曾 星 李彩霞 黃 羽 張國偉 張 嫻 楊 明 （廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院,廣州 510006）

豬苓及豬苓多糖對膀胱癌模型大鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬和表面免疫相關(guān)分子表達(dá)的影響①

曾 星 李彩霞②黃 羽 張國偉 張 嫻 楊 明 （廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院,廣州 510006）

目的:觀察豬苓及豬苓多糖（PPS）對BBN加糖精誘導(dǎo)的膀胱癌大鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬功能、體外NO釋放及共刺激分子和表面分子表達(dá)的影響。方法:實驗分為空白對照組、模型組、PPS組和豬苓高中低劑量共6組。用流式細(xì)胞術(shù)檢測膀胱癌大鼠腹腔巨噬細(xì)胞的熒光微球吞噬率、TLR4/CD14、CD86、CD40的表達(dá)。Griess試劑盒檢測并分析豬苓及PPS對腹腔巨噬細(xì)胞體外NO釋放的影響。結(jié)果:PPS組與模型組比較,PPS顯著促進(jìn)巨噬細(xì)胞吞噬率的增加、NO釋放的比值均降低、巨噬細(xì)胞表面分子TLR4/CD14、CD86、CD40的表達(dá)均顯著升高（P＜0.05）。不同濃度豬苓組與模型組比較巨噬細(xì)胞吞噬率增加、NO釋放的比值均降低（P＜0.05）,巨噬細(xì)胞表面分子CD86表達(dá)增加。低濃度豬苓組巨噬細(xì)胞CD40表達(dá)百分率顯著升高（P＜0.05）;但TLR4/CD14的表達(dá)無明顯變化;中、高劑量豬苓組TLR4/CD14的表達(dá)百分率與模型組比較則降低（P＜0.05）,CD40的表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)差異。結(jié)論:PPS可顯著促進(jìn)膀胱癌大鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬功能和表面免疫相關(guān)分子的表達(dá),但豬苓組對巨噬細(xì)胞功能的影響因劑量不同而表現(xiàn)出不同結(jié)果,可能與豬苓諸多成分同時作用或各成分作用的靶點不同有關(guān)。

豬苓;豬苓多糖;膀胱癌;腹腔巨噬細(xì)胞

膀胱癌是我國泌尿系統(tǒng)常見的腫瘤,也是治療費(fèi)用最為昂貴的腫瘤之一,探索治療膀胱癌的有效價廉的方法已是臨床需要解決的實際問題[1,2]。中醫(yī)藥在防治膀胱腫瘤方面,有其自身的特色,應(yīng)用含豬苓復(fù)方及單味豬苓治膀胱癌已有臨床應(yīng)用報道[3],但作用機(jī)制不明,本研究以BBN誘導(dǎo)的膀胱癌模型大鼠腹腔巨噬細(xì)胞為研究對象探討豬苓及其主要成分豬苓多糖的免疫調(diào)節(jié)作用,為中藥的開發(fā)應(yīng)用提供理論和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 雌性Fisher344大鼠,7周齡,購于北京維通利華實驗動物有限公司;豬苓顆粒,購于江陰天江藥業(yè)有限公司,每克相當(dāng)于10克生藥,用前按劑量溶于生理鹽水;豬苓多糖,購于廣東華南藥業(yè)集團(tuán)有限公司,用前按劑量溶于生理鹽水;BBN購于日本TCI株式會社;糖精,購于上海第六制藥廠;3μm的熒光微球,購于美國貝克曼庫爾特公司;Griess試劑盒,購于美國 PROMEGA公司;CD14-FITC、CD86-FITC、CD40-PE購于美國eBioscience公司;TLR4-PE購于美國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 動物模型制作及實驗分組 實驗用雌性F344大鼠60只,從實驗開始到第8周給予含0.05%BBN的飲用水,第8周后加含5%糖精繼續(xù)喂養(yǎng)至第20周止,從第9周開始給予豬苓及豬苓多糖干預(yù),給予劑量為1ml/100 g至實驗結(jié)束。實驗分為6組即生理鹽水組（Control）,模型組（BBN）,豬苓多糖（130mg/kg）組（PPS+BBN）,豬苓50 mg/kg組（L+ZL）,豬苓250mg/kg組（M+ZL）,豬苓500mg/kg組（H+ZL）,每組10只。

