宮 強(qiáng) 王帥濤 秦翠麗 牛明福 程 茗 侯玉澤 張勇法 孫曉菲

（河南科技大學(xué),洛陽(yáng) 471003）

禽多殺性巴氏桿菌OmpA DNA疫苗免疫效果的研究①

宮 強(qiáng) 王帥濤 秦翠麗 牛明福 程 茗 侯玉澤 張勇法 孫曉菲

（河南科技大學(xué),洛陽(yáng) 471003）

目的:研究禽多殺性巴氏桿菌OmpA DNA疫苗在雞體內(nèi)誘導(dǎo)的免疫保護(hù)效果。方法:PCR擴(kuò)增禽多殺性巴氏桿菌的ompa基因片段,克隆入pcDNA3.1（+）上,構(gòu)建重組質(zhì)粒pOMPA,體外轉(zhuǎn)染SP2/0細(xì)胞,RT-PCR和免疫熒光試驗(yàn)檢測(cè)目的基因的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)情況。動(dòng)物免疫共分四組:pOMPA組、弱毒疫苗組、pCDNA3.1（+）空載體組和PBS對(duì)照組,每組15只4周齡雞,除弱毒疫苗組外其他三組均肌注免疫三次,每次間隔兩周,弱毒疫苗組僅首免時(shí)肌注1羽份/每只雞。間接ELISA檢測(cè)免疫后血清特異性抗體水平,MTT法檢測(cè)免疫雞外周血淋巴細(xì)胞增殖情況,雙抗夾心ELISA檢測(cè)IFN～γ分泌情況,強(qiáng)毒攻擊,計(jì)算免疫雞存活數(shù)目及保護(hù)率。結(jié)果:體外轉(zhuǎn)染檢測(cè)結(jié)果表明pOMPA可在體外培養(yǎng)的細(xì)胞中表達(dá)目的蛋白。動(dòng)物免疫后,DNA疫苗組和弱毒疫苗組血清抗體水平持續(xù)上升,與兩對(duì)照組相比差異極顯著（P＜0.01）,且弱毒疫苗組血清抗體水平明顯高于DNA疫苗組（P＜0.05）。經(jīng)提取的外膜蛋白（Omps）誘生后,兩疫苗組的SI值極顯著高于pCDNA3.1（+）組和PBS免疫組（P＜0.01）,兩疫苗組之間則無差別。兩疫苗組免疫雞外周血淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的IFN-γ極顯著高于兩對(duì)照組（P＜0.01）。強(qiáng)毒攻擊后DNA疫苗組和弱毒疫苗組的保護(hù)率分別為60%和73.3%。結(jié)論:成功構(gòu)建了禽多殺性巴氏桿菌OmpADNA疫苗,該疫苗為動(dòng)物提供一定的免疫保護(hù)力,但不夠理想。

禽多殺性巴氏桿菌;OmpA DNA疫苗;免疫應(yīng)答;保護(hù)效果

禽霍亂亦稱為禽出血性敗血癥,是由禽多殺性巴氏桿菌病引起的多種禽類的傳染病,目前仍是威脅我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)健康發(fā)展的重大疫病之一。由于該病發(fā)病急、死亡快、治療不及時(shí)會(huì)造成家禽大量死亡,據(jù)統(tǒng)計(jì),我國(guó)每年因禽霍亂死亡的雞幾乎可達(dá)家禽疫病死亡數(shù)的50%[1]。對(duì)于該病的控制措施目前主要采用的仍是口服抗菌素類藥物,如青霉素、鏈霉素、土霉素等,但抗菌藥物長(zhǎng)期應(yīng)用易導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生耐藥性,且可能會(huì)對(duì)禽體產(chǎn)生明顯毒害作用,蛋雞用后產(chǎn)蛋率會(huì)明顯下降,從而降低了經(jīng)濟(jì)效益。因此,為防患于未然,從根本上控制本病,必須應(yīng)用有效的疫苗進(jìn)行預(yù)防。

