李羅清 孫圣剛 曹學(xué)兵 王云甫 (湖南省岳陽市一人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,岳陽414000)

未成熟樹突狀細胞對T細胞活化及其IFN-γ和IL-12表達的影響①

李羅清 孫圣剛②曹學(xué)兵②王云甫③(湖南省岳陽市一人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,岳陽414000)

目的:探討未成熟樹突狀細胞(DC)對T細胞活化及其IFN-γ和IL-12表達的影響。方法:通過誘導(dǎo)Lewis大鼠骨髓前體細胞,獲取未成熟(iDC)和成熟(mDC)兩種狀態(tài)的DC;將兩種DC用乙酰膽堿受體(AChR)負載后進行T細胞重復(fù)刺激、交叉刺激和無關(guān)抗原刺激試驗,觀察T細胞增殖情況并測定T細胞IFN-γ、IL-12的表達水平。結(jié)果:(1)AChR負載的iDC可明顯抑制T細胞增殖,且這種被抑制的T細胞對AChR負載的mDC的交叉刺激也不引起增殖,但對無關(guān)抗原OVA負載的mDC的刺激可產(chǎn)生明顯增殖。(2)與mDC組比較,AChR負載的iDC初次和重復(fù)刺激均明顯抑制T細胞IFN-γ和IL-12的表達。結(jié)論:iDC可誘導(dǎo)抗原特異性T細胞耐受,耐受機制可能與Th1細胞因子IFN-γ和IL-12的抑制有關(guān)。

樹突狀細胞;T細胞;免疫耐受;細胞因子

10.3969/j.issn.1000-484X.2011.03.004①本文為湖北省自然科學(xué)基金項目(No.2006ABA344)和湖北省教育廳科學(xué)研究項目(No.2004Z001)

樹突狀細胞(Dendritic cell,DC)既可啟動免疫應(yīng)答,也可誘導(dǎo)中樞和外周耐受。DC提呈抗原最終表現(xiàn)為免疫激活還是免疫耐受的決定因素目前尚不十分清楚。一種觀點認為,機體內(nèi)存在不同的DC亞群,它們分別負責(zé)不同的功能[1]。但近來研究表明, DC亞群的功能并非一成不變,如從人的前體細胞分化而來的DC,對不同的活化刺激物表現(xiàn)出不同的反應(yīng)[2]。因此,這種一類細胞對應(yīng)一類免疫反應(yīng)的觀念受到了挑戰(zhàn),并提出了另外一種觀點:DC的不同成熟狀態(tài)有著不同的功能[1]。本研究旨在探討未成熟DC對T細胞活化、分化及功能的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與動物 RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、TRIZOL為美國Gibco公司產(chǎn)品。PCR Marker(DL-2000)購自大連寶生物公司。細胞因子:rrIL-2、rrIL-4、rrGM-CSF均為Sigma公司產(chǎn)品。大鼠IFN-γELISA檢測試劑盒為R&D公司產(chǎn)品。乙酰膽堿受體(AChR)由本實驗室提取。健康Lewis大鼠,購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。

1.2 DC的體外誘導(dǎo)、抗原負載及滅活 按本實驗室已有方法培養(yǎng)Lewis大鼠DC[3]。收集疏松粘附于培養(yǎng)板底的DC,第6天加入LPS的同時,未成熟組和成熟組分別加入50 μ g/ml的AChR或50 μ g/ml的OVA,置37℃、5%的CO2孵箱中,用完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)18小時即得AChR負載的iDC(AChR+iDC)、 AChR負載的mDC(AChR+mDC)和OVA負載的mDC(OVA+mDC)。充分洗滌后重懸于RPMI1640完全培養(yǎng)基,加入終濃度為25 μ g/ml的絲裂霉素C,于37℃孵育30分鐘滅活后,以RPMI1640培養(yǎng)液洗滌3次,調(diào)整細胞濃度為4×105ml-1作為刺激細胞。

1.3 混合淋巴細胞反應(yīng)

