那思家，黃 芳，郭維華，宮 坤，金 巖，李德超

(1.佳木斯大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院口腔頜面外科，黑龍江佳木斯 154007;

2.第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院組織工程中心，陜西西安 710032)

牙周膜干細(xì)胞膜片的構(gòu)建及其生物學(xué)特性的研究

那思家1，黃 芳1，郭維華2，宮 坤2，金 巖2，李德超1

(1.佳木斯大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院口腔頜面外科，黑龍江佳木斯 154007;

2.第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院組織工程中心，陜西西安 710032)

目的:探討牙周膜干細(xì)胞膜片的構(gòu)建及其生物學(xué)特性。方法:采用膠原酶消化人牙周膜組織，獲得牙周膜干細(xì)胞(Periodontal ligament stem cells，PDLSCs)，經(jīng)體外鑒定、擴(kuò)增后構(gòu)建PDLSCs細(xì)胞膜片，并通過倒置顯微鏡、HE染色、掃描電鏡(SEM)對PDLSCs細(xì)胞膜片形態(tài)學(xué)進(jìn)行檢測。此外，細(xì)胞膜片厚度及膜片中細(xì)胞密度也被檢測。結(jié)果:PDLSCs成功被分離、培養(yǎng)、鑒定，并且PDLSCs體外培養(yǎng)2周后，獲得白色膜狀PDLSCs細(xì)胞膜片。倒置顯微鏡下觀察顯示，細(xì)胞復(fù)層生長，細(xì)胞呈典型的紡錘狀。體式顯微鏡下觀察顯示，細(xì)胞與細(xì)胞之間緊密連接。組織學(xué)觀察顯示，細(xì)胞與細(xì)胞之間存在著大量細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix，ECM)。掃描電鏡下觀察膜片表面顯示，細(xì)胞在膜片上充分伸展，細(xì)胞之間緊密連接。PDLSCs細(xì)胞膜片厚度由起初的(48±3.2)μm到3周后的(69±3.4)μm，但在第2周細(xì)胞厚度(64±3.3)μm，變化最明顯。細(xì)胞膜片中的細(xì)胞密度檢測顯示連續(xù)培養(yǎng)3周后仍然有大量具有活性的細(xì)胞存在，然而細(xì)胞密度在第2周時(shí)最大。結(jié)論:本研究證明我們已經(jīng)成功探索出一套穩(wěn)定、可靠的PDLSCs細(xì)胞膜片構(gòu)建方法，為利用PDLSCs細(xì)胞膜片修復(fù)、再生牙周組織及牙周缺損提供了一定的技術(shù)保證。

牙周膜干細(xì)胞;細(xì)胞膜片;細(xì)胞外基質(zhì);組織工程

［牙體牙髓牙周病學(xué)雜志，2011，21(2):77］

［Chinese Journal of Conservativedentistry，2011，21(2):77］

基于工程學(xué)和生命科學(xué)而發(fā)展起來的組織工程學(xué)可以恢復(fù)或提高組織功能。組織工程學(xué)中支架材料主要采用三維立體可降解材料作為一種暫時(shí)的細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix，ECM)的代替物使接種在其上的細(xì)胞可以產(chǎn)生天然組織結(jié)構(gòu)，而支架材料最終被降解［1］;其中，常規(guī)細(xì)胞接種方法涉及細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞擴(kuò)增、細(xì)胞消化及最后將細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液接種于材料上［2］。首先，這種方法將導(dǎo)致一部分細(xì)胞在接種過程中損失掉;其次，細(xì)胞在支架材料上要重新分泌ECM，而其中一些細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞與細(xì)胞黏附過程中產(chǎn)生的蛋白是無法黏附于材料表面的［3－4］。此外，胰酶消化還會(huì)改變細(xì)胞形態(tài)和生化物質(zhì)，最后導(dǎo)致細(xì)胞活性丟失［5］。