預(yù)防禽多殺性巴氏桿菌病的疫苗主要有弱毒疫苗和滅活疫苗兩種,但禽多殺性巴氏桿菌抗原結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜,且易發(fā)生變異,導(dǎo)致弱毒疫苗的免疫效果并不理想?，F(xiàn)有的市售弱毒苗免疫期較短、保護(hù)力較低、副作用偏大,應(yīng)用不當(dāng)會(huì)引起產(chǎn)蛋雞的產(chǎn)蛋率下降甚至?xí)鹪摬〉牧餍衃2]。而滅活苗的免疫效果又弱于弱毒活疫苗,因此,研制禽霍亂新型疫苗勢(shì)在必行。新型疫苗包括重組亞單位疫苗、DNA疫苗、活載體疫苗等。自1990年Wolff發(fā)現(xiàn)DNA疫苗以來,因其具有誘導(dǎo)全面免疫應(yīng)答的能力,已成為疫苗研究領(lǐng)域的熱點(diǎn),受到了全世界的廣泛關(guān)注,被譽(yù)為第三代疫苗。人們已對(duì)多種動(dòng)物傳染病如NDV、ILT、AIV等的DNA疫苗進(jìn)行了深入研究,然而,目前針對(duì)多殺性巴氏桿菌病新型疫苗的研究主要集中在重組亞單位疫苗上,且大多針對(duì)于豬巴氏桿菌病,禽霍亂DNA疫苗的研究則相對(duì)較少[3-7]。

本研究以禽多殺性巴氏桿菌外膜蛋白之一OmpA的編碼基因構(gòu)建了相應(yīng)的DNA疫苗pOMPA,導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行了表達(dá),并通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了該疫苗的免疫保護(hù)效果,為研制新型禽霍亂疫苗提供了一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種和細(xì)胞 禽多殺性巴氏桿菌CVCC474菌株購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所;禽多殺性巴氏桿菌弱毒活疫苗為齊魯動(dòng)物保健品有限公司產(chǎn)品;大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α、SP2/0細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 1日齡雛雞購(gòu)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.3 主要試劑 真核表達(dá)載體pCDNA3.1（+）為本實(shí)驗(yàn)室保存;限制性內(nèi)切酶、連接酶為MBI公司產(chǎn)品;HRP標(biāo)記的兔抗雞IgG、FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG購(gòu)自北京希凱創(chuàng)新科技有限公司;RPMI1640液體培養(yǎng)基為Sigma公司產(chǎn)品;脂質(zhì)體2000為Invitrogen公司產(chǎn)品;雞IFN-γ檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司;MTT購(gòu)自上海華舜生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 DNA疫苗的構(gòu)建 設(shè)計(jì)合成禽多殺性巴氏桿菌ompa基因序列引物,上游含有KpnⅠ位點(diǎn),下游含BamHⅠ位點(diǎn)。以全基因組為模板,PCR擴(kuò)增該基因,回收后連接T載體,雙酶切后亞克隆到真核載體pcDNA3.1（+）的相應(yīng)位點(diǎn),構(gòu)建重組質(zhì)粒pOMPA,即OmpA-DNA 疫苗 。

1.2.2 禽巴氏桿菌外膜蛋白抗血清的制備 超聲波裂解法提取禽多殺性巴氏桿菌總外膜蛋白（Omps）[8],Bradford法測(cè)定蛋白濃度。加入礦物油乳化成疫苗免疫兔子,抗原含量為2mg/m l,每只兔注射1m l,采用背部多點(diǎn)注射,共免疫三次,每次間隔2周,采血檢測(cè)抗體效價(jià)后備用。

1.2.3 DNA疫苗的轉(zhuǎn)染及檢測(cè) 將SP2/0細(xì)胞傳代于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,待細(xì)胞密度達(dá)80%左右時(shí)取脂質(zhì)體2000和重組質(zhì)粒pOMPA在250μl細(xì)胞培養(yǎng)液中充分混勻。室溫作用20～30分鐘,加入800μl新鮮的完全培養(yǎng)液,混勻后加入細(xì)胞培養(yǎng)板中,設(shè)轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3.1（+）的細(xì)胞為陰性對(duì)照。37℃5%CO2培養(yǎng)48～72小時(shí)后收獲細(xì)胞以RT-PCR和間接免疫熒光檢測(cè)目的基因的轉(zhuǎn)錄及其表達(dá)情況。

