曹 麗 顧學(xué)文 張?zhí)煲?汪 驊 （揚(yáng)州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院,揚(yáng)州 225001）

人參皂甙對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞活性的影響及其作用機(jī)制初步探討

曹 麗 顧學(xué)文①?gòu)執(zhí)煲虎谕?驊 （揚(yáng)州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院,揚(yáng)州 225001）

目的:觀察人參皂甙（GS）對(duì)巨噬細(xì)胞的免疫激活作用,探討GS活化巨噬細(xì)胞及免疫調(diào)節(jié)機(jī)制。方法:在體外培養(yǎng)的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中加入不同濃度的GS后,觀察巨噬細(xì)胞一氧化氮（NO）合成及MTT比色法檢測(cè)活化后的巨噬細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷活性的影響;掃描電子顯微鏡（SEM）觀察巨噬細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)改變;激光掃描共聚焦顯微鏡（LSCM）觀察巨噬細(xì)胞表面組織相容性復(fù)合體Ⅱ（MHCⅡ）的變化;以特異性熒光探針Fluo-3/AM負(fù)載細(xì)胞,應(yīng)用LSCM檢測(cè)巨噬細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度。結(jié)果:小鼠腹腔巨噬細(xì)胞經(jīng)GS作用后,細(xì)胞形態(tài)發(fā)生活化性改變,殺瘤活性增強(qiáng),細(xì)胞表面MHCⅡ表達(dá)增加并增強(qiáng)對(duì)H 22細(xì)胞殺傷活性;GS作用細(xì)胞4小時(shí)后,25～200mg/LGS細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高,并與藥物濃度呈正相關(guān)。結(jié)論:GS在體外能激活小鼠巨噬細(xì)胞,促進(jìn)其發(fā)揮免疫防御功能,其免疫調(diào)節(jié)機(jī)制可能與細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高有關(guān)。

人參皂甙;巨噬細(xì)胞;一氧化氮;鈣

人參皂甙（Ginsenoside,GS）是傳統(tǒng)中藥人參的主要有效成分之一,對(duì)神經(jīng)、內(nèi)分泌、免疫、心血管等系統(tǒng)有廣泛的生物學(xué)活性作用[1]。研究表明,GS可提高機(jī)體免疫功能和抗腫瘤能力[2-4],但其作用機(jī)制尚待深入研究。本實(shí)驗(yàn)觀察GS對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的活性及腫瘤細(xì)胞的影響,探討GS激活巨噬細(xì)胞后發(fā)揮殺瘤作用時(shí)與細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度變化的關(guān)系,從細(xì)胞分子水平研究GS的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制,為GS的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及儀器 一氧化氮檢測(cè)（酶法）試劑盒（晶美生物工程北京有限公司）;四甲基偶氮唑鹽（MTT）（Sigma）;Fluo-3 acetoxymethyl ester（Fluo-3/AM,Molecular probe）;清潔級(jí)小鼠（南通大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心）;H22肝癌細(xì)胞株（中國(guó)科學(xué)院上海藥物研究所）;GS（南通大學(xué)航海醫(yī)學(xué)研究所）;激光共聚焦掃描顯微鏡（TCS-SP2 Leica.Germany）;掃描電子顯微鏡（S-3400N HITACHI.Japan）。

1.2 細(xì)胞制備及培養(yǎng) 按文獻(xiàn)[5]方法進(jìn)行細(xì)胞制備,將所得細(xì)胞用含10%滅活小牛血清的RPM I-1640培養(yǎng)液配成密度為1×106ml-1的細(xì)胞懸液,加入培養(yǎng)板進(jìn)行培養(yǎng)?？捎妹庖呓M織化學(xué)法,經(jīng)CD68標(biāo)記細(xì)胞來(lái)證實(shí),臺(tái)盼藍(lán)染色證實(shí)活細(xì)胞數(shù)＞95%。

1.3 MTT測(cè)定 將收集所得Mφ配成1×106m l-1的細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板,培養(yǎng)24小時(shí)后,分別添加GS至所需濃度（終濃度分別為 25、50、100、200mg/L,每個(gè)濃度重復(fù)3孔,獨(dú)立重復(fù)3次,以不加藥物組作為陰性對(duì)照）,孵育24小時(shí)后用完全培養(yǎng)基洗細(xì)胞一次,作為效應(yīng)細(xì)胞。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期H22肝癌細(xì)胞為靶細(xì)胞,用RPMI1640培養(yǎng)液配成1×105ml-1懸液。按效靶比10∶1接種于96孔培養(yǎng)板。另設(shè)單獨(dú)靶細(xì)胞和單獨(dú)效應(yīng)細(xì)胞組,用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔570 nm波長(zhǎng)的光密度（OD）值,計(jì)算PMφ殺傷活性[6]。