目前，一種不含任何可降解支架材料的三維立體細(xì)胞膜片被發(fā)明［6－7］，這種膜片可以通過含有維生素C的培養(yǎng)基連續(xù)培養(yǎng)3周而獲得，然后通過細(xì)胞刮將其機(jī)械刮下［8］。這樣將不會(huì)破壞細(xì)胞之間的ECM及相關(guān)蛋白，同時(shí)可以避免由于胰酶消化而導(dǎo)致的細(xì)胞活性的丟失，從而解決了細(xì)胞接種于支架材料上的難題［9］。因此，細(xì)胞膜片已經(jīng)被應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域中，如組織工程骨組織再生、組織工程肝臟、心肌及角膜修復(fù)等［8－10］。然而，細(xì)胞膜片在組織工程牙齒再生領(lǐng)域中應(yīng)用較少［11－12］。

牙周膜干細(xì)胞(Periodontal ligament stem cells，PDLSCs)已經(jīng)被證明具有較高的自我更新能力和多向分化能力［13－14］，同時(shí)還擁有分泌大量ECM的能力［15－17］。而處于增值期的 PDLSCs細(xì)胞膜片同樣也具有多向分化能力，這有益于組織工程的應(yīng)用。雖然一些研究已經(jīng)證明PDLSCs細(xì)胞膜片可以修復(fù)牙周缺損［17－18］，但 PDLSCs細(xì)胞膜片的制備過程各不相同。本研究旨在探索出一套穩(wěn)定、可靠的PDLSCs細(xì)胞膜片構(gòu)建方法，并對PDLSCs細(xì)胞膜片的生物學(xué)特性進(jìn)行鑒定。

1 材料和方法

1.1 材料

α－MEM培養(yǎng)基、2.5g/L胰酶、Ⅰ型膠原酶、谷氨酰胺、青鏈霉素(Gibco公司，美國);胎牛血清(FBS，四季青公司);維生素C、地塞米松、β一甘油磷酸鈉、二甲基亞砜、TritonX－100(Sigma，美國);抗CD 146和 抗 STRO－1抗體(R＆D Systems，美國)。

1.2 方法

1.2.1 牙周膜干細(xì)胞(PDLSCs)的分離、培養(yǎng)

選取第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院門診因正畸治療需要拔除的無牙體、牙周組織炎癥和畸形的第二前磨牙10個(gè)，分別來自5名身體健康的病人(15～18歲)。牙拔除后立即用0.01 mol/L PBS沖洗，無菌條件下，用銳利刀片刮取根中1/3區(qū)域的牙周膜組織。將組織塊切割成約1 mm×1 mm的小塊，并放置在6孔板中(含150 mL/L FBS、0.292 mg/mL谷氨酰胺、100 U/mL青霉素/鏈霉素的α－MEM培養(yǎng)基)，在37℃、50 mL/L CO2和飽和濕度條件下培養(yǎng)，每2d換液，細(xì)胞從組織塊邊緣爬出后，繼續(xù)培養(yǎng)7d，至細(xì)胞生長達(dá)80%匯合時(shí)，用胰酶/EDTA(0.25/0.1，pH=6.4)消化傳代，標(biāo)記為第一代。

1.2.2 PDLSCs鑒定

1.2.2.1 PDLSCs克隆形成率

將對數(shù)生長期的PDLSCs以胰酶消化，反復(fù)吹打使細(xì)胞充分分散制成細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液以1×104接種至90 mm培養(yǎng)皿，十字方向輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)皿，使細(xì)胞分散均勻，加5 mL培養(yǎng)液培養(yǎng)14d后，細(xì)胞用40g/L多聚甲醛固定 20 min，棄固定液，晾干。加入結(jié)晶紫染液染色 10～20 min，棄染色液，PBS沖洗干凈。體視顯微鏡下計(jì)大于50個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)，并計(jì)算克隆形成率(colony forming unit－fibroblastic，CFU－F)。

1.2.2.2 PDLSCs流式分子鑒定

取培養(yǎng)第5代的 PDLSCs調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/mL，40g/L多聚甲醛固定15 min;洗滌后分別加入鼠抗人 STRO－1和 CD146單抗，室溫孵育1 h;再次洗滌后分別加入羊抗鼠Ig－FITC，室溫避光45 min;流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面STRO－1和CD146的表達(dá)水平。

