徐 莉，董福生，許麗華，蔣強國，李 彬，段立立

(河北醫(yī)科大學口腔醫(yī)學院，河北石家莊 050017)

β－防御素－1，2在實驗性大鼠牙齦炎牙周炎模型牙齦上皮組織中的表達

徐 莉，董福生，許麗華，蔣強國，李 彬，段立立

(河北醫(yī)科大學口腔醫(yī)學院，河北石家莊 050017)

目的:通過建立大鼠牙齦炎、牙周炎模型并檢測大鼠β－防御素－1，2(RBD－1，RBD－2)在其牙齦上皮三個區(qū)域的分布，探討RBD－1、RBD－2在大鼠牙齦炎牙周炎發(fā)生、發(fā)展過程中的變化。方法:用正畸結(jié)扎絲結(jié)扎大鼠雙側(cè)上頜第一磨牙，經(jīng)臨床和HE組織學染色確認結(jié)扎后2周、6周大鼠牙齦炎、牙周炎模型建立成功后，取大鼠上頜骨連同牙和牙周組織，制備切片，SP免疫組化染色法檢測正常組、牙齦炎組、牙周炎組大鼠牙齦上皮中RBD－1、RBD－2的表達。結(jié)果:RBD－1、RBD－2在三組的牙齦上皮中都有表達，主要表達于口腔齦上皮棘細胞層和顆粒層細胞胞漿，在溝內(nèi)上皮棘細胞層呈微弱表達，結(jié)合上皮、結(jié)締組織、骨組織無表達;RBD－1在口腔齦上皮的表達強度各組無明顯差異(P＞0.05);RBD－2則在牙齦炎組表達強度顯著升高，在牙周炎組表達強度顯著降低(P＜0.05);RBD－1、RBD－2在溝內(nèi)上皮的表達則為牙齦炎組和牙周炎組顯著低于正常組(P＜0.05)。結(jié)論:RBD－1在大鼠牙齦上皮中呈組成性表達，而RBD－2的表達隨炎癥發(fā)展而改變;提示防御素在牙周組織的健康維護和牙周炎癥進展中均起重要作用。

牙齦炎;牙周炎;牙齦上皮;大鼠β－防御素－1，2;免疫組化

［牙體牙髓牙周病學雜志，2011，21(1):6］

［Chinese Journal of Conservativedentistry，2011，21(1):6］

口腔上皮系統(tǒng)的天然免疫防御作用對牙周組織的健康維持非常重要。其中圍繞牙周組織并與牙體頸部緊密相連的牙齦上皮是外來刺激進入牙周組織深部的入口，由口腔齦上皮(oral epithelium，OE)、溝內(nèi)上皮(sulcular epithelium，SE)和結(jié)合上皮(junctional epithelium，JE)3個區(qū)域共同組成抵御外來刺激的第一道防線，但其組織學結(jié)構(gòu)各不相同，功能復雜，除機械屏障、微生物屏障等作用外，還具有由防御素、溶菌酶和趨化因子等組成的化學屏障。其中β－防御素(beta－defensins，BDs)是上皮分泌的一類小分子抗微生物多肽，對病原體尤其是G－菌和真菌，如大腸桿菌、綠膿桿菌、牙齦卟啉單胞菌、具核梭桿菌及伴放線放線菌等有直接殺傷作用，還與其他蛋白酶有協(xié)同作用，是其化學屏障的重要組成部分。BD－1、BD－2是β－防御素家族中兩個代表性的多肽，BD－1一般為固有性表達，而BD－2的表達則隨外來刺激或炎癥程度的變化而改變，但兩者在牙齦上皮3個不同區(qū)域的表達方式及其與炎癥程度的關(guān)系尚不明確。本研究通過結(jié)扎大鼠雙側(cè)第一磨牙建立牙齦炎和牙周炎模型，檢測各炎癥階段BD－1、BD－2在不同區(qū)域的表達變化，從分子水平探討B(tài)D－1、BD－2在牙周炎癥發(fā)展過程中的作用。