1.2.2 腹腔巨噬細(xì)胞的采集 采集腹腔巨噬細(xì)胞,接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。輕輕吸棄培養(yǎng)液后,再用 RPMI1640完全培養(yǎng)液洗去未貼壁細(xì)胞,貼壁細(xì)胞即為巨噬細(xì)胞。分別獲取對照組及豬苓高中低劑量組各組存活動物的腹腔巨噬細(xì)胞用于流式細(xì)胞術(shù)檢測。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測巨噬細(xì)胞吞噬功能 將

1.2.2獲取的腹腔巨噬細(xì)胞,加入直徑為3μm成人血清包被的熒光微球,37℃水浴孵育2小時后,PBS洗,上機(jī)檢測巨噬細(xì)胞吞噬熒光微球情況。

1.2.4 腹腔巨噬細(xì)胞體外NO釋放 將1.2.2獲取的腹腔巨噬細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度為5×108L-1。每孔200μl細(xì)胞懸液接種于96孔板,加入終質(zhì)量濃度為10mg/L的LPS刺激24小時,收集培養(yǎng)巨噬細(xì)胞上清液,按Griess試劑說明書進(jìn)行檢測巨噬細(xì)胞NO分泌情況,用Ratio=LPS（+）/LPS（-）表示藥物對巨噬細(xì)胞NO釋放的影響。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測腹腔巨噬細(xì)胞TLRs以及相關(guān)免疫分子的表達(dá) 將1.2.2獲取的腹腔巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)入試管中,用PBS洗細(xì)胞2次,調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106ml-1,按照實驗分組分別加入以下熒光標(biāo)記抗 體:CD86-FITC、TLR4-PE/CD14-FITC、CD40-PE/CD14-FITC及CD11/18-FITC抗體。室溫孵育20分鐘,加300μl PBS重懸細(xì)胞后,同時設(shè)立相應(yīng)的同型對照,上流式細(xì)胞儀檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 全部數(shù)據(jù)用SPSS11.0分析,n為樣本數(shù),數(shù)據(jù)用±s表示,組間數(shù)據(jù)比較用單因素方差分析,P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 膀胱癌模型制作和豬苓及豬苓多糖干預(yù) 膀胱癌診斷分類依據(jù)2004年WHO標(biāo)準(zhǔn)[4],實驗中對照組存活10只大鼠,無一例成瘤;模型組存活9只,其中膀胱癌8只,不典型增生1只;豬苓多糖組存活7只,膀胱癌4 只;豬苓 50 mg/kg、250mg/kg、500 mg/kg三組存活大鼠分別為10只、9只和10只,其中膀胱癌分別為2只、3只和1只。

2.2 豬苓及豬苓多糖對腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能和體外NO釋放的影響 模型組與空白對照組之間比較,巨噬細(xì)胞吞噬率明顯降低（P＜0.05）。PPS組與模型組比較,顯著促進(jìn)巨噬細(xì)胞吞噬率的增加,具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。不同濃度豬苓組與模型組比較巨噬細(xì)胞吞噬率增加,有一定的濃度梯度依賴性,但無顯著性差異,（結(jié)果見表1,圖1）。模型組腹腔巨噬細(xì)胞NO釋放的比值LPS（+）/LPS（-）與空白對照組比較明顯升高（P＜0.05）,而PPS組與模型組比較則顯著降低（P＜0.05）,不同濃度豬苓組與模型組比較NO釋放的比值均顯著降低（P＜0.05）,具有一定濃度梯度依賴,其中低濃度豬苓組降低尤為顯著（結(jié)果見表1,圖2）。