1.4 腹腔巨噬細(xì)胞釋放一氧化氮量的檢測(cè) 按一氧化氮試劑盒說(shuō)明書(shū)操作,測(cè)定NO釋放量。

1.5 SEM觀察 PMφ超微結(jié)構(gòu) 收集經(jīng)100mg/L GS作用 20小時(shí)的 PMφ,經(jīng)浸洗,固定,再浸洗,后固、漂洗、乙醇梯度脫水,樣品室干燥,離子濺射鍍膜,SEM觀察。

1.6 巨噬細(xì)胞MHCⅡ表達(dá) 將PMφ以1×106m l-1濃度培養(yǎng)2小時(shí)后,用D-Hanks液洗去未貼壁細(xì)胞,然后分組培養(yǎng):25、50、100mg/LGS誘導(dǎo)培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組（不加藥物）。20小時(shí)后浸洗3次,75%乙醇室溫固定30分鐘,浸洗3次,5%BSA（牛血清白蛋白）封閉,滴加入生物素-抗小鼠MHC-Ⅱ分子抗體（1∶500稀釋?zhuān)?4℃過(guò)夜,浸洗3次,滴加入量子點(diǎn)（QDs）-親和素（Rock land公司）（1∶4）標(biāo)記的生物素（本室合成）室溫下染色 20～30分鐘,浸洗3次,無(wú)熒光甘油封片劑封片,LSCM觀察熒光強(qiáng)度及分布特點(diǎn)。

1.7 細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的檢測(cè) 將巨噬細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板培養(yǎng)24小時(shí)后,再將對(duì)照組（不加藥物）、GS 給藥組（25、50、100、200 mg/L）培養(yǎng)4小時(shí),用HEPES緩沖液洗3次,加入用HEPES緩沖液稀釋的Fluo-3/AM 0.1m l,37℃孵育45分鐘,HEPES洗3次,再加入HEPES 0.1 m l,37℃孵育30分鐘后置LSCM下觀察,各組均以同一參數(shù)迅速掃描3個(gè)不同的視野,從各視野中隨機(jī)選取20個(gè)細(xì)胞,計(jì)算60個(gè)細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度用于統(tǒng)計(jì)學(xué)分析（熒光強(qiáng)度數(shù)據(jù)為L(zhǎng)eica confocal software軟件對(duì)掃描圖像進(jìn)行處理所得）。

2 結(jié)果

2.1 腹腔巨噬細(xì)胞體外殺瘤活性 隨GS作用濃度的增加,殺瘤活性不斷增強(qiáng),各濃度組與對(duì)照組差異顯著（P＜0.01）,25mg/L組與50mg/L之間差異無(wú)顯著（P＞0.05）,其余各濃度組之間差異顯著（P＜0.05）,見(jiàn)表 1。

2.2 腹腔巨噬細(xì)胞一氧化氮釋放量 隨GS作用濃度的增加,NO釋放量依次增加,各濃度組與對(duì)照組差異顯著（P＜0.01）,各濃度組之間差異均顯著（P＜0.05）,見(jiàn)表1。

2.3 SEM觀察巨噬細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)

2.3.1 對(duì)照組 PMφ細(xì)胞呈圓形,形態(tài)規(guī)則,表面突起少（圖1A）。

2.3.2 GS（100 mg/L）誘導(dǎo)組 PMφ呈不規(guī)則形,細(xì)胞表面布滿(mǎn)不規(guī)則微絨毛,還有一些較長(zhǎng)的偽足,向四周伸出（圖1B）。

2.4 腹腔巨噬細(xì)胞MHCⅡ的表達(dá)

2.4.1 PMφ的MHCⅡ陽(yáng)性表達(dá)率的變化 對(duì)照組PMφ的MHCⅡ陽(yáng)性表達(dá)率為（18.60±3.16）%,GS不同濃度（25、50和100mg/L）PMφ的MHCⅡ陽(yáng)性表達(dá)率分別為（35.74±1.73）%、（48.63±1.05）%和（65.45±3.42）%,隨GS作用濃度的升高,PMφ的MHCⅡ陽(yáng)性表達(dá)率逐漸升高,與對(duì)照組存在顯著差異（P＜0.01）,各組間相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 腹腔巨噬細(xì)胞殺傷活性及一氧化氮釋放量（±s,n=3）Tab.1 Release of of NO and killer activity of PMφ（±s,n=3）

表1 腹腔巨噬細(xì)胞殺傷活性及一氧化氮釋放量（±s,n=3）Tab.1 Release of of NO and killer activity of PMφ（±s,n=3）

Note:Compared with controlgroup,1）P＜0.01.

