鐘玉霞 葛 睿 吳麗媛 戴 鈺 張學(xué)軍 （天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫教研室,天津 300070）

·分子與細胞免疫學(xué)·

CD24分子調(diào)節(jié)百日咳毒素誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷的實驗研究①

鐘玉霞 葛 睿 吳麗媛 戴 鈺 張學(xué)軍 （天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫教研室,天津 300070）

目的:探討CD24分子對百日咳毒素誘導(dǎo)急性肝損傷的影響及其可能的分子機制。方法:建立百日咳毒素誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷的實驗?zāi)Ｐ?觀察anti-CD24中和抗體（200μg/mouse）和百日咳毒素（200 ng/mouse）聯(lián)合注射組小鼠的生存率,H&E染色觀察小鼠肝組織損傷,血清化學(xué)方法檢測小鼠谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）等肝功能的生化指標(biāo),ELISA方法檢測小鼠血清中TNF-α的含量,流式細胞儀分析anti-CD24中和抗體對百日咳毒素誘導(dǎo)小鼠kupffer細胞（存在于肝臟中的巨噬細胞,KC）凋亡率的影響。結(jié)果:一定劑量的anti-CD24中和抗體和百日咳毒素聯(lián)合注射組（實驗組）生存率顯著低于對照組;H&E染色觀察實驗組小鼠肝出血程度明顯高于對照組,實驗組小鼠ALT、AST等肝功能生化指標(biāo)顯著高于對照組（P＜0.05）;ELISA檢測實驗組小鼠血清中TNF-α明顯升高（P＜0.05）;流式細胞術(shù)分析表明:anti-CD24中和抗體導(dǎo)致小鼠kupffer細胞壞死百分數(shù)增加。結(jié)論:CD24分子抑制百日咳毒素誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷。

CD24分子;百日咳毒素;急性肝損傷;枯否氏細胞

CD24分子發(fā)現(xiàn)于1978年,最初命名為熱穩(wěn)定抗原。CD24分子能夠提供協(xié)同刺激信號,使抗原特異性T細胞活化。臨床上,CD24分子與系統(tǒng)性紅斑狼瘡,風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等多種自身免疫性疾病的發(fā)生密切相關(guān)[1-3]。實驗證明:CD24敲除鼠能夠抑制實驗性自身免疫性腦脊髓炎（EAE）的發(fā)生[4]。

百日咳毒素（Pertussis toxin,簡稱PTX）是由百日咳桿菌所產(chǎn)生的一種毒力蛋白,是一種原生型A-B結(jié)構(gòu)毒素,由一個酶活性A原體結(jié)合一個B寡聚物組成[5,6]。A原體是單一的多肽,稱作S1亞單位,具有腺苷二磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶的活性,能催化G蛋白的α亞基ADP-核糖基化,降低GTP與G蛋白α亞基的結(jié)合水平,導(dǎo)致α亞基不能活化,從而阻斷了受體對腺苷環(huán)化酶的抑制作用。B寡聚物是由S2-S4和S3-S4二聚體和一個S5連接物組成的五聚體,它的功能是通過結(jié)合細胞受體,使毒素接近靶細胞。百日咳毒素可以作為佐劑誘導(dǎo)實驗性自身免疫病[7]。

本實驗在百日咳毒素誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷模型的基礎(chǔ)上,通過觀察anti-CD24中和抗體對該模型的影響,揭示CD24分子在小鼠急性肝損傷中的調(diào)節(jié)作用并對可能的分子機理進行初步探討。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 百日咳毒素（List Biological Laboratories,產(chǎn)品編號:180）;Anti-CD24中和抗體（本實驗室純化的單克隆抗體）。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物模型的建立 C57BL/6小鼠購置于本校實驗動物中心。每組6～8周齡同性別小鼠各5只,聯(lián)合注射組尾靜脈注射200 ng百日咳毒素,同時腹腔注射200μg的anti-CD24中和抗體,其它組只注射同等劑量的百日咳毒素、anti-CD24中和抗體或百日咳毒素聯(lián)合注射同型抗體。注射后每小時觀察小鼠的體征。12小時后殺鼠,取肝臟、脾臟等器官。

