛋白在食品工業(yè)中應(yīng)用的范圍[3]。目前，國內(nèi)外學(xué)者在大豆分離蛋白的改性研究方面做了許多工作。研究證明適當(dāng)?shù)拿附獯蠖狗蛛x蛋白可以提高大豆分離蛋白的溶解性、乳化性、乳化穩(wěn)定性和起泡能力[4,5]。但目前對酶解后大豆分離蛋白各種功能性質(zhì)變化趨勢的研究，報道較少。本研究分別使用了木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶對大豆分離蛋白進(jìn)行水解，并對大豆分離蛋白各個時間段的酶解產(chǎn)物功能性質(zhì)的變化趨勢進(jìn)行了比較，為加工不同功能性大豆分離蛋白提供理論參考和支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

大豆分離蛋白（干基蛋白質(zhì)含量85.58%，水分含量6.65%）：哈高科大豆食品有限公司；堿性蛋白酶（酶活力為1.7×105U/mL）：Novo公司；木瓜蛋白酶（酶活力為5.4×104U/g）：廣西南寧杰沃利生物制品有限公司；福林酚、SDS：Sigma公司；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉：天津市東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠；無水硫酸鈉：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；甘油：天津市津東天正精細(xì)化學(xué)試劑廠。

1.2 主要儀器與設(shè)備

LD4-2A低速離心機(jī)：北京醫(yī)藥離心機(jī)制造廠；Z36HK高速離心機(jī)：Hermle Labortechlk GmbH；B-290噴粉機(jī)：瑞士BüCH公司；TA-XT2i型物性儀：英國 Stable Micro System公司；TU-1901雙光束紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限公司；HZS-H水浴振蕩器：哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 大豆分離蛋白酶解產(chǎn)物的制備

（1）工藝流程

（2）酶解條件 選用兩種酶進(jìn)行酶解，按照各種酶研究的基本使用條件進(jìn)行[6]，優(yōu)化的酶解條件見表1。大豆分離蛋白酶解液水解度的測定應(yīng)用甲醛滴定法測定[7]。

表1 大豆分離蛋白酶的酶解條件

1.3.2 大豆分離蛋白酶水解物加工性能的測定

（1）溶解性 2.00g固體樣品加入40mL蒸餾水，調(diào)節(jié)pH至7.0，攪拌30min后離心（10000r/min，15min），測定上清液中的氮含量，重復(fù)試驗(yàn)3次，結(jié)果以氮溶解指數(shù)（NSI）表示，以平均數(shù)表示測定結(jié)果。

（2）保水性 5.00g固體樣品中加入30mL蒸餾水，攪拌均勻后室溫放置30min，然后離心（4500r/min，30min）分離出上清液，測定殘留物質(zhì)量，同時測定上清液中的氮含量轉(zhuǎn)換為蛋白質(zhì)質(zhì)量，重復(fù)試驗(yàn)3次[8]。

（3）吸油性 3.00g固體樣品中加入大豆油9mL，攪拌均勻后室溫放置30min，使之充分吸油，然后離心（7500r/min，30min），除去液體后，測定殘留物的重量，重復(fù)試驗(yàn)3次[9]。

（4）乳化性 0.2mol/L、pH 7.0的磷酸緩沖溶液配制1%的固樣溶液與大豆油加入比例為4：1，最高轉(zhuǎn)速下（10000rpm）均質(zhì)1min，然后分別在0min和10min從燒杯底部吸取200uL乳狀液，用10mL 0.1%SDS（十二烷基硫酸鈉）溶液稀釋。在500nm條件下，以0.1%的SDS為空白樣，測定吸光值，重復(fù)試驗(yàn)3次[10]。

（5）發(fā)泡性 將5%的樣品溶液200mL置于實(shí)驗(yàn)室自制的組織搗碎機(jī)中，最高轉(zhuǎn)速下（10000r/min）攪拌1min，然后分別在0min和10min時讀取數(shù)據(jù)，待消泡后重復(fù)上述過程，共3次。