2.3 豬苓和豬苓多糖對腹腔巨噬細(xì)胞TLR4/CD14、CD86、CD40表達(dá)的影響 模型組與空白對照組之間比較,腹腔巨噬細(xì)胞TLR4/CD14的表達(dá)升高,但無顯著性差異（P＞0.05）。共刺激分子CD86、CD40均顯著降低（P＜0.05）。PPS組與模型組比較,腹腔巨噬細(xì)胞TLR4/CD14的表達(dá)顯著升高（P＜0.05）。低劑量豬苓組TLR4/CD14的表達(dá)百分率與模型組無顯著性差異（P＞0.05）。中、高劑量豬苓組TLR4/CD14的表達(dá)百分率與模型組比較則顯著降低（P＜0.05,結(jié)果見表1、圖3）。PPS組及不同濃度的豬苓組與模型組比較,巨噬細(xì)胞表面共刺激分子CD86均顯著升高（P＜0.05,結(jié)果見表1、圖4）,其中以PPS組尤其顯著,豬苓組CD86的表達(dá)百分率有一定梯度依賴。PPS組與低濃度豬苓組巨噬細(xì)胞CD40表達(dá)百分率顯著升高（P＜0.05）;而豬苓組中劑量和高劑量組CD40的表達(dá)百分率與模型組比較無統(tǒng)計學(xué)差異（結(jié)果見表1,圖5）。

表1 豬苓及豬苓多糖對腹腔巨噬細(xì)胞吞噬率、NO釋放及其表面分子表達(dá)的影響Tab.1 Influence of Polyporus umbellatus and PPSon the phagocytosis,NO production ofperitonealmacrophage in vitro and theexp ression of surfacemarkers of peritonealmacrophages

圖2 豬苓及豬苓多糖對腹腔巨噬細(xì)胞體外NO釋放的影響Fig.2 Influence of Polyporus umbellatus and PPS on NO production of peritonealmacrophage in vitro

圖3 腹腔巨噬細(xì)胞TLR4/CD14的表達(dá)Fig.3 The expression of TLR4/CD14 on peritonealmacrophage

圖4 腹腔巨噬細(xì)胞CD86的表達(dá)Fig.4 The expression of CD86 on peritonealmacrophage

圖5 腹腔巨噬細(xì)胞CD40/CD14的表達(dá)Fig.5 The expression of CD40/CD14 on peritonealmacrophage

