崔人方，黃 靜，文景芝

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物保護系，哈爾濱 150030）

由大豆疫霉菌（Phytophthora sojaeKaufmann＆Gerdemann）侵染引起的大豆疫霉根腐病（Phytophthoraroot and stem rot）是最具毀滅性的大豆病害之一。該病可發(fā)生在大豆的整個生育期，病原菌侵染大豆的根、莖、葉和部分豆莢，引起根腐、莖腐、植株矮化、枯萎和死亡。在環(huán)境條件有利于病害發(fā)生的條件下可導(dǎo)致大豆絕產(chǎn)[9]。1948年在美國東北部的印第安納州首次發(fā)現(xiàn)該病，目前已傳播到世界各大豆產(chǎn)區(qū)[1]。

大豆對疫霉菌的抗性由顯性單基因控制，防治該病的主要方法就是選用抗病品種，但由于該病菌的遺傳差異極大，在美國和加拿大已有多個抗病基因被不斷產(chǎn)生的新生理小種克服[3]。一些研究表明，甲霜靈對大豆疫霉根腐病具有一定的防治效果，尤其是耐病品種輔以甲霜靈處理防病效果明顯[1]。中國雖然已經(jīng)培育出一些抗大豆疫霉菌1號生理小種的品種[4]，但由于各地大豆疫霉菌生理小種結(jié)構(gòu)不明確，而且該病菌變異率高，因此這些品種的實用性還有待研究。在目前情況下，篩選并應(yīng)用殺菌劑仍是中國防治大豆疫霉根腐病的有效方法之一。盡管已有研究人員進行過大豆疫霉根腐病藥劑篩選試驗，但主要是針對殺菌劑對菌絲生長和無性繁殖的影響，未涉及殺菌劑對越冬結(jié)構(gòu)——卵孢子形成的影響。本試驗的目的是對大豆疫霉菌進行藥劑篩選，為大豆疫霉根腐病的化學(xué)防治提供依據(jù)，也為防止甲霜靈抗藥性的產(chǎn)生篩選替代藥劑。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株 從吉林省的大豆田土壤中分離純化的大豆疫霉菌J-24。

1.1.2 供試藥劑 97%甲霜靈可濕性粉劑：溫州鹿城農(nóng)藥廠；50%烯酰嗎啉可濕性粉劑：河北威遠生物有限公司；58%甲霜靈錳鋅可濕性粉劑：深圳市瑞德豐農(nóng)藥有限公司；72%霜脲錳鋅可濕性粉劑：山東曹達化工有限公司；70%代森錳鋅可濕性粉劑：西安克勝新依達農(nóng)藥有限公司；64%惡霜錳鋅可濕性粉劑：香港泰達農(nóng)化發(fā)展公司；72%霜霉威水劑：天津漢邦；70%乙磷鋁錳鋅可濕性粉劑：山東榮邦。

1.2 試驗方法

1.2.1 供試藥劑對大豆疫霉菌菌絲生長的影響 供試菌株在普通胡蘿卜瓊脂（CA）[7]平板上25℃黑暗下培養(yǎng)6d，用打孔器從菌落邊緣打取直徑為8mm的菌碟，移至含不同濃度藥劑的CA平板中央，濃度以藥劑活性成分的有效含量計算，所有藥劑均設(shè)5個試驗濃度，其中50%烯酰嗎啉、97%甲霜靈和58%甲霜靈錳鋅設(shè)0.1μg/mL、0.5μg/mL、1.0μg/mL、5.0μg/mL和10.0μg/mL；72%霜脲錳鋅、70%代森錳鋅和64%惡霜錳鋅設(shè)5.0μg/mL、10.0μg/mL、15.0μg/mL、20.0μg/mL和25.0μg/mL；72%霜霉威和70%乙磷鋁錳鋅設(shè)1.0μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL、50.0μg/mL和100.0μg/mL。每皿接種1個菌碟，以不含藥劑的CA平板為對照，每處理重復(fù)3次。25℃黑暗條件下培養(yǎng)，6d后測量菌落直徑。作出不同藥劑的毒力回歸方程，求出EC50值。

1.2.2 供試藥劑對大豆疫霉菌孢子囊形成和萌發(fā)的影響 自培養(yǎng)6d的菌落邊緣內(nèi)側(cè)打取1塊直徑8mm的菌碟轉(zhuǎn)入滅菌空培養(yǎng)皿內(nèi)，加滅菌水至剛好沒過菌塊表面，每30min換水一次，換4次水后加入10mL不同濃度（濃度設(shè)置同1.2.1）的藥劑，以不含藥劑的滅菌水為對照，然后置25℃黑暗條件下靜止培養(yǎng)10～12h，可見大量孢子囊形成。在顯微鏡下檢測孢子囊的數(shù)量，每個菌碟隨機觀察5個視野，各處理均重復(fù)3次，計算孢子囊形成抑制率。將以上處理置4℃冰箱中10～15min后取出，每個菌碟在10×10倍鏡下隨機檢查4個視野的孢子囊總數(shù)及空殼數(shù)，計算孢子囊萌發(fā)抑制率。