1.3.1 AChR負載的DC重復(fù)刺激T細胞 尼龍毛柱法分離Lewis大鼠脾臟T細胞。取24孔培養(yǎng)板,每孔分別加入106T細胞,再加入105AChR負載的iDC或mDC刺激,用完全培養(yǎng)基調(diào)整終體積為1 ml。置37℃、5%的CO2孵箱中培養(yǎng)。每組設(shè)4個復(fù)孔,每個刺激循環(huán)后行細胞計數(shù)。第6天加入終濃度為100 U/ml的IL-2擴增T細胞。2周后,同前條件加入105AChR負載的iDC或mDC再次刺激。再次刺激后第3天加入終濃度為100 U/ml的IL-2擴增T細胞。再次刺激1周后,同條件加入105AChR負載的iDC或mDC行第3次刺激。第3次刺激后第3天加入終濃度為100 U/ml的IL-2擴增T細胞。

1.3.2 淋巴細胞增殖測定 取96孔培養(yǎng)板,每孔分別加入2×105AChR負載的DC重復(fù)刺激前的T細胞作反應(yīng)細胞(NT);再分別加2×104、1×104、5× 103AChR負載的iDC或mDC作刺激細胞,終體積為200 μ l;每濃度設(shè)3個復(fù)孔。37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。4天后每孔加入5 mg/ml的MTT 20 μ l,繼續(xù)培養(yǎng)4小時。離心棄上清,每孔加入DMSO 100 μ l,測各孔490 nm波長的光密度值(A490),結(jié)果以3孔均值表示。同前方法,反應(yīng)細胞改為AChR負載的iDC或mDC重復(fù)刺激3次后的T細胞(iDC-3T或mDC-3T),測定其對AChR負載的iDC或mDC的增殖活性。同前方法,刺激細胞改為OVA負載的mDC,測定AChR負載的iDC或mDC重復(fù)刺激3次后的T細胞對OVA負載的mDC刺激的增殖活性。

1.4 上清液中IFN-γ水平的測定 取AChR負載的iDC或mDC初次刺激前后和重復(fù)刺激3次后的各組細胞培養(yǎng)上清液,用0.45 μ m的濾膜除去雜質(zhì)后,采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測IFN-γ濃度。

1.5 RT-PCR測定T細胞IL-12p35 mRNA的表達收集AChR負載的iDC或mDC初次刺激前和重復(fù)刺激3次后的各組T細胞,用TRIZOL試劑提取細胞總RNA。在逆轉(zhuǎn)錄酶M-MLV的作用下,將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA分子。然后通過PCR擴增IL-12 p35和參照β-actin的cDNA。IL-12 p35的上游引物為:5′CGCTACCTCCTCTTCTTG 3′,下游引物為:5′GCTTTCTGGTGCAGAGTC 3′,擴增產(chǎn)物長度為500 bp。β-actin的上游引物為:5′AGCAGAGAATGGAAAGTCAAA 3′,下游引物為:5′ATGCTGCTTACATGTCTCGAT 3′,擴增產(chǎn)物長度為266 bp。PCR總反應(yīng)體積50 μ l。反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性5分鐘,94℃變性30秒,48℃(βactin為54℃)退火30秒,72℃延伸45秒,共進行32個循環(huán),72℃加強延伸7分鐘。將10 μ l擴增產(chǎn)物于瓊脂糖凝膠電泳,紫外透射儀下觀察并攝像。

2 結(jié)果

2.1 淋巴細胞增殖測定

2.1.1 重復(fù)刺激 AChR+mDC初次和重復(fù)刺激均能誘導(dǎo)強烈的T細胞增殖,3個刺激循環(huán)后T細胞擴增了50～80倍。而AChR+iDC初次和重復(fù)刺激均只引起微弱的T細胞增殖(結(jié)果見表1、2)。