3 討論

巨噬細(xì)胞是免疫系統(tǒng)中一類具有防御和調(diào)節(jié)功能的細(xì)胞,這類細(xì)胞也可通過呈遞抗原和分泌各種細(xì)胞因子來進(jìn)行免疫調(diào)節(jié),在抗腫瘤免疫方面起著重要的作用。多糖作為一種免疫調(diào)節(jié)劑,能刺激機(jī)體的各種免疫活性細(xì)胞的成熟、分化和繁殖,多糖抗腫瘤的機(jī)制也被認(rèn)為與巨噬細(xì)胞參與的機(jī)體免疫功能提高有關(guān)。研究表明,枸杞多糖可上調(diào)腹腔巨噬細(xì)胞CD40、CD80和CD86[5]。馬齒莧多糖能顯著增強(qiáng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞功能,增加小鼠巨噬細(xì)胞數(shù)量[6]。本動物實驗結(jié)果顯示,實驗中對照組存活9只大鼠,無一例成瘤,而模型組存活9只,病理診斷膀胱癌8只,不典型增生1只,BBN誘導(dǎo)大鼠膀胱癌動物模型制作成功。豬苓多糖組存活7只,膀胱癌4只 ;豬苓 50mg/kg 組 、250mg/kg 組 、500mg/kg 三組存活大鼠分別為10只、9只和10只,其中診斷膀胱癌分別為2只、3只和1只。豬苓多糖及豬苓對BBN誘導(dǎo)大鼠膀胱癌具有一定的預(yù)防作用,其作用機(jī)制與豬苓多糖及豬苓提高機(jī)體的免疫功能具有一定的關(guān)系。但是豬苓多糖組成活動物數(shù)較豬苓組減少2～3只,可能與研究中觀察到的豬苓多糖組大鼠體重較豬苓組下降以及只有豬苓多糖組血肌酐清除率明顯增加有關(guān),差異顯著性有統(tǒng)計學(xué)意義。其原因可能是豬苓多糖本身對實驗大鼠具有一定的腎毒性作用或所用豬苓多糖為市場購買品種,與藥品批次質(zhì)量有關(guān)。而豬苓由許多成分組成,各組成成分之間具有協(xié)同或拮抗作用,也是應(yīng)用復(fù)方中藥副作用少的原因之一。本研究取各實驗組動物腹腔巨噬細(xì)胞,觀察其吞噬和免疫功能。結(jié)果表明,PPS組模型組比較,顯著促進(jìn)巨噬細(xì)胞吞噬率的增加。不同濃度豬苓之間比較有一定的濃度梯度依賴性,與模型組比較巨噬細(xì)胞吞噬率增加。脂多糖（LPS）是巨噬細(xì)胞（Mφ）激活釋放大量一氧化氮（NO）及TNF-α的強(qiáng)激活劑,當(dāng)然巨噬細(xì)胞過度激活損傷組織細(xì)胞也是主要的致病分子。本研究結(jié)果顯示,模型組腹腔巨噬細(xì)胞NO釋放的比值LPS（+）/LPS（-）與空白對照組比較明顯升高（P＜0.05）,而PPS組與模型組比較則顯著降低（P＜0.05）,不同濃度豬苓組與模型組比較NO釋放的比值均顯著降低（P＜0.05）,其中低濃度豬苓組降低尤為顯著。說明豬苓及豬苓多糖對LPS誘導(dǎo)的腹腔巨噬細(xì)胞NO的釋放具有抑制作用,提示豬苓及豬苓多糖對在體外加入LPS后過度激活巨噬細(xì)胞時或LPS介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用,PPS具有免疫抑制或細(xì)胞保護(hù)作用。而本實驗結(jié)果顯示,PPS能顯著提高腹腔巨噬細(xì)胞TLR4/CD14的表達(dá),陽性細(xì)胞百分比達(dá)到53.35±12.34,但是豬苓組無明顯上調(diào)TLR4/CD14的表達(dá),與豬苓中除豬苓多糖之外的組成成分抑制或調(diào)節(jié)有關(guān),也說明豬苓多糖是通過TLR4激活腹腔巨噬細(xì)胞,促進(jìn)其發(fā)揮吞噬和免疫調(diào)節(jié)功能。

中藥多糖對T細(xì)胞的活化、增殖、分化、細(xì)胞因子的分泌等不同環(huán)節(jié)顯示不同的促進(jìn)作用。在參與T細(xì)胞激活的諸多協(xié)同刺激分子中,最重要的是T細(xì)胞表面CD28分子與APC表面相應(yīng)配體CD80和CD86的結(jié)合[7]。本研究表明,模型組與空白對照組之間比較,腹腔巨噬細(xì)胞表面共刺激分子CD86顯著降低（P＜0.05）。PPS組及不同濃度的豬苓組與模型組比較,巨噬細(xì)胞表面共刺激分子CD86顯著升高（P＜0.05）,其中以PPS組尤其顯著,豬苓組CD86的表達(dá)百分率有一定梯度依賴,表明豬苓及豬苓多糖都可通過增加腹腔巨噬細(xì)胞共刺激分子CD86的表達(dá),為T淋巴細(xì)胞活化提供第二信號,有利于活化T淋巴細(xì)胞,從而增強(qiáng)機(jī)體的免疫應(yīng)答。CD40與其配體CD40L也是免疫細(xì)胞間重要的信號傳導(dǎo)通路[8],研究認(rèn)為[3],CD40/CD40L主要是通過促進(jìn)巨噬細(xì)胞等APC細(xì)胞表達(dá)CD80和CD86等共刺激分子來發(fā)揮其作用的。首先,當(dāng)APC細(xì)胞接受外來抗原,并經(jīng)過加工將其提呈給天然T淋巴細(xì)胞時,T細(xì)胞活化并表達(dá)CD40L。高表達(dá)的CD40L與APC細(xì)胞表面的CD40結(jié)合促進(jìn)APC細(xì)胞表達(dá)CD80、CD86等共刺激分子及粘附分子的表達(dá),這些分子再與T細(xì)胞表面的配體CD28、CTLA-4結(jié)合,形成對T細(xì)胞刺激的第二信號,從而使T細(xì)胞進(jìn)一步活化,放大免疫應(yīng)答。本實驗中結(jié)果表明,PPS可誘導(dǎo)腹腔巨噬細(xì)胞CD40的表達(dá),促進(jìn)巨噬細(xì)胞表達(dá)CD86共刺激分子的表達(dá),從而擴(kuò)大免疫應(yīng)答。低劑量豬苓組可刺激巨噬細(xì)胞CD40的表達(dá),同PPS組結(jié)果平行,而豬苓中劑量和高劑量組則不能有效誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞CD40的表達(dá),可能與豬苓中的復(fù)雜成分的抑制作用有關(guān),豬苓組成成分的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制還有待進(jìn)一步深入研究。