1.2.4 動(dòng)物免疫 1日齡非免疫雛雞共60只,飼養(yǎng)至四周齡時(shí)隨機(jī)平均分為四組,即pOMPA組、pCDNA 3.1（+）組、弱毒活疫苗組及PBS對(duì)照組。重組質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)染表達(dá)后,堿裂解法大量制備質(zhì)粒pOMPA和pCDNA3.1（+）,PEG法純化,溶于1×PBS（pH 7.2）中,分光光度計(jì)測(cè)定其濃度和純度并用上述PBS調(diào)整濃度為1μg/μl,進(jìn)行動(dòng)物免疫。DNA疫苗組和空載組采用肌肉注射,每只雞200μl,PBS對(duì)照組每只肌注200μl1×PBS（pH 7.2）,各組均免疫三次,每次間隔兩周。弱毒活疫苗組僅于首免時(shí)肌注1羽份/每只雞。

1.2.5 間接ELISA試驗(yàn) 一免后每周采血,分離血清,-20℃保存待檢。以禽多殺性巴氏桿菌菌懸液為包被抗原,包被濃度為109個(gè)/ml,室溫濕盒內(nèi)包被過夜。用5%的BSA封閉后加入1∶100倍稀釋的待檢血清,37℃濕盒內(nèi)作用1.5小時(shí)后加入HRP-兔抗雞IgG作用1.5小時(shí),加入OPD暗室內(nèi)顯色10分鐘后用2mol/LH2SO4終止反應(yīng),在OD490處測(cè)定吸收值以確定免疫雞血清抗體水平,共檢測(cè)6周。

1.2.6 淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn) 各免疫組分別于一免2周、二免2周和三免2周時(shí)對(duì)免疫動(dòng)物進(jìn)行心臟采血,分離外周血淋巴細(xì)胞,細(xì)胞計(jì)數(shù)后調(diào)整濃度為1×107個(gè)/ml。96孔細(xì)胞培養(yǎng)板每孔加入50μl細(xì)胞懸液。試驗(yàn)孔和陰性對(duì)照孔各設(shè)3個(gè)重復(fù),試驗(yàn)孔每孔加入50μl 20μg/m l提取的巴氏桿菌外膜蛋白,陰性對(duì)照孔每孔加入50μl RPM I1640培養(yǎng)液,置37℃,5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng) 60小時(shí)后,每孔加入5 mg/mlMTT 10μl,繼續(xù)培養(yǎng)3小時(shí)。然后每孔加100 μl SDS-HCl,繼續(xù)作用2小時(shí)終止反應(yīng),測(cè)定OD570吸光值 ,計(jì)算 :刺激值（SI）=OD（試驗(yàn)孔）/OD（陰性對(duì)照孔）[9]。

1.2.7 IFN-γ檢測(cè) 分別于初免2、4和6周后制備濃度為1×107個(gè)/m l的外周血淋巴細(xì)胞。以O(shè)mps進(jìn)行刺激,37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)60小時(shí)后,吸取培養(yǎng)上清離心收集后-20℃保存。按照檢測(cè)試劑盒制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,對(duì)各組免疫雞分泌的IFN-γ進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.8 動(dòng)物攻毒試驗(yàn) 第三次免疫2周后,以禽多殺性巴氏桿菌強(qiáng)毒株CVCC474攻毒,攻毒劑量為5 LD50/只,觀察2周,記錄各組試驗(yàn)動(dòng)物的死亡數(shù)量,計(jì)算各疫苗組的保護(hù)率。

2 結(jié)果

2.1 體外表達(dá)結(jié)果 提取轉(zhuǎn)染有重組質(zhì)粒和空載體的細(xì)胞總RNA,進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增,結(jié)果表明,轉(zhuǎn)染了pOMPA的細(xì)胞中擴(kuò)增出了目的片段,而空載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中未擴(kuò)增出相應(yīng)片段（圖1A）,說明目的基因在該細(xì)胞中進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄。間接免疫熒光分析結(jié)果也表明,轉(zhuǎn)染了重組質(zhì)粒的細(xì)胞在倒置顯微鏡下可見到熒光出現(xiàn),而空載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中則無熒光（圖1B、C）,表明該重組質(zhì)粒在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中獲得了表達(dá)。