1 材料和方法

1.1 主要材料和儀器

純種6月齡雄性Wistar大鼠(河北醫(yī)科大學實驗動物中心);超薄石蠟切片機(萊卡RM2015，德國);電熱恒溫水箱(上海醫(yī)療器械七廠);光學顯微鏡(奧林巴斯，日本);多功能照相顯微鏡(奧林巴斯 BX51T－PHD－J11，日本);水合氯醛、EDTA(分析純，天津市永大化學試劑開發(fā)中心)，兔抗RBD－1多克隆抗體、兔抗RBD－2多克隆抗體、兔SP試劑盒(北京博奧森生物技術(shù)有限公司);DAB顯色劑(北京中杉金橋有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 牙齦炎和牙周炎動物模型的建立

取體質(zhì)量300g左右6月齡雄性Wistar大鼠30只，隨機分為正常對照組、牙齦炎組、牙周炎組，每組10只。牙齦炎和牙周炎組大鼠用100 mL/L水合氯醛(350 mg/kg)麻醉后，以直徑0.2 mm的正畸結(jié)扎絲結(jié)扎每只大鼠雙側(cè)上頜第一磨牙頸部，并置于齦下，在腭側(cè)打結(jié)。從實驗當天起飼以軟食和高糖水(100g/L)。正常對照組除施以同樣的麻醉外，不作任何處理，與兩實驗組相同環(huán)境下飼以常規(guī)飼料和水。每日觀察記錄各組大鼠的活動狀態(tài)、體質(zhì)量、飲食、糞便等變化，同時檢查結(jié)扎絲的穩(wěn)固情況及牙周狀況。

1.2.2 牙齦炎、牙周炎成模標準和確定

牙齦炎組于結(jié)扎后第2周，牙周炎組于結(jié)扎后第6周檢查建模牙的牙周各指標，并于各組中隨機抽取一只大鼠股動脈放血處死，取上頜骨(連同建模牙及其牙周組織)進行常規(guī)組織病理學觀察，按以下標準確定建模是否成功。

牙齦炎成模標準:牙齦紅腫、光亮，牙齦指數(shù)為1～2，牙齦出血指數(shù)為2～3，探診出血陽性，無牙周袋形成和附著喪失;鏡下可見牙齦上皮無明顯糜爛或潰瘍，結(jié)合上皮附著位置正常，組織中可見明顯中性粒細胞浸潤，毛細血管增生、擴張、充血，牙周膜纖維排列正常。

牙周炎成模標準:牙齦紅腫增生、有菌斑堆積，牙齦指數(shù)為2～3，牙齦出血指數(shù)為3～4，探診出血陽性位點增多，可探及牙周袋，附著喪失1～2 mm以上;鏡下可見牙齦組織炎癥明顯，溝內(nèi)上皮有糜爛或潰瘍，結(jié)合上皮與牙體結(jié)合不緊密并向根方增殖，固有層大量淋巴細胞、中性粒細胞浸潤，牙周膜內(nèi)血管擴張，牙周膜纖維排列紊亂;牙槽骨邊緣可見到明顯的破骨細胞和骨吸收陷窩。

1.2.3 免疫組化染色觀察

牙齦炎組于結(jié)扎后2周，正常組、牙周炎組于結(jié)扎6周后分別通過股動脈放血處死各組大鼠，取連同建模牙及其牙周組織的上頜骨組織塊，置100 mL/L甲醛液中4℃固定1周，蒸餾水徹底沖洗后，置100g/L EDTA溶液中脫鈣40d。0.01 moL/L PBS(pH7.4)漂洗12 h，乙醇梯度脫水，石蠟包埋，沿牙體長軸制作頰舌向組織切片，片厚4 μm。切片脫蠟至水，30 mL/L過氧化氫液封閉內(nèi)源性酶30 min，0.01 mol/L PBS洗，羊血清封閉非特異結(jié)合位點，滴加1∶200稀釋的兔抗RBD－1或RBD－2，4℃過夜，PBS洗，SP法標記相應特異性抗原，DAB顯色，蘇木素復染，常規(guī)脫水，透明，封片。陰性對照和空白對照分別用一抗同種血清和PBS代替一抗。

結(jié)果判定:細胞漿中出現(xiàn)淡黃色至棕黃色顆粒，且著色高于背景底色者為陽性，細胞胞漿內(nèi)不著色或呈淺棕色背景顏色者為陰性。400倍顯微鏡下連續(xù)拍照，每個標本隨機取5個不同視野應用圖像分析系統(tǒng)進行陽性細胞計數(shù)，取均值。