1.2.2 血清收集 眼緣采集小鼠血液,無菌收集于1.5m l離心管,室溫放置1～2小時,待血液凝固后轉(zhuǎn)入4℃過夜,使血清充分析出,11 000 r/min常溫離心10分鐘分離血清,-70℃低溫冰箱保存。再行小鼠肝功能檢測。

1.2.3 H&E染色 按照實驗時間取出小鼠肝臟等器官,10%福爾馬林的PBS溶液固定,5μmol/L組織切片,按常規(guī)進行H&E染色。

1.2.4 ELISA方法檢測小鼠血清中TNF-α的含量血清保存方法同上,ELISA試劑盒購置于eBioscience公司（貨號:88-7324-22）,實驗操作按照試劑盒的說明書進行。在Bio-Rad450酶標(biāo)儀上測定450 nm,參照波長為570 nm,通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算細胞因子含量,所有樣品采用復(fù)孔。

1.2.5 小鼠kupffer細胞分離方法 由肝門靜脈預(yù)灌注PBS后分離小鼠肝臟,放入5m l限血清DMEM培養(yǎng)液的6 cm平皿中搗碎（內(nèi)含0.1mg/m l膠原酶Ⅳ,Sigma公司,Cat.No.C7926和2μg/ml的DNaseⅠ,NEB 公司,Cat.No.M0303）,37℃孵育 30分鐘,0.5%FBSDMEM重懸細胞,100μmol/L的strainer過濾一次,25%percoll和50%percoll 4℃,20分鐘不連續(xù)密度梯度離心,吸取含kupffer細胞的液相,37℃5%CO2孵育2小時,用預(yù)溫的培養(yǎng)液除去非貼壁細胞,流式細胞儀分析其純度（F4/80+）大于95%時用于后面的實驗。

1.2.6 流式細胞儀分析 分別收集PTX和anti-CD24中和抗體刺激的小鼠kupffer細胞,冷PBS洗1遍,1×106細胞/ml重懸,加入FITC標(biāo)記的抗小鼠CD11b（ebioscience,產(chǎn)品編號:11-0112-82）,冰上孵育30分鐘后,1×annexin-binding buffer重懸細胞,Annexin V-APC抗體和7-AAD標(biāo)記15分鐘后,再加入400μl1×annexin-binding buffer,流式細胞儀檢測（FACS Calibur,BD公司）,Flow jo7.5軟件分析實驗結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 Anti-CD24中和抗體明顯增加百日咳毒素誘導(dǎo)的小鼠死亡率 實驗中我們發(fā)現(xiàn):百日咳毒素和anti-CD24中和抗體聯(lián)合注射組的小鼠在4～8小時內(nèi)小鼠有50%以上的致死率,能存活的小鼠也表現(xiàn)為呼吸急促、反應(yīng)遲緩;而同等劑量單獨對照組毒素、抗體對照組和百日咳毒素聯(lián)合同型抗體注射組小鼠表現(xiàn)無明顯異常反應(yīng)（見圖1）。

2.2 Anti-CD24中和抗體加重百日咳毒素誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷 H&E染色觀察小鼠的肝組織發(fā)現(xiàn):聯(lián)合注射組小鼠肝出血顯著,單純毒素注射組出血程度較輕,注射PBS的空白對照組無出血現(xiàn)象（圖2A）。肝功能指標(biāo)如ALT、AST等聯(lián)合注射組顯著高于單純毒素注射組,P＜0.02,見圖2B。

圖1 Anti-CD24抗體降低百日咳毒素誘導(dǎo)的急性肝損傷小鼠生存率Fig.1 Anti-CD24 down-regulated survival ofm ice which pertussis toxin-induced acute liver injury

圖2 小鼠肝組織及肝功能指標(biāo)檢測Fig.2 Detection of liver histology and function induced by pertussis toxin with or without anti-CD24 antibodies