圖1 pOMPA轉(zhuǎn)染的RT-PCR（A）和間接免疫熒光檢測(cè)（B、C）Fig.1 The Results of RT-PCR（A）and indirect immunofluorescent test（B,C）

2.2 ELISA抗體檢測(cè)結(jié)果 以間接ELISA法對(duì)免疫后雞血清中的抗體水平進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果pOMPA組和弱毒活疫苗組抗體水平呈現(xiàn)逐漸上升趨勢(shì),與空載體和PBS對(duì)照組相比差異極為顯著（P＜0.01）,兩對(duì)照組血清抗體水平則始終維持在較低水平。DNA疫苗組雖經(jīng)3次免疫,但其檢測(cè)到的抗體水平卻仍低于弱毒活疫苗免疫組（P＜0.05,圖2）。

2.3 MTT檢測(cè)結(jié)果 分別于三次免疫后兩周時(shí),心臟采血制備免疫雞外周血淋巴細(xì)胞懸液,以禽多殺性巴氏桿菌Omps進(jìn)行刺激,MTT法檢測(cè)其增殖情況。結(jié)果初免后各組的刺激值差別不大,二免和三免后弱毒疫苗組和pOMPA組的SI值極顯著高于兩對(duì)照組（P＜0.01）,但兩疫苗組之間則幾乎無差異（P＞0.05,圖3）。

2.4 IFN-γ檢測(cè)結(jié)果 一免2、4和 6周后,采取免疫雞血,制備外周血淋巴細(xì)胞懸液,以O(shè)mps為刺激物進(jìn)行誘導(dǎo),收集上清,檢測(cè)IFN-γ的分泌量。結(jié)果如圖4,一免后各組分泌的IFN-γ雖有差別,但差異不明顯（P＞0.05）;二免和三免后DNA疫苗組和弱毒疫苗組免疫雞外周血淋巴細(xì)胞分泌的IFN-γ的量極顯著高于兩對(duì)照組（P＜0.01）,且pOMPA組的分泌量稍高于弱毒疫苗組,但兩者差別不大（P＞0.05）。

2.5 免疫保護(hù)效果檢測(cè) 免疫動(dòng)物于三免兩周后以禽多殺性巴氏桿菌強(qiáng)毒進(jìn)行攻擊,觀察兩周內(nèi)的死亡數(shù)。結(jié)果兩對(duì)照組免疫雞幾乎全部死亡,而DNA疫苗組和弱毒活疫苗組死亡雞較少,且前者死亡雞數(shù)目多于后者,結(jié)果如表1所示。

圖2 血清中抗體的動(dòng)態(tài)變化結(jié)果Fig.2 The p rofile of serum antibody

圖3 MTT試驗(yàn)結(jié)果情況（SI,±s）Fig.3 The SI value of lymphocytes proliferation from immunized chickens（SI,±s）

圖4 IFN-γ分泌情況Fig.4 The level of IFN-γsecred by peripheralblood lymphocytes from immunized chickens

表1 攻毒試驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Protection of immunized chickens against lethal challenge with avian Pasteurellamuhocida