1.3 統(tǒng)計學處理

所得數(shù)據(jù)應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，用SNK法進行兩兩比較，檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 大鼠上頜第一磨牙牙齦炎、牙周炎建模結(jié)果

正常對照組大鼠上頜第一磨牙牙齦呈粉紅色，質(zhì)韌，邊緣銳，探診不出血，無牙周袋形成。組織學觀察溝內(nèi)上皮完整，有角化，結(jié)合上皮位置正常，無明顯炎癥細胞浸潤，牙齦、牙周膜纖維排列有序、規(guī)律，牙槽骨邊緣整齊，未見破骨細胞(圖1a)。牙齦炎組大鼠(結(jié)扎2周后)上頜第一磨牙牙齦呈暗紅色，齦乳頭齦緣紅腫，探診出血，但未探及明顯的牙周袋。組織學觀察可見溝內(nèi)上皮完整，結(jié)合上皮位置正常，牙齦結(jié)締組織水腫明顯，有中性粒細胞浸潤，毛細血管數(shù)目增多。上皮釘突數(shù)目增多，伸長，牙周膜纖維排列正常，牙槽骨邊緣整齊，未見破骨細胞(圖1b);牙周炎組大鼠(結(jié)扎6周后)，除牙齦紅腫、菌斑堆積增多、探診出血加重外，還有附著喪失，可探及牙周袋。組織學觀察可見牙齦組織增生，溝內(nèi)上皮潰瘍、壞死，結(jié)合上皮向根方增殖，上皮和固有層內(nèi)有大量淋巴細胞浸潤，牙周膜纖維排列紊亂，毛細血管數(shù)目增多、管腔擴大，牙槽骨邊緣可見破骨細胞(圖1c)。

圖1 大鼠上頜第一磨牙結(jié)扎后不同時間的牙齦上皮HE染色(×200)

2.2 RBD－1、RBD－2 免疫組化染色結(jié)果(圖2～3，表1～2)

RBD－1、RBD－2在正常、牙齦炎、牙周炎組的牙齦組織中均有表達，主要表達于口腔齦上皮棘層和顆粒層，在溝內(nèi)上皮棘層有微弱表達，結(jié)合上皮、結(jié)締組織、骨組織無表達。陽性染色位于細胞胞漿和胞膜，以棘層細胞著色最強，基底細胞未見明顯著色。

表1 RBD－1在口腔齦上皮和溝內(nèi)上皮的表達(±s)

表1 RBD－1在口腔齦上皮和溝內(nèi)上皮的表達(±s)

▲口腔齦上皮與溝內(nèi)上皮相比P＜0.05，★牙齦炎組、牙周炎組與正常組相比P＜0.05

分組 齦上皮 溝內(nèi)上皮正常組 38.73 ± 6.81▲25.30 ±4.95牙齦炎組 37.34±3.73▲ 18.78±3.31★牙周炎組 37.02±5.82▲ 17.00±6.53★

表2 RBD－2在口腔齦上皮和溝內(nèi)上皮的表達(±s)

表2 RBD－2在口腔齦上皮和溝內(nèi)上皮的表達(±s)

▲口腔齦上皮與溝內(nèi)上皮相比P＜0.05，★牙齦炎組、牙周炎組與正常組相比P＜0.05，●牙周炎組與牙齦炎組相比P＜0.05

分組 齦上皮 溝內(nèi)上皮正常組 32.64 ±7.28▲20.72 ±3.31牙齦炎組 39.95±7.40▲★ 15.31±4.52★牙周炎組 18.18±5.11▲★● 15.89±4.69★

圖2 大鼠上頜第一磨牙結(jié)扎后不同時間的牙齦上皮RBD－1免疫組化染色

圖3 大鼠上頜第一磨牙結(jié)扎后不同時間的牙齦上皮RBD－2免疫組化染色(×200)