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[收稿2011-01-24 修回2011-02-14]

（編輯 倪 鵬）

Effectsof Polyporus umbellatus and Polyporus Polysaccharide on the phagocytosis function and costimulatory molecules expression of peritoneal macrophages in rat bladder cancer

ZENGXing,LICai-Xia,HUANGYu,ZHANGGuo-Wei,ZHANGXian,YANGMing.TheSecondAffiliatedHospital,GuangzhouUniversityofChineseMedicine,Guangzhou510006,China

Objective:To observe the effects of Polyporus umbellatus and Polyporus polysaccharide（PPS）on the phagocytic function,NO release,and costimu latorymoleculesexpression of peritonealmacrophagesin BBN-induced ratbladder cancer.Methods:Six groupsincluding blank control group,modelgroup,PPSgroup,high-dose Polyporus group,m iddle-dose Polyporus group and low-dose Polyporus group were set up in this study.The phagocytosis and theexpression of surfacemarkerswere detected by flow cytometer（FCM）.Nitric oxide（NO）production in peritonealmacrophages supernatantswas determ ined by usingGriess reagent.Results:Phagocytosisofmacrophages,and the percentages of TLR4/CD14,CD86,CD40 in peritonealmacrophages of PPSgroupwas significantly higher than those ofmodel group,while NO releasewas lower（P＜0.05）.Compared tomodelgroup,Phagocytosis ofmacrophages and the percentages ofCD86 in peritonealmacrophagesof thegroups treatedwith different dose of Polyporus significantly increased,while NO release significantly decreased（P＜0.05）.After treatmentwith lowdose Polyporus,CD40 exp ression of macrophages increased,while TLR4/CD14 expression had no change.TLR4/CD14 expression of macrophages decreased after being treated withmiddle-dose Polyporus or high-dose Polyporus,while CD40 expression had no had no change.Conclusion:PPS can promote phagocytic function,expression of costimu latorymolecules of peritonealmacrophages in BBN-induced bladder cancer rats.Polyporus has differentoreven contracteffects on function ofmacrophageswhen using of different dosage,and these effectsmay be the consequences of complex components of Polyporusacting on different targets.

Polyporus umbellatus;Polyporus polysaccharide（PPS）;Bladder cancer;Peritonealmacrophages

R285.5

A

1000-484X（2011）05-0414-05

10.3969/j.issn.1000-484X.2011.05.007

①本文為國家自然科學(xué)基金項目（30873426）、教育部高等學(xué)校博士學(xué)科點專項科研基金資助項目（200805720010）和廣東省科技計劃（2010B030700059）

②同時供職于廣州中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,廣州510006

曾 星（1959年-）,女,研究員,博士生導(dǎo)師,主要從事中藥藥理研究,E-mail:zengxing-china@163.com。