丁 紅 閔 睿 王宗謙 （中國醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院腎內(nèi)科,沈陽 110032）

IL-1β對大鼠腹膜間皮細(xì)胞葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白1表達(dá)的影響①

丁 紅 閔 睿 王宗謙②（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院腎內(nèi)科,沈陽 110032）

目的:研究白介素1β（Interleukin-1beta,IL-1β）對原代培養(yǎng)大鼠腹膜間皮細(xì)胞（PMCs）葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白 1（GLUT1）表達(dá)的影響,為防治腹透失超濾提供理論依據(jù)及方法。方法:胰蛋白酶消化法進(jìn)行雄性Wistar大鼠PMCs的原代培養(yǎng)及傳代,不同濃度 IL-1β（0、1、10、50 ng/ml）作用不同時間（0、1、12、24、48 小時）,逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測 GLUT1 的 mRNA 表達(dá),Western blot檢測GLUT1蛋白的表達(dá),生化分析儀檢測培養(yǎng)液內(nèi)葡萄糖濃度的變化,以培養(yǎng)液內(nèi)葡萄糖的減少量作為細(xì)胞對葡萄糖的凈利用。結(jié)果:IL-1β以濃度及時間依賴方式促進(jìn)GLUT1mRNA及蛋白的表達(dá)（P＜0.05）,同時伴有葡萄糖向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運的增加,50 ng/ml IL-1刺激48小時后GLUT1mRNA表達(dá)與對照組相比增加了近4倍（P＜0.01）。結(jié)論:IL-1β可以使PMCs細(xì)胞GLUT-1表達(dá)和葡萄糖攝取增加,這為防治腹透相關(guān)腹膜纖維化及腹透失超濾提供了線索。

IL-1β;葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白1;腹膜間皮細(xì)胞

長期接受腹膜透析（Peritoneal dialysis,PD）的患者,慢性腹膜炎癥及高糖透析液對腹膜的損傷是導(dǎo)致腹膜纖維化,PD失敗的兩個重要原因,而二者間的關(guān)系尚不清楚。近年來研究表明,易化擴(kuò)散性葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白1（Glucose transorter 1,GLUT1）是介導(dǎo)腹膜間皮細(xì)胞葡萄糖攝取的主要轉(zhuǎn)運蛋白,高濃度葡萄糖透析液可使其表達(dá)及功能狀態(tài)異常,導(dǎo)致腹膜間皮細(xì)胞的糖攝入及代謝紊亂,從而引起其損傷。本實驗應(yīng)用炎癥因子白介素1β（Interleukin-1beta,IL-1β）對體外培養(yǎng)的大鼠腹膜間皮細(xì)胞（Peritoneal mesothelial cells,PMCs）GLUT1表達(dá)的影響,以進(jìn)一步探討PD腹膜損傷的發(fā)生機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 PMCs的原代培養(yǎng)及鑒定 雄性Wistar大鼠,6周,（224±17）克,無菌取鼠大網(wǎng)膜,0.125%胰蛋白酶、0.01%EDTA 37℃消化20分鐘,胎牛血清（FBS）終止消化,4℃,800 r/min,離心5分鐘,用含10%FBS的M199生長液（華美生物有限公司）重懸細(xì)胞,接種于25 cm2涂有鼠尾膠原的培養(yǎng)瓶,37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育,當(dāng)細(xì)胞融合達(dá)80%時傳代。當(dāng)二代細(xì)胞融合至90%時,行細(xì)胞角蛋白（Sigma公司）免疫組化染色,倒置顯微鏡觀察、鑒定。

1.2 實驗分組 二代細(xì)胞融合達(dá) 80%時,加入維持液（2%FBS的M 199）培養(yǎng)24小時后進(jìn)入實驗階段。加入處理因素IL-1β（Sigma公司）,分為以下幾部分 :①IL-1β不同濃度0、1、10、50 ng/ml分別作用PMCs 24 小時,②IL-1β（50 ng/m l）作用 0、1、12、24、48小時,每組設(shè)3個復(fù)孔。