2.1.2 交叉刺激和無關(guān)抗原刺激 AChR+mDC重復(fù)刺激3個循環(huán)后的T細胞對AChR+iDC的刺激引起較弱的增殖反應(yīng),而AChR+iDC重復(fù)刺激3個循環(huán)后的T細胞對AChR+mDC的刺激不引起增殖。AChR+mDC和AChR+iDC重復(fù)刺激3個循環(huán)后的T細胞均能對無關(guān)抗原OVA負載的mDC的刺激產(chǎn)生明顯增殖,前者增殖反應(yīng)更強(結(jié)果見表3)。2.2 上清液IFN-γ水平的測定 AChR+mDC初次和第3次重復(fù)刺激后,其上清液中IFN-γ的含量較刺激前均明顯增高。而AChR+iDC初次和第3次重復(fù)刺激后,IFN-γ的含量與刺激前比較均無明顯差異,并顯著低于AChR+mDC組(結(jié)果見表4)。

2.3 IL-12p35 mRNA的表達 5組T細胞 β-actin mRNA表達恒定,無明顯差異,表明該實驗方法可靠,結(jié)果具有可比性。AChR+mDC初次和第3次重復(fù)刺激后,IL-12p35 mRNA的表達水平均明顯上調(diào)。而AChR+iDC初次和第3次重復(fù)刺激后,IL-12p35 mRNA的表達與刺激前比較均無明顯差異,并顯著低于AChR+mDC組(結(jié)果見圖1)。

表1 重復(fù)刺激過程中T細胞增殖(×106ml-1)Tab.1 Proliferation of T cells when stimulated repeatedly by DCs(×106ml-1)

表2 AChR負載的mDC和iDC初次和重復(fù)刺激T細胞增殖的能力Tab.2 The capability of AChR pulsed DCs stimulating T cells the first or repetitive

表3 重復(fù)刺激3循環(huán)后的T細胞對交叉刺激和無關(guān)抗原刺激的增殖能力Tab.3 Proliferation of T cells stimulated by DCs for 3 cycles when restimulated crossly or by independent antigen

表4 重復(fù)刺激過程中上清液中IFN-γ的含量(pg/ml)Tab.4 The content of IFN-γin supernatant when stimulated repeatedly by DCs(pg/ml)

圖1 T細胞IL-12p35 mRNA的表達Fig.1 Expressions of IL-12p35 mRNA by T cells

3 討論

DC既可以激活也可以耐受的方式提呈抗原,其功能特征取決于其成熟狀態(tài)和局部微環(huán)境。T細胞的充分活化至少需要獲得兩個相關(guān)的刺激信號,一是T細胞受體(TCR-CD3)介導(dǎo)的抗原特異性信號(第一信號),二是由B7-CD28等共刺激分子介導(dǎo)的抗原非特異性信號(第二信號)。缺少共刺激信號的抗原提呈可導(dǎo)致克隆性T細胞無能,未成熟DC表面MHC、共刺激分子及其它輔助分子的表達水平較低,所以雖然它們具有很強的抗原攝取加工能力,但由于缺少第一和/或第二信號的刺激而不能活化T細胞,導(dǎo)致T細胞的無能或低反應(yīng)性,從而誘導(dǎo)抗原特異性耐受。未成熟DC可誘導(dǎo)T細胞無能并顯著延長移植物的存活時間[4]。抗原負載的未成熟DC可誘導(dǎo)1型糖尿病耐受[5]。體外實驗也發(fā)現(xiàn),未成熟DC可誘導(dǎo)抗原特異性T細胞無能[6]。受者T細胞與供者未成熟DC共同培養(yǎng)后,當(dāng)再用供者免疫源性DC刺激時,細胞因子的分泌明顯減少且T細胞呈現(xiàn)明顯的低反應(yīng)性[7]。本研究中,AChR負載的mDC初次和重復(fù)刺激均能誘導(dǎo)強烈的T細胞增殖,而AChR負載的iDC僅在初次刺激時引起較弱的T細胞增殖,重復(fù)刺激則明顯抑制其增殖;當(dāng)這些經(jīng)AChR負載的iDC重復(fù)刺激3個循環(huán)后的T細胞再用AChR負載的mDC刺激時,也不能引起增殖;但當(dāng)用無關(guān)抗原OVA負載的mDC刺激時,則產(chǎn)生明顯的增殖反應(yīng)。提示未成熟DC可引起T細胞無能,且這種無能是抗原AChR特異性的。