式中，H10—攪拌后放置10min泡沫的高度。

（6）凝膠性

a 凝膠的制備 取4g固樣配制成20%的樣品溶液，磁力攪拌均勻并離心（2500r/min，15min），密封后至于90攝氏度的水浴中加熱30min，然后轉(zhuǎn)移到冰浴中冷卻20min至室溫，樣品在冰箱中（4℃）貯存24h。

b 凝膠硬度的測定 使用TA-XT2i型物性測試儀測定凝膠硬度，探頭為P 0.5圓柱平頭狀探頭，測試前速度為2mm/s，測中速度為5mm/s，測試后速度為2mm/s，壓縮深度為15mm，硬度定義為凝膠強(qiáng)度，單位g。

（7）粘度 取4.5g固樣配制成15%的樣品溶液60mL，磁力攪拌均勻，用旋轉(zhuǎn)粘度儀測定其粘度，測定3次。

（8）成膜性 制膜→測定膜厚度→回軟揭膜→測定抗拉強(qiáng)度[11]

2 結(jié)果與討論

2.1 大豆分離蛋白酶水解產(chǎn)物變化規(guī)律

圖1 酶解時間對大豆分離蛋白酶水解程度的影響

由圖1可知，大豆分離蛋白隨著酶解時間的增加，水解度也隨之升高。相同酶解時間堿性蛋白酶水解產(chǎn)物的水解度比木瓜蛋白酶水解產(chǎn)物的水解度高，反應(yīng)8h堿性蛋白酶水解產(chǎn)物的水解度可達(dá)20.66%，木瓜蛋白酶水解產(chǎn)物的水解度可達(dá)9.81%。由于堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶在反應(yīng)1h前水解度均迅速升高；兩種酶解產(chǎn)物7h和8h的水解度較6h無明顯變化，所以研究中確定酶解時間為20min、40min、1h、2h、4h、6h。

2.2 大豆分離蛋白酶解產(chǎn)物功能性研究

2.2.1 溶解性

圖2 酶解時間對大豆分離蛋白酶解產(chǎn)物溶解性的影響

由圖2可知，溶解性用氮溶指數(shù)NSI表示，大豆分離蛋白堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶水解產(chǎn)物的NSI值隨酶解時間的增加呈上升趨勢，且均高于大豆分離蛋白本身，但相同時間木瓜蛋白酶水解產(chǎn)物的溶解性較堿性蛋白酶的高。大豆分離蛋白的NSI值為72.24%，堿性蛋白酶水解產(chǎn)物NSI值最高為88.67%，木瓜蛋白酶水解產(chǎn)物NSI值最高為83.93%。這是因?yàn)榇蠖狗蛛x蛋白酶解后，斷裂成多肽和小分子短鏈物質(zhì)，使-NH2和-COOH的數(shù)目增多，極性增加，電荷密度增大，親水性增強(qiáng)，從而提高了溶解性，表現(xiàn)為NSI值增高。同時由于被11S酸性亞基緊緊包裹著的堿性亞基結(jié)構(gòu)疏水性很強(qiáng)且致密，難以被酶解，所以水解速度緩慢，表現(xiàn)為隨著水解度的升高[12]，水解度與NSI值即溶解性的關(guān)系偏離線性[13,14]。

2.2.2 保水性

圖3 酶解時間對大豆分離蛋白酶解產(chǎn)物保水性的影響

由圖3可知，隨著酶解時間的增加，大豆分離蛋白堿性蛋白酶水解產(chǎn)物的保水性明顯下降；而木瓜蛋白酶水解產(chǎn)物的保水性在酶解4h前明顯高于大豆分離蛋白本身，且在1h時其保水性達(dá)到最高。大豆分離蛋白的保水性為5.56g/g；從20min至6h堿性蛋白酶水解產(chǎn)物保水性從4.55g/g逐漸下降至3.37g/g；木瓜蛋白酶水解產(chǎn)物保水性最高可達(dá)6.05g/g。這是由于大豆分離蛋白被酶解后，大量的親水基團(tuán)外露，使保水性有所提高[15]。又由于酶解程度的增加，水解度進(jìn)一步增大，形成了更多的小分子，不利于形成蛋白質(zhì)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)且氫鍵減少而導(dǎo)致保水性降低[16]，同時蛋白質(zhì)發(fā)生變性或聚集作用也可引起保水性下降。堿性蛋白酶水解大豆分離蛋白的速度較快，所以其水解物的保水性在20min時已經(jīng)低于大豆分離蛋白。同時由于木瓜蛋白酶水解大豆分離蛋白的作用位點(diǎn)Lys和Asp殘基可以結(jié)合6分子水，所以表現(xiàn)為木瓜蛋白酶水解產(chǎn)物的保水性優(yōu)于堿性蛋白酶水解產(chǎn)物。