3 討論

在有關(guān)β防御素與牙周炎關(guān)系的研究，由于人牙齦上皮取材較難，只能取得口腔齦上皮和部分溝內(nèi)上皮，很難取到結(jié)合上皮;也不易觀察同一個體不同炎癥階段的發(fā)展變化，因而受到許多限制。大鼠磨牙牙周組織的解剖生理結(jié)構(gòu)與人類相似，主要區(qū)別是溝內(nèi)上皮為角化上皮，而且牙周炎時其牙周組織的破壞也與人類極為相似。本研究選用大鼠為模型，觀察RBD－1，RBD－2在正常和炎癥狀態(tài)下牙齦上皮三個區(qū)域的表達情況，為闡明β－防御素在牙周炎發(fā)生發(fā)展中的作用提供實驗室依據(jù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn):各組RBD－1、RBD－2在口腔齦上皮的表達均顯著高于相應溝內(nèi)上皮，而在結(jié)合上皮中無表達，且二者在溝內(nèi)上皮的表達均為牙齦炎組和牙周炎組明顯低于正常組，這可能與不同部位的角化程度有關(guān)，因為BD－1和BD－2在過角化上皮中的表達水平顯著高于角化和非角化上皮，大鼠溝內(nèi)上皮雖有角化，但角化程度不如口腔齦上皮，且牙齦發(fā)生炎癥時，會出現(xiàn)溝內(nèi)上皮的潰瘍、糜爛、變性，使棘層細胞破壞或消失。因此RBD－1、RBD－2在口腔齦上皮和溝內(nèi)上皮、結(jié)合上皮的表達差異，可能與其角化程度不同、溝內(nèi)上皮的完整性在炎癥時被破壞有關(guān)。

β－防御素－1(BD－1)是Bensch(1995)首次從腎衰病人血液透析中分離獲得［1］。多數(shù)研究發(fā)現(xiàn)BD－1在正常及炎癥狀態(tài)下的表達在統(tǒng)計學上無顯著差異，本結(jié)果也顯示，RBD－1在正常組、牙齦炎組、牙周炎組口腔齦上皮組織中的表達無明顯區(qū)別，進一步證明了RBD－1呈組成性表達，不受炎癥狀態(tài)的影響。提示RBD－1在維持正?？谇粌?nèi)的微生態(tài)平衡，保持牙齦組織健康的先天性免疫中起重要作用。而馮云等在有關(guān)人肺上皮細胞的研究中，則發(fā)現(xiàn)微生物或炎性因子可引起B(yǎng)D－1 mRNA的表達增強，但增強強度較BD－2低，可能是BD－1的表達有組織特異性，受不同部位上皮的組織特異性調(diào)控因子調(diào)節(jié);也可能是基因與蛋白的表達不均衡性所致［2－3］。