免疫細胞間的相互作用是通過細胞因子介導(dǎo)的。IFN-γ主要由活化的Th1型T細胞產(chǎn)生,可通過上調(diào)淋巴細胞或誘導(dǎo)抗原提呈細胞MHCⅡ類分子的表達來促進抗原提呈和特異性免疫識別,促進巨噬細胞Fc受體的表達并激活巨噬細胞,參與B細胞免疫應(yīng)答。IL-12主要由活化的巨噬細胞、樹突狀細胞和中性粒細胞產(chǎn)生,可通過促進IFN-γ的產(chǎn)生而誘導(dǎo)CD4+Th0細胞向Th1細胞分化,在Th1反應(yīng)中處于不可或缺的地位[8]。近來研究發(fā)現(xiàn),免疫系統(tǒng)中可能存在一個IL-12/IL-10免疫調(diào)節(jié)環(huán)路,控制著機體對自身免疫性疾病的易感性[9]。在此環(huán)路中,IL-12促進IFN-γ產(chǎn)生,而IFN-γ一方面通過上調(diào)B細胞共刺激分子的表達促進體液免疫;另一方面通過上調(diào)抗原提呈細胞MHCⅡ的表達增強其向CD4+T細胞提呈抗原的能力,誘導(dǎo)Th1細胞分化。同時IL-12可通過下調(diào)IL-10等Th2細胞因子而拮抗免疫抑制細胞的功能。未成熟DC誘導(dǎo)的1型糖尿病耐受與T細胞IFN-γ的表達下調(diào)有關(guān)[10]。體外未成熟DC誘導(dǎo)的T細胞無能與其IL-2、IL-4、IL-12、IFN-γ的表達抑制有關(guān)[6]。我們發(fā)現(xiàn),成熟DC初次和重復(fù)刺激均引起IFN-γ和IL-12的表達顯著增強,呈典型的Th1細胞因子分泌模式;而未成熟DC初次和重復(fù)刺激時,IFN-γ和IL-12p35的表達均無明顯變化。由此我們推測,未成熟DC誘導(dǎo)產(chǎn)生抗原特異性T細胞耐受的機制,可能與Th1型細胞因子IFN-γ和IL-12的抑制有關(guān)。

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3 李羅清,孫圣剛,曹學(xué)兵 et al.早期脂多糖干預(yù)對大鼠樹突狀細胞表型和功能的影響[J].免疫學(xué)雜志,2005;21(5):193-196.

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[收稿2010-09-01 修回2010-11-19]

(編輯 張曉舟)

Effect of immature dendritic cells on the activation of T cells and the expression of IFN-γand IL-12 by T cells

LI Luo-Qing,SUN Sheng-Gang,CAO Xue-Bing,WANGYun-Fu.Department of Neurology,Yueyang First People Hospital,Yueyang 414000,China

Objective:To investigate the effect of immature dendritic cells(DCs)on the activationof T cells and the expression of IFN-γandIL-12by T cells.MethodsImmature and mature DCs(iDCsandmDCs)were induced from ratbone marrow precursor cells.After pulsed with acetylcholine receptor(AChR),DCs were used to stimulate T cells by any stimulations of repetitive,cross or independent with antigen ovalbumin.The proliferation of T cells and the expression of IFN-γand IL-12 by T cellswere measured.Results(1)The AChR pulsed iDCsinhibited the proliferation of T cells.The inhibited T cells didn't propagate when restimulated by AChR pulsed mDCs but propagate intensively when restimulated by ovalbuminpulsed mDCs.(2)Comparedwith the responsesof mDCs,the expressions of IFN-γand IL-12 by T cellsstimulated withAChR-pulsed iDCswere inhibited.ConclusioniDCs could induce the antigen-specific tolerance of T cells,which is related to the inhibition of Th1 production of IFN-γand IL-12.

Dendritic cells;T cells;Immune tolerance;Cytokine

R392.1

A

1000-484X(2011)03-0209-04

②華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,武漢430022③鄖陽醫(yī)學(xué)院附屬太和醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,十堰442000

李羅清(1972年-),男,博士,副主任醫(yī)師,碩士生導(dǎo)師,主要從事神經(jīng)免疫的基礎(chǔ)與臨床研究,E-mail:luoql99s@163.com。

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