2.2.3 乳化性

（1）堿性蛋白酶 由圖4可知，大豆分離蛋白堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物的乳化活性及乳化穩(wěn)定性隨著反應(yīng)時間的增加逐漸降低，且一直低于大豆分離蛋白原料。大豆分離蛋白的乳化活性為7.45mL/g，乳化穩(wěn)定性為14.49min；大豆分離蛋白堿性蛋白酶酶解物在20min時乳化活性為7.73mL/g，乳化穩(wěn)定性為13.87min。

圖4 酶解時間對大豆分離蛋白堿性蛋白酶水解產(chǎn)物的乳化活性及乳化穩(wěn)定性的影響

（2）木瓜蛋白酶

圖5 酶解時間對大豆分離蛋白木瓜蛋白酶水解產(chǎn)物的乳化活性及乳化穩(wěn)定性的影響

由圖5可知，大豆分離蛋白木瓜蛋白酶水解產(chǎn)物的乳化活性和乳化穩(wěn)定性是先升高后降低，且一直高于大豆分離蛋白原料。大豆分離蛋白的乳化活性為7.45mL/g，乳化穩(wěn)定性為14.49min；大豆分離蛋白木瓜蛋白酶的水解產(chǎn)物在反應(yīng)2h時乳化活性達(dá)到最高為8.44mL/g，乳化穩(wěn)定性在反應(yīng)1h時達(dá)到最高為18.18min。

這是因?yàn)殡S著酶解的進(jìn)行，7S和11S分子斷裂成許多肽段，疏水基被暴露，使大量肽分子進(jìn)入油水界面，降低了界面張力，疏水基向里親水基向外包裹在油表面，起到了保護(hù)作用，同時由于-COO-所帶的電荷，通過靜電排斥作用阻止了油滴間聚和，提高了乳化能力。一般認(rèn)為蛋白質(zhì)

的疏水性越大，界面上吸附的蛋白質(zhì)濃度越大，界面張力越小，乳濁液因而也就更穩(wěn)定。隨著水解度的增大，對維持蛋白質(zhì)穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的氫鍵、范德華力、離子鍵等鍵破壞程度也越來越大，包裹在油滴表面的肽段越來越小，使油滴表面的保護(hù)層越來越薄，最終導(dǎo)致了乳化性的降低，也導(dǎo)致了乳化穩(wěn)定性的降低[17]。而大豆分離蛋白堿性蛋白酶水解產(chǎn)物乳化活性和乳化穩(wěn)定性隨著酶解時間的增加均不斷下降，這是由于堿性蛋白酶與木瓜蛋白酶的酶解速度和剪切位點(diǎn)不同，使得堿性蛋白酶水解大豆分離蛋白20min時乳化活性和乳化穩(wěn)定性已經(jīng)低于大豆分離蛋白。

2.2.4 吸油性

圖6 酶解時間對大豆分離蛋白酶解產(chǎn)物吸油性的影響

由圖6可知，大豆分離蛋白在堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶水解前期吸油率都略有升高，之后緩慢降低趨于平緩。大豆分離蛋白本身的吸油率為0.99g/g，大豆分離蛋白堿性蛋白酶水解產(chǎn)物在20min時達(dá)到最大值1.03g/g，木瓜蛋白酶水解產(chǎn)物在40min時達(dá)到最大值1.13g/g。這是因?yàn)槲托允怯团c疏水性基團(tuán)結(jié)合，將油包裹在大豆分離蛋白中，在水解度較低時，蛋白質(zhì)側(cè)鏈上的疏水基團(tuán)進(jìn)一步外露，致使吸油率升高。隨著水解度的增加，肽鏈不斷變小，形成包裹油的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)被破壞造成吸油率降低。