圖3 TNF-α在小鼠血清中的表達Fig.3 TNF-αexp ression in m ice serum

2.3 Anti-CD24中和抗體對百日咳毒素誘導(dǎo)的小鼠免疫細胞的可能影響 ELISA檢測發(fā)現(xiàn):聯(lián)合注射組小鼠血清中TNF-α表達顯著高于對照組,提示小鼠炎癥反應(yīng)加?。▓D3）。由于單核-巨噬細胞是機體內(nèi)TNF-α的主要來源,而我們在應(yīng)用Rag1-/-小鼠所做的相同實驗發(fā)現(xiàn),缺少T/B細胞沒有導(dǎo)致小鼠死亡率發(fā)生改變。這提示我們:百日咳毒素所引起的小鼠急性肝損傷可能主要涉及肝臟中固有免疫,而與適應(yīng)性免疫無關(guān)。因此,我們進一步觀察 anti-CD24中和抗體聯(lián)合百日咳毒素對小鼠肝臟中kupffer細胞的影響,流式細胞術(shù)分析表明:單純毒素處理組（2.07%）和anti-CD24（2.39%）處理組早期細胞凋亡率高于對照組（1.44%）;而毒素和anti-CD24聯(lián)合處理組的巨噬細胞壞死的百分數(shù)為37.5%,明顯高于其它3組（圖4）。

圖4 Anti-CD24抗體增加百日咳毒素誘導(dǎo)的小鼠kup ffer細胞壞死Fig.4 Anti-CD24 antibodies increased pertussis toxin-induced kupffer cell death

3 討論

肝臟是機體有毒物質(zhì)代謝的重要器官,能夠接受來自體循環(huán)和腸道來的血液。血液內(nèi)含有的抗原,如細菌、病毒成分,在肝竇部位將通過kupffer細胞清除或提呈,肝內(nèi)的其它固有免疫細胞如:樹突狀細胞、自然殺傷（NK）細胞和自然殺傷T（NKT）細胞以及肝竇內(nèi)皮細胞、位于內(nèi)皮下層的星形細胞和肝實質(zhì)細胞等也可能作為抗原提呈細胞提呈血液中的抗原[8]。盡管細菌毒素誘導(dǎo)的急性肝損傷的分子機理尚不清楚,但目前看,人們公認的引起急性肝損傷機制主要包括細菌及其衍生物直接誘導(dǎo)肝細胞損傷和不良免疫反應(yīng)介導(dǎo)的肝損傷兩個方面:一方面,病原體及其衍生物能夠與肝細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、脂類和核酸等生物大分子相互作用,導(dǎo)致蛋白質(zhì)功能障礙、脂質(zhì)過氧化、DNA損傷和氧化應(yīng)激,或者引起細胞內(nèi)離子梯度和鈣庫紊亂,細胞線粒體功能障礙和能源損失,導(dǎo)致肝細胞死亡和肝功能衰竭;另一方面,肝細胞功能障礙和細胞死亡釋放特定信號,活化機體的免疫系統(tǒng),特別是固有免疫細胞,包括kupffer細胞,NK細胞和NKT細胞,這些細胞不僅通過產(chǎn)生炎性因子（如TNF-α、IL-1β等）加劇肝損傷,而且還能通過分泌的趨化因子招募炎性細胞到肝臟部位,啟動機體的固有免疫反應(yīng)[9,10]。