1.2.2.3 PDLSCs多向分化能力鑒定

將多克隆來源的 PDLSCs細(xì)胞懸液，以5×104/mL的密度接種于6孔板中，用含100 mL/L FBS的 α－MEM培養(yǎng) 24 h，待細(xì)胞伸展至 60%匯合后，換礦化誘導(dǎo)液(含10 mmol/l β－甘油磷酸鈉、50 μg/mL維生素 C、1 ×10－8mol/L 地塞米松、100 mL/L FBS的α－MEM培養(yǎng)液)連續(xù)培養(yǎng)。鏡下觀察細(xì)胞復(fù)層生長并出現(xiàn)圓形結(jié)節(jié)后，繼續(xù)培養(yǎng)至21d，棄原培養(yǎng)液，去離子水反復(fù)漂洗，40g/L多聚甲醛固定30 min，用茜素紅染色。

將多克隆來源的 PDLSCs細(xì)胞懸液，以5×104/mL的密度接種于6孔板中，用含100 mL/L FBS的α－MEM培養(yǎng)2～3d，待細(xì)胞伸展至90%匯合后，換脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)液(含 1 μmol/LdEC、0.5 mmol/L IBMX、10 rng/L BPE、100 mmo1/L Indomethacin，100 mL/L FBS的 α－MEM 培養(yǎng)液)誘導(dǎo)3d，用含10 mg/L的牛胰島素、100 mL/L FBS的 α－MEM培養(yǎng)基處理1d，如此循環(huán)2次后，再用含10 mg/L的牛胰島素，100 mL/L FBS的 α－MEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)7d，每隔 3～4d換液1次。100 mL/L甲醛固定，油紅O染色。

1.2.3 PDLSCs細(xì)胞膜片的構(gòu)建

將對數(shù)生長期的第三代PDLSCs以胰酶消化，反復(fù)吹打使細(xì)胞充分分散制成細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液以1×105接種至90 mm培養(yǎng)皿，十字方向輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)皿，使細(xì)胞分散均勻，加入 10 mL α－MEM培 養(yǎng) 液 (含 100 U/mL維 生 素 C，100 mL/L FBS)。每3d換液1次，連續(xù)培養(yǎng)3周，于培養(yǎng)2周后，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞復(fù)層生長情況。

1.2.4 PDLSCs細(xì)胞膜片組織學(xué)檢查及其厚度測量

分別取培養(yǎng)1、2、3周PDLSCs細(xì)胞膜片置于40g/L多聚甲醛固定，甲酸－甲酸鈉復(fù)合脫鈣液脫鈣2～3d，常規(guī)脫水，石蠟包埋，連續(xù)切片，HE染色。分別在1、2、3周細(xì)胞膜片的組織學(xué)切片中隨機(jī)選5個(gè)點(diǎn)，根據(jù)標(biāo)尺測量其厚度并取平均值，此值即細(xì)胞膜片厚度。此部分最少重復(fù)5次。

1.2.5 PDLSCs細(xì)胞膜片掃描電鏡檢測

取培養(yǎng)2周牙周膜干細(xì)胞膜片與牙本質(zhì)片附合，并置于37℃、50 mL/L CO2飽和濕度條件下孵育3～5d，在0℃條件下25 mL/L戊二醛中固定，經(jīng)脫水和臨界點(diǎn)干燥后，于樣品表面噴鍍薄層金膜，最后在掃描電子顯微鏡下觀察細(xì)胞膜片表面情況。

1.2.6 PDLSCs細(xì)胞膜片細(xì)胞密度檢測

將PDLSCs以2×104/cm2接種在24孔板中，連續(xù)培養(yǎng)1、2、3 周后，毎孔加入100 μL MTT，37 ℃孵育4 h，中止培養(yǎng)，吸去上清培養(yǎng)液。每孔加入500 μLdMSO，振蕩15 min，使結(jié)晶物充分溶解后，毎孔分別吸取100 μL轉(zhuǎn)移到96孔板中，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔490 mm處的光吸收值，求均值。此部分最少重復(fù)5次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 PDLSCs的分離、鑒定