有研究者利用原位雜交及RT－PCR技術(shù)檢測，發(fā)現(xiàn)在呼吸道、包皮、胃腸道、口腔上皮等組織中BD－2呈少量表達，而當這些部位受到炎性刺激時，HBD－2則會大量表達，認為BD－2是誘導型防御素［4－5］。本研究結(jié)果顯示:RBD－2 在正常組、牙齦炎組和牙周炎組的口腔齦上皮組織中均有表達，在牙齦炎組呈高表達，與其他研究的誘導性表達一致。但在正常組也有中等強度的表達，而牙周炎組的表達則低于正常組，其原因可能是在健康口腔環(huán)境下，也有誘導RBD－2表達的因素存在。據(jù)報道:RBD－2可在感染狀態(tài)、細菌毒性產(chǎn)物(如脂多糖)、炎癥因子 TNF－α、IL－1β、IL－8、具核梭桿菌(Fn)等的刺激下表達上調(diào)［6］，其中 Fn為口腔常見共生菌，在正?？谇粻顟B(tài)下也可多量存在。體外實驗也表明:培養(yǎng)的牙齦上皮細胞中加入Fn的細胞壁提取物，能上調(diào)上皮細胞RBD－2的表達，因此，在口腔共生菌大量存在的情況下，健康牙齦上皮亦可表達較強的BD－2，而牙齦炎狀態(tài)下表達量進一步增加可能是因為炎癥時細菌及其產(chǎn)物和炎性細胞因子等誘導因子大量增多的緣故。本研究結(jié)果提示RBD－2在牙齦口腔上皮的表達可能具有組成性和誘導性表達兩種方式存在。而RBD－2在牙周炎組表達量降低，與李雅靈等的研究結(jié)果一致［7］，可能與長期慢性炎癥狀態(tài)下牙周局部各種誘導因子和牙齦上皮細胞本身的生物學特性改變等多種因素有關(guān)，與RBD－2的誘導性防御素特點可能并不矛盾。具體原因可能有以下幾種:①在牙周炎癥的不同階段，局部存在的微生物種類不同，對RBD－2的調(diào)控作用可能有所不同。體外細胞培養(yǎng)的實驗中除發(fā)現(xiàn)牙周共生菌具核梭桿菌Fn能在短時間內(nèi)(2～4 h)上調(diào)牙齦上皮細胞表達BD－2 mRNA外，還發(fā)現(xiàn)牙周致病菌牙齦卟啉單胞菌(Pg)不能上調(diào)BD－2 mRNA的表達，且Pg的脂多糖(LPS)亦不能引起B(yǎng)D－2 mRNA的上調(diào)，隨著炎癥發(fā)展，局部Pg增多而Fn減少，對BD－2的誘導作用減弱［8］，同時牙周炎時齦下菌斑致病菌群數(shù)量的增加導致了RBD－2的消耗，致使其表達減弱;應對牙周炎不同發(fā)展階段的齦下菌群的種類和數(shù)量變化，各種細菌對防御素的誘導能力以及實驗性大鼠牙周炎與人類牙周炎的區(qū)別作進一步研究。②RBD－2在炎癥狀態(tài)下被組織蛋白酶降解。Taggart等研究表明，在炎癥狀態(tài)下宿主半胱氨酸組織蛋白酶呈現(xiàn)過度表達可導致HBD－2的降解甚至失活［9］。③各種致炎因子在牙周炎不同階段亦有復雜變化。雖然致炎因子(如 TNF－α、IL－1β 等)可誘導 RBD－2 表達上調(diào)，IL－4和IL－13卻可抑制BD－2 mRNA在角化細胞的表達。④牙周長期處在炎癥的狀態(tài)下，牙齦上皮細胞會發(fā)生水腫、變形，使細胞活性發(fā)生改變，從而導致自身的分泌功能降低。⑤β－防御素還受環(huán)境的鹽濃度、pH值、離子強度的影響，其確切機制有待于進一步的研究證明。

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The expression of β－defensin－1 and－2 ingingival epithelium in the ratgiginvitis and periodontitis model

XU Li，DONG Fu－sheng，XU Li－h(huán)ua，JIANG Qiang－guo，LI Bin，DUAN Li－li
(College of Stomatology，Hebei Medical University，Shijiazhuang 050017，China)

AIM:To examine thedistribution of β－defensin－1(RBD －1)and β－defensin－2(RBD－2)in thegingival epithelial cells of rat models ofgingivitis and periodontitis，so as to further understand the role of RBD－1 and RBD－2 in the initiation anddevelopment of rat periodontal inflammation.METHODS:The bilateral maxillary first molars of rats were ligated for 2 and 6 weeks，gingivitis and periodontitis were confirmed by clinical observation and HE histological staining.The expression of RBD－1 and RBD－2 in thegingival tissues in the normal and testedgroups was examined by SP immunohistochemical staining.RESULTS:RBD－1 and RBD－2 expression could bedetected in thegingival epithelium of threegroups.RBD－1 and RBD－2 were primarilydetected in the oralgingival epithelium，weaklydetected in sulcular epithelium，but was notdetected in junctional epithelium，connective tissue and bone tissues.No significantdifference of RBD－1 expression in oral epithelium was found among the threegroups.However，RBD－2 expression was significantly higher ingingivitisgroup，and it was significantly lower in periodontitisgroup as compared with normalgroup.RBD－1 and RBD－2 expression in the sulcular epithelium ofgingivitis and periodontitisgroups was significantly lower than that in normal controlgroup.CONCLUSION:RBD－1 showed a constitutive expression pattern ingingival epithelium，while RBD－2 expression was changed with thedegree of periodontal inflammation，indicating that β－defensins have an important role in both healthy and inflammatory conditions of periodontal tissues.

book=7,ebook=482

gingivitis;periodontitis;gingival epithelium;RBD－1，RBD－2;immunohistochemistry

R780.2

A

1005－2593(2011)01－0006－05

2010－07－07;

2010－09－13

徐莉(1983－)，女，漢族，山東德州人。碩士

許麗華，E －mail:xulh@hebmu.edu.cn