2.2.5 發(fā)泡性

圖7 酶解時間對大豆分離蛋白堿性蛋白酶水解產(chǎn)物發(fā)泡能力及發(fā)泡穩(wěn)定性的影響

（1）堿性蛋白酶 由圖7可知，隨著酶解時間的增加，大豆分離蛋白堿性蛋白酶水解產(chǎn)物的發(fā)泡膨脹率先升高后降低，且普遍高于大豆分離蛋白本身；而其發(fā)泡穩(wěn)定性逐漸下降，且普遍低于大豆分離蛋白。大豆分離蛋白的發(fā)泡膨脹率為83.33%，發(fā)泡穩(wěn)定性為47.53%；大豆分離蛋白堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物在40min時發(fā)泡膨脹率最大為145.33%；而其發(fā)泡穩(wěn)定性隨著反應(yīng)時間的進(jìn)行，由36.24%降至24.58%。

（2）木瓜蛋白酶

圖8 酶解時間對大豆分離蛋白木瓜蛋白酶水解產(chǎn)物發(fā)泡能力及發(fā)泡穩(wěn)定性的影響

由圖8可知，隨著酶解時間的增加，大豆分離蛋白木瓜蛋白酶水解產(chǎn)物的發(fā)泡膨脹率先升高后降低，且普遍高于大豆分離蛋白本身；而發(fā)泡穩(wěn)定性逐漸下降，且普遍低于大豆分離蛋白。大豆分離蛋白的發(fā)泡膨脹率為83.33%，發(fā)泡穩(wěn)定性為47.53%；大豆分離蛋白木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物在2h時發(fā)泡膨脹率最大為177.50%；其發(fā)泡穩(wěn)定性隨著反應(yīng)時間的進(jìn)行，由31.13%降至27.01%。

這是因?yàn)槊附饪纱蠓忍岣叩鞍踪|(zhì)溶液的發(fā)泡能力，從分子角度上講，形成液泡需要蛋白分子的肽鏈展開，在液面上通過各種相互作用形成一種堅韌的液膜，而酶解正好起到了這一作用，并且通過提高溶解度，使更多的肽參與進(jìn)液膜的形成，從而提高了發(fā)泡能力；但是隨著酶解的進(jìn)行，肽鏈越來越短，使液膜越來越弱，即泡沫穩(wěn)定性越來越差，最終導(dǎo)致了發(fā)泡能力的減弱。表現(xiàn)在粘度上，剛開始粘度的減小有利于泡沫的形成[18]，但當(dāng)粘度較小時，液膜非常脆弱，無法裹住氣泡，泡沫穩(wěn)定性變得非常差，從而不利于泡沫的形成。另外隨著酶解的進(jìn)行，蛋白質(zhì)分子的電荷增加，由于靜電作用阻止蛋白質(zhì)分子在氣液表面的吸附作用加強(qiáng)，也降低了發(fā)泡穩(wěn)定性。大豆分離蛋白木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶水解物發(fā)泡膨脹率變化趨勢不同，這是因?yàn)閮煞N酶的作用位點(diǎn)和相同酶解時間的水解度不同造成的。

2.2.6 粘度

圖9 酶解時間對大豆分離蛋白酶解產(chǎn)物粘度的影響

由圖9可知，木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶水解后的大豆分離蛋白的粘度均呈下降趨勢。大豆分離蛋白堿性蛋白酶水解產(chǎn)物在1～2h之間下降速度較快，由4216MPa·s降至1463MPa·s；木瓜蛋白酶水解產(chǎn)物則在40min至1h下降較快，由5728MPa·s降至4900MPa·s。大豆分離蛋白原料粘度為68014MPa·s，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于大豆分離蛋白酶堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶水解產(chǎn)物。這是由于隨著大豆分離蛋白酶解的進(jìn)行，小分子肽類增多，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)破壞，膨脹率降低，蛋白多聚體的解離和離子基團(tuán)的增加，使蛋白質(zhì)分子的有序性增加，蛋白質(zhì)的表觀體積減少，而使粘度下降。由于堿性蛋白酶水解產(chǎn)物的水解度比木瓜蛋白酶的高，所以相同時間大豆分離蛋白堿性蛋白酶水解產(chǎn)物比大豆分離蛋白酶木瓜蛋白酶水解產(chǎn)物的粘度要小。