1.2.3 供試藥劑對大豆疫霉菌卵孢子形成的影響 參照1.2.1的方法，在含不同濃度藥劑的CA平板上接種大豆疫霉菌，25℃黑暗條件下培養(yǎng)，30d后鏡檢，每個培養(yǎng)皿隨機觀察計測5個視野的卵孢子數(shù)量，以不含藥劑的CA平板為對照，各處理均重復(fù)3次，計算卵孢子形成抑制率。

1.2.4 供試藥劑對大豆疫霉根腐病的接種防治效果 將感病大豆品種合豐25播種于溫室的花盆中，待幼苗子葉完全展開后，每盆保留長勢一致的5株大豆苗備用。試驗設(shè)8個藥劑處理，以接菌但不施藥為對照，另設(shè)不施藥也不接菌為空白對照，每處理重復(fù)3次，每重復(fù)10株苗。試驗采用郝中娜等[6]的接種方法接種大豆疫霉菌，8個處理隨機分布。接種保濕48h后在各個處理的大豆苗上噴施相應(yīng)的藥劑（藥劑濃度見表3），然后轉(zhuǎn)入正常管理，參照蘭成忠等[8]的病害分級標準在施藥后3d、5d和7d調(diào)查發(fā)病情況，計算病情指數(shù)及防治效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試藥劑對大豆疫霉菌菌絲生長的影響

供試的8種殺菌劑對大豆疫霉菌的菌絲生長均有抑制作用。其中50%烯酰嗎啉、97%甲霜靈和58%甲霜靈錳鋅能明顯抑制菌絲生長。50%烯酰嗎啉的EC50值為0.1208μg/mL，效果最好，其次為97%甲霜靈和58%甲霜靈錳鋅，EC50值分別為0.1563μg/mL和0.3603μg/mL（見表1）。72%霜霉威在離體條件下抑菌作用很弱，在100.0μg/mL時對大豆疫霉菌的抑制率為43.2%，70%乙磷鋁錳鋅在100.0μg/mL時對大豆疫霉菌的抑制率為36.5%。

表1 8種殺菌劑對大豆疫霉菌菌絲生長的影響

2.2 供試藥劑對大豆疫霉菌孢子囊形成的影響

8種殺菌劑對大豆疫霉菌孢子囊的形成均有不同程度的抑制作用（見表2），抑制效果最好的為50%烯酰嗎啉，其次為97%甲霜靈和58%甲霜靈錳鋅，在濃度為10.0μg/mL時，對孢子囊形成的抑制率均為100%。其他5種藥劑在濃度為10.0μg/mL時，抑制率均低于30%。

2.3 供試藥劑對大豆疫霉菌孢子囊萌發(fā)的影響

8種殺菌劑對孢子囊萌發(fā)均有不同程度的抑制作用（見表2），抑制效果最好的為50%烯酰嗎啉，其次為97%甲霜靈和58%甲霜靈錳鋅，在濃度為10.0μg/mL時，對孢子囊萌發(fā)抑制率均為100%。其余5種藥劑在濃度為10.0μg/mL時，對孢子囊萌發(fā)抑制率均低于40%。

2.4 供試藥劑對大豆疫霉菌卵孢子形成的影響

8種殺菌劑對大豆疫霉菌卵孢子形成的抑制率由高到低依次為50%烯酰嗎啉、97%甲霜靈、58%甲霜靈錳鋅、72%霜脲錳鋅、70%代森錳鋅、64%惡霜錳鋅、72%霜霉威和70%乙磷鋁錳鋅。在藥劑濃度為10.0μg/mL時，50%烯酰嗎啉、97%甲霜靈和58%甲霜靈錳鋅對卵孢子形成的抑制率分別為64.5%、59.5%和55.0%（見表2），差異達極顯著水平，而其余5種藥劑對卵孢子形成的抑制率均低于30%。

2.5 供試藥劑對大豆疫霉根腐病的接種防治效果

盆栽試驗結(jié)果顯示，8種殺菌劑對大豆疫霉根腐病均有一定的防治效果（見表3）。室內(nèi)抑菌效果較好的50%烯酰嗎啉接種防治效果仍然最好，但對大豆疫霉菌菌絲生長抑制效果較好的70%代森錳鋅，接種防治效果卻最差。50%烯酰嗎啉、97%甲霜靈和58%甲霜靈錳鋅對大豆疫霉根腐病的接種防治效果優(yōu)于其他藥劑。經(jīng)方差分析，8種殺菌劑接種防治效果差異顯著。

3 結(jié)論與討論

從供試的8種殺菌劑中篩選出3種防治效果較好的殺菌劑，對大豆疫霉菌的抑制作用由高到低依次為50%烯酰嗎啉（EC50為0.1208μg/mL）、97%甲霜靈（EC50為0.1563μg/mL）和58%甲霜靈錳鋅（EC50為0.3603μg/mL），在濃度為10.0μg/mL時，對孢子囊形成和萌發(fā)的抑制率均為100%，對卵孢子形成的抑制率分別為64.5%、59.5%和55.0%?？梢钥闯鲆陨?種殺菌劑可以抑制大豆疫霉菌的菌絲生長、無性繁殖和有性生殖，作用比較全面，接種防治效果均達到60%以上，可作為防治大豆疫霉根腐病的有效藥劑在生產(chǎn)中使用。

