韓學(xué)哲，王東雙，安曉東，連運(yùn)河

(1.河北省天然色素工程技術(shù)研究中心，河北 邯鄲 057250；2.晨光生物科技集團(tuán)股份有限公司，河北 邯鄲 057250)

銀杏葉提取物(Ginkgo Biloba Extract)的主要含有是銀杏黃酮和內(nèi)酯兩大活性成分[1]，其中銀杏黃酮有效成分包括：銀杏雙黃酮 (gilobetin)、白果素(bilobetin)、槲皮素(quercetin)、山奈酚(kaempferol)等都具有3,3,4-三羥基結(jié)構(gòu)的物質(zhì)[2]，具有抗氧化、降血脂、抗腫瘤等方面的作用[3]。鑒于銀杏葉中黃酮具有獨(dú)特的生理作用、臨床治療和保健價(jià)值[4]，使GBE及其制劑一直為國(guó)際國(guó)內(nèi)研究開(kāi)發(fā)的熱點(diǎn)之一[5]。目前，銀杏葉中銀杏黃酮的得率不高,生產(chǎn)消耗較大,對(duì)滿足市場(chǎng)需求不利,因此，不斷探索銀杏葉中黃酮新的提取、精制工藝，提高得率，降低成本，以達(dá)到節(jié)能增效的目的,具有很現(xiàn)實(shí)的意義。本研究旨在通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究,篩選最佳工藝,提高黃酮得率,降低生產(chǎn)成本。

本文應(yīng)用循環(huán)提取工藝對(duì)銀杏葉整葉進(jìn)行提取，確定了提取溫度、提取遍數(shù)和固液比。并對(duì)銀杏黃酮精制工藝進(jìn)行了研究，進(jìn)行了大孔樹(shù)脂篩選實(shí)驗(yàn)，研究了上柱液的pH值和洗脫液對(duì)黃酮得率的影響，最終確定了最佳的銀杏黃酮的提取和精制的工藝條件。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

Agilentl200高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司)。

銀杏葉(從山東郯城收購(gòu))；乙醇(食品級(jí))，其他試劑均為分析純。槲皮素，山萘酚,異鼠李素對(duì)照品均購(gòu)于上海同田生物技術(shù)有限公司。

1.2 檢測(cè)方法[6-8]

色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，甲醇-0.4%磷酸溶液(50∶50)為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為360nm。理論塔板數(shù)按槲皮素峰計(jì)算應(yīng)不低于2500。

溶液制備：分別精密稱(chēng)取經(jīng)P2O5干燥過(guò)夜的槲皮素、山柰素、異鼠李素對(duì)照品，加甲醇制成每1mL分別含0.0299，0.0387，0.015mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。精密稱(chēng)取固體樣品0.05g，液體樣品吸取樣品2mL蒸干，將固體樣品或者液體樣品殘?jiān)蛹状?25%鹽酸溶液 (4∶1)混合液25mL溶解，移入250mL燒瓶中，回流30min，冷卻，轉(zhuǎn)移至50mL量瓶中，以甲醇定容，搖勻，濾過(guò)，即得供試品溶液。

測(cè)定法：分別精密吸取上述對(duì)照品溶液與供試品溶液，注入液相色譜儀，測(cè)定，分別計(jì)算3種黃酮苷元的含量，以下式換算成總黃酮醇苷的含量?？傸S酮醇苷含量=(槲皮素含量+山柰素含量+異鼠李素含量)×2.51。

1.3 銀杏黃酮的提取工藝過(guò)程

2 結(jié)果與討論

目前，對(duì)銀杏葉中黃酮類(lèi)化合物的提取,廣泛使用的以乙醇-水溶液(70%乙醇)和純水為浸取溶劑進(jìn)行生產(chǎn)。結(jié)果表明：1次浸取2 h，計(jì)算黃酮類(lèi)化合物的浸出率，乙醇-水體系高于水體系。綜合考慮能耗和得率成本，故本實(shí)驗(yàn)選70%乙醇作為浸取溶劑。

2.1 提取溫度對(duì)提取效果的影響

在提取固液比1∶5，提取1次，提取時(shí)間2h條件下，選取溫度 80 、70 、65 、55、45℃的條件,考察溫度對(duì)銀杏葉中總黃酮提取率的影響,不同溫度下提取結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 溫度對(duì)黃酮提取率的影響Tab.1 Effect of temperature to extraction ratio of flavone

由表1數(shù)據(jù)可以看出，溫度升高，提取率增大，當(dāng)提取溫度在65℃和70℃時(shí)，浸出率僅差0.3%，溫度再升高提取率反而有所下降。這是由于銀杏黃酮苷的分子結(jié)構(gòu)中，存在多個(gè)酚羥基，酚羥基性質(zhì)很不穩(wěn)定，在溫度較高時(shí)易被空氣氧化所致，故選擇浸取溫度65℃為宜。

2.2 提取遍數(shù)對(duì)提取效果的影響

在提取每遍固液比1∶5，提取5遍，提取時(shí)間2h條件下，考察提取遍數(shù)對(duì)銀杏葉中總黃酮提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 提取遍數(shù)對(duì)黃酮提取率的影響Tab.2 Effect of extraction times to extraction ratio of flavone

由表2數(shù)據(jù)可以看出，提取遍數(shù)增多，提取率增大，當(dāng)提取遍數(shù)在第4遍時(shí)，浸出率1.5%，第5遍和第4遍相差0.4%，提取遍數(shù)再增多浸出率沒(méi)有增長(zhǎng)太多，考慮到生產(chǎn)成本，故選擇提取遍數(shù)3遍為宜。