PDLSCs細(xì)胞形態(tài)呈長梭形類似成纖維樣細(xì)胞(圖1A)，一般可穩(wěn)定傳代至少在8代以上，具有很強(qiáng)的克隆形成能力［13－14］(圖1B)和成骨成脂多向分化能力(圖1D，E)，并且 PDLSCs陽性表達(dá)Stro－1 和 CD146(圖1C、F)。

2.2 PDLSCs細(xì)胞膜片形態(tài)學(xué)觀察

PDLSCs連續(xù)培養(yǎng)2周后，可在培養(yǎng)皿底部出現(xiàn)乳白色膜樣物質(zhì)，此即已經(jīng)形成的PDLSCs細(xì)胞膜片。將PDLSCs細(xì)胞膜片沿培養(yǎng)皿小心剝離時(shí)，可見細(xì)胞膜片中細(xì)胞與細(xì)胞的連接十分緊密，呈膜狀(圖2B)。完全剝離后的細(xì)胞膜片，呈現(xiàn)白色皺縮膜狀物并且具有一定厚度和強(qiáng)度(圖2C);倒置顯微鏡下清晰地觀察到細(xì)胞復(fù)層生長，呈典型的紡錘狀(圖2A)。HE染色可觀察到PDLSCs細(xì)胞膜片中細(xì)胞含量較高，細(xì)胞外基質(zhì)豐富，細(xì)胞與細(xì)胞的連接非常緊密(圖2D)。SEM可觀察到PDLSCs在細(xì)胞膜片表面伸展良好，細(xì)胞與細(xì)胞之間存在很好的連接，并形成了一張致密的膜片結(jié)構(gòu)(圖2E)。

2.3 PDLSCs細(xì)胞膜片厚度和細(xì)胞密度

PDLSCs在含有100 U/mL抗壞血酸的培養(yǎng)基里被連續(xù)培養(yǎng)1、2、3周，并且分別對PDLSCs細(xì)胞膜片中細(xì)胞密度、細(xì)胞膜片的厚度進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示在3周的細(xì)胞膜片仍有大量具有活性的細(xì)胞存在，但細(xì)胞密度在第2周時(shí)最大(圖3);并且細(xì)胞膜片厚度隨著天數(shù)的增加而增加，在起初的(48±3.2)μm 到3 周后的(69±3.4)μm，然而，在第2周時(shí)PDLSCs細(xì)胞厚度(64±3.3)μm變化最為明顯(圖4)。

圖1 PDLSCs的分離、鑒定

圖2 PDLSCs細(xì)胞膜片的檢測

圖3 PDLSCs細(xì)胞膜片活性檢測(各時(shí)間段間P＜0.05)

圖4 PDLSCs細(xì)胞膜片厚度檢測(各時(shí)間段間P＜0.05)

3 討論

由于PDLSCs的高增殖能力和多潛能性以及牙周膜臨床收集比較容易等特點(diǎn)［13－14，16］，使得PDLSCs 被廣泛應(yīng)用于組織工程領(lǐng)域［11－12，15－17］。隨著細(xì)胞膜片的發(fā)明［18］，PDLSCs細(xì)胞膜片也被引入到組織工程學(xué)中。理想的PDLSCs細(xì)胞膜片應(yīng)具備以下優(yōu)點(diǎn):①常規(guī)細(xì)胞的獲得是通過胰酶消化而得到的，因此會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的ECM和細(xì)胞與細(xì)胞之間的黏附蛋白被破壞，以及細(xì)胞表面活性的喪失。而細(xì)胞膜片則避免了胰酶的消化，從而保留了大量的ECM和細(xì)胞之間的黏附蛋白以及細(xì)胞表面活性［3－5，9］;②細(xì)胞膜片無需支架材料，避免了常規(guī)細(xì)胞被消化、接種于支架材料導(dǎo)致細(xì)胞的損失、無法保證材料上的細(xì)胞量和支架材料植入體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)等［19］。③細(xì)胞膜片具有彈性好，可塑性等特點(diǎn)，容易通過注射、包裹等進(jìn)行移植［8，20］;④最近有研究證實(shí)在細(xì)胞膜片培養(yǎng)過程中，細(xì)胞膜片可以產(chǎn)生血管內(nèi)皮增長因子(VEGF－A)［8］，這有利于細(xì)胞膜片在體內(nèi)的血管化，從而有利于組織的再生。但是，目前PDLSCs細(xì)胞膜片的制備方法各不相同，其穩(wěn)定、可靠的制備方法尚需進(jìn)一步研究。