3 討論

病原菌的外膜蛋白成分（Omps）不僅在細(xì)菌的營(yíng)養(yǎng)攝取、代謝物質(zhì)的運(yùn)輸、細(xì)菌正常形態(tài)的維持以及物質(zhì)的合成等方面起著重要的作用,而且還具有一定的免疫原性[10,11]。對(duì)其深入研究將有助于明確其在病原菌的致病和免疫過程中的作用,為研制相應(yīng)的新型疫苗奠定基礎(chǔ)。目前已有研究表明,Omps在保護(hù)禽多殺性巴氏桿菌感染方面起著重要的作用[12]。禽多殺性巴氏桿菌的外膜蛋白包括主要蛋白和微量蛋白兩種,主要蛋白包括OmpA和OmpH等。已有研究表明多殺性巴氏桿菌的OmpA抗體能夠?yàn)闄C(jī)體提供一定的保護(hù)[13],但也有研究表明OmpA蛋白雖能誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物產(chǎn)生較高水平的抗體應(yīng)答,但不能提供足夠的保護(hù)力[14]。因此,多殺性巴氏桿菌外膜蛋白A的免疫保護(hù)效果還沒定論,而且,目前還未見有OmpA DNA疫苗的研究報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)以禽多殺性巴氏桿菌全基因組為模板,擴(kuò)增了主要外膜蛋白基因ompa,并構(gòu)建了DNA疫苗pOMPA,體外轉(zhuǎn)染檢測(cè)了目的基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)情況。結(jié)果表明構(gòu)建的pOMPA可在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)目的蛋白,從而為進(jìn)一步研究該疫苗的免疫保護(hù)效果奠定了基礎(chǔ)。

抗體應(yīng)答在動(dòng)物抗多殺性巴氏桿菌感染的過程中具有重要的作用,亞單位疫苗則可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生較高水平的抗體,因此人們對(duì)此類疫苗的研究較為深入[15,16]。然而,目前已知細(xì)胞免疫應(yīng)答在抗多殺性巴氏桿菌免疫中也具有舉足輕重的作用,而DNA疫苗則可有效地誘導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)[17]。本研究同時(shí)對(duì)OmpA-DNA疫苗免疫后誘導(dǎo)的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答進(jìn)行了檢測(cè)。DNA疫苗和弱毒活疫苗免疫后均可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生較高水平的抗體,但由于試驗(yàn)所用包被用抗原為禽多殺性巴氏桿菌全菌體,其成分較為復(fù)雜,抗原之間可能會(huì)存在競(jìng)爭(zhēng)吸附,使包被于酶標(biāo)板上的各成分的含量均相對(duì)較少,故檢測(cè)到的針對(duì)于單一抗原的抗體水平不是很高,因此DNA疫苗組的抗體檢測(cè)結(jié)果低于弱毒疫苗組。若要提高OmpA-DNA疫苗的檢測(cè)效果可用提取的禽多殺性巴氏桿菌外膜蛋白Omps作為包被抗原進(jìn)行ELISA試驗(yàn)檢測(cè),或者構(gòu)建ompa基因的原核表達(dá)載體,獲得純化的重組蛋白后以其作為包被抗原進(jìn)行檢測(cè)。

MTT試驗(yàn)是檢測(cè)細(xì)胞免疫功能指標(biāo)的常用方法之一,常通過淋巴細(xì)胞對(duì)ConA刺激后的轉(zhuǎn)化的程度來衡量T淋巴細(xì)胞的應(yīng)答功能。但ConA作為一種非特異性有絲分裂原,其誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖水平較易受到環(huán)境因素的影響,因而本研究采用禽多殺性巴氏桿菌Omps為特異性刺激原,檢測(cè)經(jīng)其誘導(dǎo)后免疫雞外周血淋巴細(xì)胞的增殖水平。結(jié)果表明二免和三免后弱毒疫苗組和pOMPA組的SI值明顯高于對(duì)照組。本研究同時(shí)對(duì)疫苗免疫后誘導(dǎo)的Th1型細(xì)胞因子IFN-γ的分泌量進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果兩疫苗組均可刺激機(jī)體產(chǎn)生較高水平的IFN-γ,且兩對(duì)照組分泌的水平則很低。因此,MTT試驗(yàn)和IFN-γ檢測(cè)試驗(yàn)表明本研究構(gòu)建的pOMPA疫苗同弱毒活疫苗均可有效地誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生一定的細(xì)胞免疫應(yīng)答。動(dòng)物攻毒保護(hù)試驗(yàn)是評(píng)價(jià)疫苗保護(hù)效果的最準(zhǔn)確的指標(biāo)之一,三次免疫后以強(qiáng)毒株對(duì)免疫雞進(jìn)行攻擊,結(jié)果表明DNA疫苗可為免疫動(dòng)物提供60%的保護(hù)力,弱毒活疫苗的保護(hù)率則可達(dá)73.3%,因此,本研究構(gòu)建的禽多殺性巴氏桿菌OmpA-DNA疫苗在對(duì)抗禽霍亂方面有一定的效果,但不及傳統(tǒng)的弱毒活疫苗理想。