GS concentration（mg/L）Kill probability（%）Release ofofNO（mol/L）24.60±5.06 335.60±5.68 25 38.86±1.561） 416.10±7.211）50 42.19±2.791） 448.20±2.351）100 68.55±4.411） 510.11±11.301）200 79.62±5.951） 578.10±6.201）0

圖1 SEM下觀察GS誘導(dǎo)的PMφ超微結(jié)構(gòu)Fig.1 The observation of ultram icrostructure changes of PMφ by SEM

圖2 PMφMHCⅡ分子表達(dá)強(qiáng)度及分布Fig.2 The expression of cell surface MHCⅡ

表2 巨噬細(xì)胞內(nèi)Ca2+熒光強(qiáng)度Tab.2 The fluorescence intensity of intercellular calcium in PMφ

圖3 巨噬細(xì)胞內(nèi)鈣離子熒光強(qiáng)度Fig.3 The fluorescence intensity of intercellular calcium in PMφ

2.4.2 PMφ的MHCⅡ表達(dá)強(qiáng)度及分布變化 經(jīng)480 nm波長(zhǎng)激發(fā),量子點(diǎn)標(biāo)記的MHCⅡ分子發(fā)綠色熒光,對(duì)照組PMφ上MHCⅡ分子熒光多呈點(diǎn)狀、顆粒狀零星分布于細(xì)胞膜和胞質(zhì),熒光強(qiáng)度弱（圖2A）;經(jīng)50mg/LGS誘導(dǎo)的PMφ上MHCⅡ分子熒光以較大顆粒樣,呈串珠狀沿胞膜排列,有的呈塊狀分布于胞膜和胞質(zhì)（圖 2B）;經(jīng)100mg/L GS誘導(dǎo)的PMφ上MHCⅡ分子呈強(qiáng)熒光物質(zhì)沿包膜均勻、連續(xù)地環(huán)狀分布,并向胞質(zhì)內(nèi)均勻延伸,甚至覆蓋整個(gè)細(xì)胞（圖2C）。

2.5 細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的檢測(cè) LSCM觀察結(jié)果可見(jiàn)隨著GS濃度升高,細(xì)胞的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。結(jié)果見(jiàn)表2、圖3。25mg/L組增加不明顯,與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）,其余GS組與對(duì)照組差異顯著（P＜0.01）。

3 討論

GS是人參諸多組份中主要的有效成分。人參對(duì)免疫系統(tǒng)的影響已有許多研究,但有關(guān)GS對(duì)巨噬細(xì)胞的影響所知甚少。巨噬細(xì)胞是機(jī)體中分布廣泛并具有十分活躍的生物學(xué)功能的細(xì)胞,在啟動(dòng)及協(xié)調(diào)免疫應(yīng)答等方面有著重要作用[7]。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)在體外GS對(duì)小鼠PMφ有直接激活作用,激活的PMφ細(xì)胞毒作用增強(qiáng)。經(jīng)GS刺激20小時(shí)的PMφ,對(duì)H22腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒作用明顯增強(qiáng),從50、100到200 mg/L組殺傷活性呈緩慢上升趨勢(shì),到200 mg/L組殺瘤率達(dá)79.62%。本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn),經(jīng)GS作用的PMφ,NO分泌水平增加呈劑量依賴(lài)性。NO是一種高活性和不穩(wěn)定的自由基,是活化的PMφ殺滅腫瘤細(xì)胞及病原微生物的主要效應(yīng)分子之一。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示GS增強(qiáng)PMφ細(xì)胞毒作用可能與NO有關(guān)。

巨噬細(xì)胞激活后,誘導(dǎo)表面受體表達(dá),促進(jìn)殺傷靶細(xì)胞,同時(shí)活化巨噬細(xì)胞分泌的TNF能誘導(dǎo)靶細(xì)胞發(fā)生凋亡[8]。本研究以GS（100mg/L）刺激巨噬細(xì)胞20小時(shí)后,掃描電鏡觀察超微結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)經(jīng)GS處理的巨噬細(xì)胞與對(duì)照組細(xì)胞相比,細(xì)胞處于極度活躍狀態(tài):細(xì)胞呈不規(guī)則形,表面布滿(mǎn)不規(guī)則微絨毛,還有一些較長(zhǎng)的偽足,向四周伸出,進(jìn)一步說(shuō)明GS對(duì)巨噬細(xì)胞有激活作用。