1.3 GLUT1mRNA檢測 按照Trizol說明書在6孔板中提取總RNA,經(jīng)紫外分光光度計鑒定,各組260 nm/280 nm吸光度（A）為1.5～1.9,表明所提取的 RNA純度高,根據(jù)260 nm A比值計算RNA濃度。取總RNA 2μg作逆轉(zhuǎn)錄,按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明操作（TaKaRa公司）。取1μl逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板,GLUT1、β-actin同等條件擴(kuò)增。引物由上海生工生物工程有限公司合成,各引物設(shè)計見表1,反應(yīng)參數(shù)如下:預(yù)變性94℃5分鐘,變性94℃45秒,退火58℃45秒,延伸 72℃60秒,β-actin 24個循環(huán),GLUT1 32個循環(huán),最后72℃延伸10分鐘。將等體積PCR產(chǎn)物置于2%瓊脂糖凝膠電泳,溴化乙錠（EB）染色,在UVP凝膠成像系統(tǒng)中掃描觀察結(jié)果、拍照,并計算GLUT1與β-actin灰度值比率。

1.4 GLUT1蛋白檢測 取各組細(xì)胞,PBS洗2遍,加入SDS細(xì)胞裂解液,收獲蛋白質(zhì)。取適量的蛋白質(zhì)標(biāo)本,10%丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝膠上電泳,電壓60 V 30分鐘,80 V 90分鐘。室溫恒壓100 V維持60分鐘。麗春紅染色硝酸素纖維膜,觀察蛋白轉(zhuǎn)移結(jié)果。TBST洗膜:室溫下10分鐘。5%脫脂奶粉阻斷:室溫下輕搖60分鐘。TBST洗膜:室溫下10分鐘×3次?？乖贵w免疫反應(yīng)加入5%脫脂奶粉稀釋的GLUT1（SantaCruz公司,Sc-7903）或GAPDH（Sigma公司）抗體孵育:4℃搖床輕搖過夜。TBST洗膜:室溫下10分鐘×3次,分別與HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育1小時,TBST洗膜,室溫下10分鐘×3次。顯影、檢測ECL發(fā)光。于凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行目的蛋白及內(nèi)參照GAPDH條帶灰度分析。

1.5 葡萄糖濃度測定 生化分析儀檢測培養(yǎng)液內(nèi)的葡萄糖濃度,以培養(yǎng)液內(nèi)葡萄糖（Glu）濃度下降程度代表PMCs對葡萄糖的轉(zhuǎn)運量。

表1 PCR引物設(shè)計Tab.1 PCR primer design

2 結(jié)果

2.1 PMCs細(xì)胞的鑒定 光鏡下培養(yǎng)的腹膜間皮細(xì)胞初呈梭形,約1周后細(xì)胞可達(dá)融合,此時細(xì)胞呈多邊形,形成鋪路石樣外觀。免疫組化染色分析發(fā)現(xiàn)細(xì)胞角蛋白抗原陽性（圖1）,第Ⅷ因子相關(guān)抗原陰性。

2.2 IL-1β作用不同時間對PMCs細(xì)胞GLUT1 mRNA表達(dá)的影響 IL-1β（50 ng/m l）作用PMCs不同時間,RT-PCR方法檢測GLUT1mRNA的表達(dá),可見隨著時間延長,GLUT1mRNA表達(dá)明顯增加,呈時間依賴性（*.P＜0.01）,48小時后GLUT1mRNA增加4倍（圖2）。

圖1 免疫組化染色細(xì)胞角蛋白（×10）Fig.1 Immunolhistochem istry stain for cell keratin（×10）

圖2 IL-1β作用不同時間對PM Cs細(xì)胞GLUT1mRNA表達(dá)的影響Fig.2 The effect of IL-1βon GLUT1mRNA in PM Cs for different time Note:*.P＜0.01.