我們在實驗中發(fā)現(xiàn):當(dāng)一定劑量的百日咳毒素聯(lián)合anti-CD24中和抗體同時注射給野生型C57/B6小鼠后,小鼠在4～8小時內(nèi)有50%以上的致死率。其病理表現(xiàn)為肝出血,谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶等肝生化指標(biāo)異常升高;聯(lián)合注射組小鼠血清中TNF-α明顯高于對照組,提示機體炎癥反應(yīng)加劇。鑒于巨噬細胞是機體內(nèi)TNF-α的主要來源之一,而我們在應(yīng)用Rag1-/-小鼠所做的相同實驗發(fā)現(xiàn):百日咳毒素與anti-CD24中和抗體聯(lián)合注射組致死率、肝生化指標(biāo)和機體炎癥因子表達與WT小鼠所得實驗結(jié)果基本相同（實驗數(shù)據(jù)尚未發(fā)表）,由于該基因型小鼠T/B細胞發(fā)育障礙,這提示我們:百日咳毒素所引起的急性肝損傷可能主要涉及肝臟中固有免疫,而與適應(yīng)性免疫無關(guān)。因此,我們初步探討anti-CD24中和抗體對小鼠kupffer細胞的調(diào)節(jié)作用。流式細胞術(shù)分析表明:百日咳毒素和anti-CD24同時處理的巨噬細胞壞死程度明顯升高?，F(xiàn)已知:固有免疫系統(tǒng)通過Toll樣受體（Toll-like receptors,TLR）和/或Nod樣受體（Nod-like receptors,NLR）識別死亡相關(guān)分子和/或病原相關(guān)分子,但其調(diào)控的分子機制尚不十分清楚。最近的研究證明:在對乙酰氨基酚（AAP）誘導(dǎo)的肝壞死模型中,CD24和Siglec-10/G信號傳導(dǎo)途徑能夠有效保護宿主免于致死性肝損傷[3]。在這些發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上,我們提出如下假設(shè):CD24分子可能是機體內(nèi)毒素誘導(dǎo)肝損傷的一個重要的調(diào)節(jié)分子,通過抑制免疫反應(yīng)來保護肝臟免于百日咳毒素的攻擊。有關(guān)CD24分子作用的靶細胞及可能的信號傳導(dǎo)通路的研究正在進行中。

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[收稿2011-01-17 修回2011-03-22]

（編輯 張曉舟）

CD24 regulated pertussis toxin-induced acute liver injury in m ice

ZHONGYu-Xia,GERui,WULi-Yuan,DAIYu,ZAHNGXue-Jun.DepartmentofImmunology,BasicMedicalCollege,TianjinMedicalUniversity,Tianjin300070,China

Objective:To explore the effectof CD24 on pertussis toxin-induced acute liver injury inmiceand the underlyingmolecular mechanism.Methods:acute liver injurywas induced in wild-type（WT）mice by pertussis toxin with（as experimentalgroup）orwithout（as control group）anti-CD24 antibody.Survivalwasobserved in allgroups.Forhistology,liverwasstained withhematoxylin and eosin（H&E staining）.Serum alanine transaminase（ALT）and aspartate aminotransferase（AST）weremeasured by serum chem istry,and TNF-a levelwas detected by ELISA.Apoptosis ofmacrophages inwild typemice was analyzed by flow cytometry.Results:The indicated dose of anti-CD24 antibody（200μg/mouse）caused rapid death in experimental group within 12 hours.Thiswas accompanied by increased amounts of serum ALT and AST,and liver hemorrhage.A massive increase in tumor necrosis factor-α（TNF-α）was also detected after anti-CD24 antibody treatment.Flow cytometric analysis showed that anti-CD24 antibody increased necrosis of kupffer cells in WTmice induced by pertussis toxin.Conclusion:These data reveal thatCD24 inhibit the pertussis toxin-induced acute liver injury inmice.

CD24;Pertussis toxin;Acute liver injury;Kupffer cells

R392.3

A

1000-484X（2011）05-0387-04

10.3969/j.issn.1000-484X.2011.05.001①本文受國家自然基金資助項目（No.30870562、30770432）、天津市應(yīng)用基礎(chǔ)及前沿技術(shù)研究項目（No.08JCYBJC07700）和天津市高等學(xué)?？萍及l(fā)展基金項目（No.20050109）等項目資助

鐘玉霞（1984年-）,女,碩士,主要從事感染免疫的實驗研究,E-mail:yuxia0301@163.com;

及指導(dǎo)教師:張學(xué)軍（1969年-）,男,副教授,碩士生導(dǎo)師,主要從事感染免疫和自身免疫病的實驗研究,E-mail:xjzh@tijmu.edu.cn。