本研究成功構(gòu)建了禽多殺性巴氏桿菌OmpADNA疫苗pOMPA,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該疫苗可誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物產(chǎn)生一定水平的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答,并可為免疫動(dòng)物提供一定的保護(hù)力,但效果不及傳統(tǒng)弱毒活疫苗,其原因可能在于ompa基因僅為禽多殺性巴氏桿菌眾多保護(hù)性抗原基因之一,因此OmpADNA疫苗所含抗原表位不夠豐富,不能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生足以抵抗強(qiáng)毒攻擊的保護(hù)力?？蓢L試?yán)胦mpa基因與禽多殺性巴氏桿菌的其他保護(hù)性抗原基因如omph、plpb等構(gòu)建多基因融合DNA疫苗或多價(jià)聯(lián)合DNA疫苗,從而為進(jìn)一步研究禽霍亂高效新型疫苗奠定基礎(chǔ)。

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[收稿2010-09-27 修回2010-10-18]

（編輯 許四平）

The immune efficacy ofOmpA-DNA vaccine against avian pasteurella multocida

GONGQiang,WANGShuai-Tao,QINCui-Li,NIUMing-Fu,CHENGMing,HOUYu-Ze,ZHANGYong-Fa,SUNXiao-Fei.HenanUniversityofScience&Technology,Luoyang471003,China

Objective:To researchon protective immunity ofOmpA-DNA vaccine against fow l cholera in chickens.Methods:Theom pa gene fragmentamplified by PCR from avian Pasteurellamultocidawas cloned into the eukaryotic expression vector pcDNA3.1（+）,and the recombinantplasmid pOMPA was constructed.Then the recombinantp lasmidwas transfected into SP2/0 cells in vitro.The transcription and expression of targetgenewereanalyzed by RT-PCR and indirect immunofluorescence.Fourgroupsof chickensnamed pOMPA,attenuated live vaccine,pCDNA3.1（+）and PBSwere vaccinated with the DNA vaccine,attenuated live vaccine,control vector and PBS respectively.The serum antibodieswere detected by indirect ELISA.The peripheral blood lymphocyte（PBLC）p roliferation and secreted of PBLCwere tested byMTT.The immunized chickenswere challengedwith virulentof avian Pasteurellamu ltocidaon week 2 post the third immunization,and the protection ratewas counted.Results:RT-PCR and indirect immunofluorescence showed that the ompagene could be transfected into SP2/0 cells in vitro and the target proteinwas expressed.Indirect ELISA showed that the levels of antibodies in DNA vaccine group and attenuated live vaccine group weremost significantly higher than thoseof the othergroups（P＜0.01）,and thatof the former lower than thatof the latter（P＜0.05）.MTT experiments indicated that the SIvalue inducedwith avian PasteurellamultocidaOmps in the two vaccinegroupswere significantly higher than those of pCDNA3.1（+）and PBSgroups（P＜0.01）,and the two vaccines groupswere indiscriminate.The IFN-γexperiments displayed that the levels of IFN-γinduced withOmps in thegroups of pOMPA and attenuated vaccineweremostly higher than those of the control groups（P＜0.01）.The protection rate of DNA vaccineand attenuated live vaccinewere 60%and 73.3%respectively.Conclusion:TheOmpA-DNA vaccine against fow l cholerahas been constructed successfully.The DNA vaccine cou ld enhance the immunity level and the p rotectiveeffectagainst fowl cholera,but is barely satisfactory.

AvainPasteurellamuhocida;OmpA DNA vaccine;Immune response;Protective effect

S855.1

A

1000-484X（2011）05-0454-05

10.3969/j.issn.1000-484X.2011.05.017

①本文為河南省重點(diǎn)科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目（092102110162）

宮 強(qiáng)（1979年-）,男,博士,主要從事獸醫(yī)分子生物學(xué)與免疫學(xué)研究,E-mail:qianggong79@yahoo.com.cn。