2.3 不同濃度IL-1β對PMCs細(xì)胞GLUT1mRNA表達(dá)及葡萄糖轉(zhuǎn)運的影響 不同濃度 IL-1β（0、1、10、50 ng/m l）作用PMCs 24小時后,RT-PCR方法檢測GLUT1mRNA表達(dá),可見隨著IL-1β濃度增加GLUT1 mRNA表達(dá)明顯增加,IL-1β濃度為50 ng/ml時,GLUT1mRNA水平較對照組增加2.5倍（*.P＜0.05,**.P＜0.01,圖3）,同時伴有葡萄糖向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運的增加（P＜0.05,表2）。

圖3 不同濃度IL-1β對PMCs細(xì)胞GLUT1mRNA表達(dá)的影響Fig.3 The effect of different dose IL-1βon GLUT1 mRNAPMCs

表2 不同濃度IL-1β對PMCs轉(zhuǎn)運葡萄糖量的影響（±s）Tab.2 The effect of different dose IL-1βon glucose transportation in PMCs（±s）

表2 不同濃度IL-1β對PMCs轉(zhuǎn)運葡萄糖量的影響（±s）Tab.2 The effect of different dose IL-1βon glucose transportation in PMCs（±s）

Note:Oneway ANOVA compared between groups P＜0.01;compared with control group,1）P＜0.05;2）P＜0.01.

Group Control IL-1（1 ng/m l）IL-1（10 ng/m l）IL-1（50 ng/ml）Glu（mmol/L）2.21±0.61 2.89±0.81 3.31±1.021）3.94±1.232）

圖4 IL-1β對PMCs細(xì)胞GLUT1蛋白表達(dá)的影響Fig.4 The effect of IL-1βon GLUT1 protein in PM Cs

2.4 IL-1β對PMCs細(xì)胞GLUT1蛋白表達(dá)的影響Western blot結(jié)果表明IL-1β（50 ng/ml）以時間依賴方式促進(jìn)PMCs表達(dá)GLUT1蛋白,24小時后GLUT1蛋白表達(dá)已明顯增加（圖4A）。隨著IL-1β濃度增加GLUT1蛋白表達(dá)增加,IL-1β濃度為50 ng/m l時,GLUT1蛋白水平較對照組明顯增加（圖4）。

3 討論

無論有無細(xì)菌感染,非生理性腹膜透析液均可使腹膜產(chǎn)生慢性炎癥,腹膜組織細(xì)胞釋放大量IL-1、IL-6、TNF-α等炎癥介質(zhì)、細(xì)胞因子[1]。研究表明IL-1可誘導(dǎo)腹膜TGF-β表達(dá)上調(diào),促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的積聚及間皮下毛細(xì)血管的增生,從而促進(jìn)腹膜纖維化的形成[2]。葡萄糖是腹膜透析液主要的溶質(zhì),近年來的研究證實腹膜透析液中非生理濃度的高糖是導(dǎo)致PMCs損傷的主要因素,高糖可引起PMCs上E-鈣粘素、β-catenin表達(dá)下降,細(xì)胞間粘附破壞,微絲骨架解體,從而導(dǎo)致細(xì)胞損傷,高糖在PMCs內(nèi)異常代謝所產(chǎn)生的糖基化終產(chǎn)物（AGEs）或葡萄糖降解產(chǎn)物可促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的分泌、沉積,最終導(dǎo)致腹膜纖維化[3]。

高糖所致細(xì)胞損傷、代謝紊亂,細(xì)胞內(nèi)糖攝入過多是啟動因素,葡萄糖必須借助葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)才能發(fā)揮其毒性作用,葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白分為易化擴(kuò)散性葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白和鈉依賴性葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白,后者需要消耗能量轉(zhuǎn)運葡萄糖。研究發(fā)現(xiàn)易化擴(kuò)散性葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白1（GLUT1）是介導(dǎo)PMCs葡萄糖攝取的主要載體[4],作者的研究表明高糖可激活PMCs上GLUT1蛋白的表達(dá),GLUT1表達(dá)上調(diào)或者活性增加使細(xì)胞對葡萄糖攝取過多,造成細(xì)胞內(nèi)糖負(fù)荷過重和糖代謝紊亂,從而導(dǎo)致PMCs的損傷[5]。