2.2.7 凝膠性

表2 酶解時間對大豆分離蛋白酶解產(chǎn)物凝膠性的影響

由表2可知，大豆分離蛋白有良好的凝膠性，隨著酶解時間的增加大豆分離蛋白的凝膠性不斷下降，其中大豆分離蛋白堿性蛋白酶水解產(chǎn)物的變化程度更大，酶解1h后不成凝膠。這是因?yàn)樵诿附膺^程中，大豆球蛋白被酶解成小的肽鏈，同時二硫鍵和氫鍵等分子間的作用力受到破壞，使得蛋白質(zhì)分子之間很難形成穩(wěn)定的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，不利于形成凝膠，所以酶解程度增大，凝膠強(qiáng)度降低[19]。堿性蛋白酶，水解位點(diǎn)不同于木瓜蛋白酶，并且水解速度較快，使得大豆分離蛋白堿性蛋白酶水解產(chǎn)物的凝膠程度下降很快，幾乎不能成膠；而木瓜蛋白酶水解速度較慢，所以使木瓜蛋白酶水解產(chǎn)物相對于堿性蛋白酶水解產(chǎn)物凝膠程度下降的慢。

2.2.8 成膜性 由試驗(yàn)可知，大豆分離蛋白可以形成薄膜，其厚度為0.21cm，牽拉強(qiáng)度為62.204N。而經(jīng)過酶水解后的大豆分離蛋白均不能成膜。這是由于成膜性是加熱和堿處理導(dǎo)致大豆分離蛋白變性，使大豆分離蛋白中7S和11S球蛋白四級結(jié)構(gòu)破壞，亞基中多肽鏈展開拉伸成鏈狀，發(fā)生交聯(lián)而成膜。蛋白質(zhì)長鏈聚合結(jié)構(gòu)對薄膜的性質(zhì)很重要，蛋白質(zhì)交聯(lián)度越高，膜的拉伸強(qiáng)度越強(qiáng)。另外，大豆蛋白成膜機(jī)理與蛋白質(zhì)凝膠性有關(guān)，即蛋白質(zhì)受熱后聚合形成較大分子的凝膠體[20]，分子間聚合通過氫鍵、二硫鍵以及其他化學(xué)鍵聯(lián)結(jié)而成。而經(jīng)酶解后，大豆蛋白被酶解成小的肽段，鏈長變短，并且破壞了分子間的氫鍵、二硫鍵等化學(xué)鍵，致使分子間網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)難以形成，導(dǎo)致成膜失敗。

3 結(jié)論

（1）隨著酶解時間的增加，大豆分離蛋白堿性蛋白酶水解產(chǎn)物的水解度、溶解性逐漸升高，吸油性、發(fā)泡能力先升高后下降，保水性、乳化活性及乳化穩(wěn)定性、發(fā)泡穩(wěn)定性、粘度、凝膠性逐漸下降。

（2）隨著酶解時間的增加，大豆分離蛋白木瓜蛋白酶水解產(chǎn)物的水解度、溶解性逐漸升高，保水性、吸油性、乳化活性及乳化穩(wěn)定性、發(fā)泡能力先升高后下降，發(fā)泡穩(wěn)定性、粘度、凝膠性逐漸下降。

（3）隨著酶解時間的增加，大豆分離蛋白酶解后的溶解性、吸油性、發(fā)泡能力優(yōu)于大豆分離蛋白，木瓜蛋白酶水解產(chǎn)物的保水性、乳化活性及穩(wěn)定性優(yōu)于大豆分離蛋白。

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