在本實(shí)驗(yàn)中我們分離、培養(yǎng)、鑒定了人的PDLSCs并且成功構(gòu)建PDLSCs細(xì)胞膜片該細(xì)胞膜片持續(xù)培養(yǎng)3周仍有大量具有活性的細(xì)胞存在，但細(xì)胞密度在第2周時(shí)最大。同時(shí)還觀察到細(xì)胞在研究期間繼續(xù)產(chǎn)生膠原，其厚度由起初的(48±3.2)μm 到3周后的(69±3.4)μm，但在第2周細(xì)胞厚度(64±3.3)μm變化最大。對第2周PDLSCs細(xì)胞膜片的形態(tài)通過大體、倒置顯微鏡、HE和SEM進(jìn)行了觀察，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞隨機(jī)排列，呈長梭形、復(fù)層生長、細(xì)胞伸展充分、細(xì)胞與細(xì)胞之間連接緊密，還可觀察到細(xì)胞之間存在著大量ECM。以上數(shù)據(jù)提示連續(xù)培養(yǎng)2周是PDLSCs細(xì)胞膜片較為理想的體外培養(yǎng)時(shí)間。從而說明我們成功探索出一套穩(wěn)定、可靠的PDLSCs細(xì)胞膜片構(gòu)建方法，這為利用PDLSCs細(xì)胞膜片修復(fù)、再生牙周組織及牙周缺損提供了一定的技術(shù)保證。

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Construction of periodontal ligament stem cell sheet and characterization of its biological properties

NA Si－jia*，HUANG Fang，GUO Wei－h(huán)ua，GONG Kun，JIN Yan，LIde－chao
(*Department of Oral and Maxillofacial Surgery，College of Stomatology，Jiamusi University，Jiamusi 154004，China)

AIM:To construct periodontal ligament stem cell(PDLSC)sheet and characterize the biological property of the constructed sheet.METHODS:PDLSCs were obtained by collagenasedigestion of human periodontal ligament tissues.After identification，PDLSCs were subcultured to construct PDLSC sheet.Cell sheet was examined by inverted microscope，HE staining and scanning electron microscope.PDLSC sheet thickness and celldensity were assayed.RESULTS:After 2 weeks in vitro culture，a white membranaceous PDLSC sheet formed.Under inverted microscope，it was shown that PDLSCsgrew in multilayer and retained their fibroblastic spindle shape.Histological examination indicated abundant extracellular matrix(ECM)existed among the cells.By scanning electron microscopy，it was found that PDLSCs expanded adequately on the surface of PDLSC sheet and PDLSCs connected closely.Cell sheet thickness varied from an initial 48 ±3.2 μm to 69 ±3.4μm at 3 weeks.The cells in the cell sheet were shown to be viableduring the 3－week culture period，with the maximum cell number in the second week.CONCLUSION:We successfully established a stable and reliable method for constructing PDLSC sheet，which provided technological founda-tion for future studies in regeneration and repair of periodontal tissuedestruction.

periodontal ligament stem cells;cell sheet;extracellular matrix;tissue engineering

R780.2

A

1005－2593(2011)02－0077－06

2010－11－16;

2010－12－29

那思家(1984－)，男，滿族，黑龍江綏化人。碩士生(導(dǎo)師:李德超)

李德超，E －mail:dechaoli2004@yahoo.com.cn

金 巖，E －mail:yanjin@fmmu.edu.cn

·臨床經(jīng)驗(yàn)總結(jié)·