Galardo等[6]報道IL-1可刺激大鼠精子支持細(xì)胞GLUT1的表達(dá),同時葡萄糖轉(zhuǎn)運增加。IL-1亦可促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞對葡萄糖的攝取,給予GLUT1特異性抑制劑-松胞菌素B,則關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞對葡萄糖的攝入下降了95%[7]。本研究表明IL-1以時間、濃度依賴方式促進(jìn)GLUT1 mRNA及蛋白的表達(dá),50 ng/m l IL-1刺激48小時后GLUT1mRNA表達(dá)與對照組相比增加了近4倍（P＜0.01）,同時伴有葡萄糖向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運的增加。因此表明炎癥介質(zhì)可通過上調(diào)PMCsGLUT1的表達(dá),使腹透液中葡萄糖快速吸收,滲透梯度維持時間縮短,導(dǎo)致超濾效能下降,另一方面GLUT1表達(dá)增加會使細(xì)胞內(nèi)葡萄糖蓄積,誘發(fā)細(xì)胞的糖代謝紊亂,進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞損傷、細(xì)胞外基質(zhì)沉積,加重腹膜炎癥。關(guān)于IL-1對GLUT1的作用機(jī)制,目前認(rèn)為IL-1主要是通過PKC（蛋白激酶C）及P38信號途徑促進(jìn)GLUT1的表達(dá),給予PKC及P38抑制劑均可部分阻斷IL-1對關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞GLUT1的誘導(dǎo),而給予JNK及ERK的抑制劑則無此阻斷作用[8]。

綜上所述,腹膜炎炎癥介子可通過對GLUT1的作用加劇高糖透析液對腹膜的損傷,通過阻斷GLUT1的表達(dá)可能有助于預(yù)防和治療PD腹膜纖維化的發(fā)生,改善PD的治療效果。

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[收稿2011-03-20 修回2011-04-06]

（編輯 倪 鵬）

Effects of IL-1βon glucose transporter 1 expression in cultured rat peritoneal mesothelial cells

DINGHong,MINRui,WANGZong-Qian.DepartmentofNephrology,theForthAffiliatedHospital,ChinaMedicalUniversity,Shenyang110032,China

Objective:In order toavoid peritomum injury and to improve the efficiency of peritoneal dialysis during the dialysis.Theeffectof interleukin-1beta（IL-1β）on glucose transporter1（GLUT1）expression was investigated in cultured rat peritonealmesothelial cells（PMCs）.Methods:PMCs thathad been harvested from maleWistar rats by Enzymatic disaggregationwere cultivated in different concentrations IL-1β（0,1,10,50 ng/ml）for 0,1,12,24,48 h.The expression of GLUT1m RNA and protein were respectively evaluated by revers transcription polymerase chain reaction（RT-PCR）and western blot.Glucose concentrationswereexamined by biochem istry analyzer.Results:IL-1βinduced theexpression ofGLUT1mRNA and protein in dose-and time-dependentmanner.Theglucoseabsorption of PMCsincreased also（P＜0.05）.Comparewith the control group,IL-1βat concentration of 50 ng/ml for 48 h could increase the expression of GLUT1 mRNA 4 times（P＜0.01）.Conclusion:IL-1βcan up-regulate theexp ression of GLUT1 and netglucoseutilization of PMCs.This showed us a clue to prevention the ultrafiltration failure of peritoneal dialysis in peritonitis.

IL-1β;Glucose transporter1;Peritonealmesothelial cells

R692.5

A

1000-484X（2011）05-0400-04

10.3969/j.issn.1000-484X.2011.05.004

①本文為遼寧省教育廳科技項目（2008845）和沈陽市科技局科技項目（1053125-1-55）

②通訊作者,E-mail:zqw1813@163.com

丁 紅（1971年-）,女,在讀博士,主治醫(yī)師,主要從事腹透相關(guān)胸膜纖維化機(jī)制的研究,E-mail:dinghong9209@126.com。

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