表2 8種殺菌劑對大豆疫霉菌孢子囊形成、萌發(fā)和卵孢子形成的影響

表3 8種殺菌劑對大豆疫霉根腐病的接種防治效果

朱振東等（1999）[3]在離體條件下測定了8種內(nèi)吸性殺菌劑對大豆疫霉菌菌絲的影響，同時利用下胚軸傷口接種法測定了殺菌劑在活體條件下對大豆疫霉根腐病的防治效果，其中有5種殺菌劑與本文使用的殺菌劑相同，結(jié)果表明25%甲霜靈可濕性粉劑和58%甲霜靈錳鋅可濕性粉劑的效果較好，與本文結(jié)果一致；杜淑梅和李繼文（2001）[5]采用室內(nèi)試驗（抑菌圈法、菌絲生長速度法和藥劑對孢子囊產(chǎn)生及萌發(fā)的影響）、田間小區(qū)試驗（種子處理、葉面噴霧）以及大面積示范對比試驗對13種藥劑對大豆疫霉根腐病的防效進行了比較，結(jié)果表明58%甲霜靈錳鋅可濕性粉劑的防效最好；蘭成忠等（2007）[8]應(yīng)用室內(nèi)生測和盆栽接種防治方法評價了12種殺菌劑的藥效（其中6種殺菌劑與本文的相同），認為50%烯酰嗎啉可濕性粉劑、25%甲霜靈可濕性粉劑和58%甲霜靈錳鋅可濕性粉劑的防效較好。不同研究者的試驗結(jié)果均表明，58%甲霜靈錳鋅可濕性粉劑的防效比較好，說明其藥效穩(wěn)定，且沒有產(chǎn)生抗藥性。本文全面評價了8種代表性殺菌劑的室內(nèi)抑菌效果，尤其是首次報道了殺菌劑對病菌的越冬結(jié)構(gòu)——卵孢子形成的影響，同時還首次評價了乙磷鋁錳鋅對大豆疫霉菌的殺菌效果。

大豆疫霉根腐病為土傳病害，主要危害根部和莖基部。成株期由于葉片的遮蓋使得藥劑很難直接噴到病部，造成用藥困難，因此應(yīng)選擇一些有傳導(dǎo)作用的內(nèi)吸性殺菌劑，使藥劑可以快速到達病部，達到防病治病的效果。本文中防效較好的甲霜靈、甲霜靈錳鋅和烯酰嗎啉都有內(nèi)吸性，可以較快的達到病部。但甲霜靈具有高抗藥性風(fēng)險，許多疫霉菌已產(chǎn)生對甲霜靈的抗藥性[2]。自然條件下大豆疫霉菌便存在對甲霜靈具有高耐藥性的菌株，應(yīng)用甲霜靈防病可能會選擇到自然耐藥性菌株，導(dǎo)致抗藥性群體產(chǎn)生[3]。因此，對于那些大豆疫霉根腐病發(fā)生情況和病菌生理小種尚不明確的地點，可以選擇烯酰嗎啉和甲霜靈錳鋅進行病害防治。

［1］Schmittenner A F.Problems and progress in control ofPhytophthoraroot rot of soybean[J].Plant Disease,1985,69:362-368.

［2］王文橋,劉國容.卵菌對內(nèi)吸性殺菌劑的抗藥性及對策[J].植物病理學(xué)報,1996,26(4):294-296.

［3］朱振東,王曉鳴,田玉蘭,等.防治大豆疫霉根腐病的藥劑篩選[J].農(nóng)藥學(xué)學(xué)報,1999,1(3):39-44.

［4］朱振東,王曉鳴.大豆對疫霉根腐病抗病性鑒定方法[J].中國油料作物學(xué)報,1999,21(2):52-54.

［5］杜淑梅,李繼文.大豆疫霉根腐病藥劑防治試驗研究初報[J].大豆通報,2001(6):5-6.

［6］郝中娜,文景芝,李永剛.大豆疫霉根腐病菌單游動孢子的毒性遺傳與變異[J].植物病理學(xué)報,2003,33(4):347-352.

［7］文景芝,楊明秀,郝中娜,等.影響大豆疫霉菌Phytophthora sojae卵孢子生活力和萌發(fā)的因素[J].中國油料作物學(xué)報,2007,29(3):322-327.

［8］蘭成忠,陳慶河,趙健,等.大豆疫霉菌部分生物學(xué)特性及其藥劑篩選研究[J].植物保護,2007,33(4):92-96.

［9］宋傳玲,李麗珺,文景芝.大豆疫霉菌（Phytophthora sojae）增強型綠色熒光蛋白遺傳轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2009,40(1):9-12.