MHCⅡ類(lèi)抗原是巨噬細(xì)胞發(fā)揮抗原遞呈作用的關(guān)鍵性效應(yīng)分子,巨噬細(xì)胞表達(dá)MHCⅡ類(lèi)抗原受多種外來(lái)信號(hào)的調(diào)節(jié),只有活化的巨噬細(xì)胞才表達(dá)MHCⅡ類(lèi)抗原,具備抗原遞呈功能[9]。本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)GS處理后小鼠PMφ的MHCⅡ的表達(dá)增強(qiáng),此結(jié)果與抗原遞呈分子MHCⅡ在未激活的抗原遞呈細(xì)胞上固有低表達(dá),與激活后高表達(dá)的既往研究報(bào)道相符[10]。結(jié)果表明,GS能增強(qiáng)PMφ抗原遞呈能力,與GS的抗腫瘤作用和調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能密切相關(guān)。

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,體外培養(yǎng)的小鼠PMφ經(jīng)GS作用后,細(xì)胞毒作用增強(qiáng),NO分泌水平增加,MHC-Ⅱ的表達(dá)增強(qiáng)。Kim等[11]研究表明,脂多糖誘導(dǎo)PMφ表達(dá)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase,iNOS）mRNA的表達(dá),并誘導(dǎo)PMφNO的產(chǎn)生與細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度有關(guān)。因此,我們推測(cè)GS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞活化也可能與Ca2+濃度有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)GS能激活PMφ而起到免疫增強(qiáng)、殺瘤滅菌的作用;同時(shí)用LSCM觀察發(fā)現(xiàn)受GS誘導(dǎo)后的PMφ內(nèi)Ca2+濃度顯著增加,且呈劑量依賴(lài)性。細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度的變化是細(xì)胞生理功能的重要物質(zhì)基礎(chǔ),胞內(nèi)游離Ca2+水平的調(diào)節(jié)是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。GS的作用機(jī)制可能是通過(guò)增加Mφ內(nèi)Ca2+濃度的途徑影響細(xì)胞的信息轉(zhuǎn)導(dǎo),從而激活巨噬細(xì)胞,發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)的作用。

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[收稿2010-12-04 修回2011-02-14]

（編輯 許四平）

Effects of ginsenoside on activity ofm ice peritokinealmacrophage and initial study on mechanism of its function

CAOLi,GUXue-Wen,ZHANGTian-Yi,WANGHua.ClinicalMedicalCollegeofYangzhouUniversity,Yangzhou225001,China

Objective:To study effects of Ginsenoside on activity ofmacrophage in vitro and further investigate themechanism of Ginsenoside onmaorophage activation and immunomodulation.Methods:By adding different concentrations of GS into cultured mice peritoneal macrophage in vitro,the influenceofGSon the synthesis ofnitrooxide（NO）and killer activity of tumorcellswereobserved.Themorphological changes ofmacrophagewere viewed by Scan Electron Microscope.The exp ression of cell surface MHC-Ⅱwas measured by Laser Scanning ConfocalMicroscope（LSCM）.The cellwas loaded with specificity fluorescent probe Fluo-3/AM.The intercellular calcium concentration and changesweremeasured by LSCM.Results:GS significantly increased NO synthesis,enhanced the effects ofmouse peritonealmacrophages on killing carcinoma cells and MHC-Ⅱ molecule expression were found to be increased.With 25-200mg·L-1GS exposure for 4 h,intercellular calcium concentration was increased,and revealed a positive correlation between the increaseofCa2+and the concentrationofGS.Conclusion:GS can activatemice peritonealmacrophage in vitro,and contribute to its immunomodulatory function.Themechanism of immunomodulatory effectmay be related to the increaseof intracellular Ca2+inmicemacrophage.

Ginsenoside;Peritonealmacrophage;Nitro oxide;Ca2+

R392.12

A

1000-484X（2011）05-0423-04

10.3969/j.issn.1000-484X.2011.05.009

①通訊作者,E-mail:yzgxw@yahoo.com.cn

②南通大學(xué)神經(jīng)再生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,南通226001

曹 麗（1978年-）,女,碩士,住院醫(yī)師,主要從事免疫和腫瘤病理研究。

·神經(jīng)內(nèi)分泌與免疫·