2.3 固液比對(duì)提取效果的影響

在提取3遍，提取時(shí)間3h，提取溫度65℃條件下，選取總固液比 1∶9，1∶15，1∶18 的條件,考察固液比對(duì)提取銀杏葉中總黃酮含量的影響,以考察提取完的渣中的含量檢測(cè)提取率，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 固液比對(duì)黃酮提取率的影響Tab.3 Effect of solid-to-liquid ratio to extraction ratio of flavone

由表3數(shù)據(jù)可以看出，總固液比增大，提取率增大，當(dāng)浸取總固液比在1∶15和1∶18時(shí)，渣中含量相差0.02%，浸出率僅差0.2%，固液比增大提取率也增長(zhǎng)不明顯，考慮到生產(chǎn)成本，因此，總固液比選擇1∶15。

2.4 溶劑逆流循環(huán)提取對(duì)提取效果的影響

由于提取過(guò)程中第2遍和第3遍的提取液遠(yuǎn)沒(méi)有達(dá)到飽和，因此，設(shè)計(jì)將溶劑逆流循環(huán)使用，固液比：第 1 遍 1∶5、第 2 遍 1∶5、第 3 遍 1∶5，將第一輪的第2遍萃取液作為第二輪的第1遍使用，第二輪的第3遍和作為第二輪第2遍，第3遍使用新溶劑，然后第二輪的第2遍萃取液作為第三輪的第1遍使用，這樣依次循環(huán)下來(lái)，保證提取溶劑每次提取溶劑都達(dá)到飽和，并且濃縮時(shí)只濃縮第1遍料液，減少了濃縮量，降低了生產(chǎn)消耗；提取溫度為65℃，時(shí)間為每遍2h。考察逆流循環(huán)提取的效果見(jiàn)表4。

表4 循環(huán)提取工藝銀杏黃酮的提取率Tab.4 Extraction ratio of flavone by extraction process cycling

由表4數(shù)據(jù)可以看出，逆流循環(huán)提取，提取溶劑能達(dá)到飽和，提取率達(dá)到非循環(huán)提取效果，并且溶劑使用量、濃縮量較非循環(huán)提取能減少三分之二。

2.5 樹(shù)脂選擇

選擇樹(shù)脂需要考察樹(shù)脂的分離效果和產(chǎn)品的含量?jī)身?xiàng)指標(biāo)才能確定樹(shù)脂的使用，因此，選擇了5種樹(shù)脂：AB-8、LX-38、D101、LXA-8、HZ-841，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 不同樹(shù)脂的產(chǎn)品含量和得率Tab.5 Content and yield of different resin production

由于目前市場(chǎng)上銀杏產(chǎn)品黃酮含量大于24%，因此，選擇D101作為下步實(shí)驗(yàn)用樹(shù)脂。

D101樹(shù)脂的動(dòng)態(tài)吸附效果見(jiàn)圖1。

圖1 D101樹(shù)脂對(duì)銀杏黃酮的動(dòng)態(tài)吸附效果Fig.1 Dynamic adsorption effect of D101 resin to ginkgetin

配銀杏黃酮濃度為3mg·mL-1的溶液，吸附流速為2BV·h-1，處理11BV的料液，每處理1BV的物料液收集一次流出液并用液相檢測(cè)銀杏黃酮的含量。從圖1中可知，3個(gè)樹(shù)脂床體積氣有泄漏，未達(dá)到飽和之前，吸附柱內(nèi)被吸附的銀杏黃酮的濃度由上至下梯度降低，因而采用串聯(lián)吸附方式，可以使樹(shù)脂的吸附性能得到最大限度的發(fā)揮利用。

2.6 上樣液pH值對(duì)D101樹(shù)脂吸附效果的影響

取一定量的原液，分別調(diào) pH 值為 4、4.5、5、5.5、6，控制流速為1BV·h-1，收集流出液并測(cè)量，以TLC板標(biāo)定終點(diǎn)，計(jì)算吸附量。見(jiàn)圖2，當(dāng)pH值為5時(shí)，樹(shù)脂的吸附能力最大。

圖2 上樣液pH值對(duì)樹(shù)脂吸附效果的影響Fig.2 Effect of pH of gel loading buffer to adsorption of resin

2.7 洗脫液對(duì)銀杏黃酮得率的影響

分別稱(chēng)取定量被銀杏黃酮飽和的D101樹(shù)脂，各加入6BV甲醇、乙醇、丙酮，靜態(tài)洗脫4h，取上清液，測(cè)定其中銀杏黃酮的濃度并換算成得率，結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 洗脫劑對(duì)黃酮得率的影響Tab.6 Effect of eluant to flavone yield

從表6中可知，甲醇和乙醇的得率相差不大，考慮到甲醇的毒性，選用乙醇作為洗脫劑。

3 結(jié)論

本文通過(guò)乙醇提取銀杏葉中銀杏黃酮，并對(duì)醇提工藝的條件進(jìn)行了優(yōu)化。最佳工藝為：提取溶劑為70%的乙醇，提取溫度65℃，固液比為1∶5，提取3遍，濃縮后調(diào)pH值為5，過(guò)D101大孔樹(shù)脂柱，乙醇解析可得到含量為24%的精制銀杏黃酮。

本研究采用了循環(huán)提取的工藝大大減少了溶劑的使用量，降低了生產(chǎn)成本，適合工業(yè)化生產(chǎn)。對(duì)提取溫度、提取次數(shù)對(duì)提取率的影響做了較為詳細(xì)的分析，對(duì)工業(yè)化生產(chǎn)有著指導(dǎo)意義。整個(gè)工藝過(guò)程操作簡(jiǎn)便，使用的溶劑對(duì)環(huán)境無(wú)污染，成本低，適合工業(yè)化生產(chǎn)。

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