王國(guó)棟，徐科鳳，黃韌，鄭琰晶，陳 琳，林忠婷

（1.廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)所，廣州 510260；2.青島國(guó)家海洋科學(xué)研究中心，青島 266071）

隨著工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的迅速發(fā)展，大量的廢水和廢物排放入海，其中的重金屬在某一區(qū)域積累超過(guò)一定濃度時(shí)就會(huì)對(duì)海洋生物造成毒害作用。工業(yè)廢水、生活污水排放、石油泄漏和降雨等是水體中重金屬污染的主要來(lái)源［1］。重金屬對(duì)海洋生物特別是魚類毒害作用的研究已經(jīng)引起了科學(xué)家們的迫切關(guān)注［2-4］。銅是生物體酶必需的活性因子，其在生物體內(nèi)的含量甚微，但其濃度超過(guò)一定水平就會(huì)對(duì)生物體造成危害［5-7］。十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）是常用的陰離子表面活性劑，大量存在于各類洗滌劑和去污粉中，隨生活污水的大量排放，也會(huì)對(duì)環(huán)境造成一定的危害，同時(shí)它也是生化、免疫檢測(cè)方面常用的蛋白質(zhì)變性劑，毒性較大［8］，為美國(guó)試驗(yàn)材料協(xié)會(huì)（ASTM）推薦的生物毒性試驗(yàn)方法中常用標(biāo)準(zhǔn)毒物之一［9］。

裸項(xiàng)櫛鰕虎魚（Ctenogobius gymnauchen）為鱸形目（Perciformes）、鰕虎魚亞目（Gobioidei）、鰕虎魚科（Gobiidae）、鰕虎魚亞科（Gobiinae）、櫛鰕虎魚屬（Ctenogobius）的一種小型海洋魚類，分布于我國(guó)沿海，南至琉球、菲律賓一帶的礁石或沙泥底質(zhì)淺水區(qū)［10］。因其個(gè)體小，性成熟早，繁殖周期短，繁殖力強(qiáng)，便于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)飼養(yǎng)管理。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物指由人工培育，來(lái)源清楚，遺傳背景明確，對(duì)其攜帶的微生物和寄生蟲實(shí)施監(jiān)控，用于生命科學(xué)研究、藥品與生物制品生產(chǎn)和檢定、水環(huán)境污染評(píng)價(jià)以及其它科學(xué)研究的動(dòng)物［11］。鑒于裸項(xiàng)櫛鰕虎魚具有以上特性，故具有較高的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物開發(fā)價(jià)值。

2007—2008年度，裸項(xiàng)櫛鰕虎魚被選為 GB/T 18420.2-2001海洋石油勘探開發(fā)污染物的生物毒性檢驗(yàn)方法［12］修訂版中的新增物種，用于生物毒性檢測(cè)，因此有必要摸清其仔魚對(duì)標(biāo)準(zhǔn)毒物的耐受性，從而了解其對(duì)有關(guān)毒物的敏感性。其中，關(guān)于裸項(xiàng)櫛鰕虎魚對(duì)Cu2+和SDS的適應(yīng)能力在國(guó)內(nèi)外尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以不同日齡的裸項(xiàng)櫛鰕虎魚仔魚為研究對(duì)象，研究了仔魚在不同濃度 Cu2+和SDS下的存活率，初步探討了其對(duì)兩種標(biāo)準(zhǔn)毒物的適應(yīng)性，以期為新國(guó)標(biāo)的修訂提供一定的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)魚的來(lái)源

裸項(xiàng)櫛鰕虎魚親魚采集于深圳大鵬灣沿岸的天然水域，在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)經(jīng)人工培育達(dá)到性成熟，進(jìn)行人工繁殖獲得子代，作為本實(shí)驗(yàn)所用仔魚。

1.2 實(shí)驗(yàn)魚的馴化

實(shí)驗(yàn)用仔魚培養(yǎng)箱為白色塑料整理箱（規(guī)格50 cm×30 cm×40 cm），實(shí)際用水量40 L。仔魚孵出后投喂經(jīng)小球藻強(qiáng)化的褶皺臂尾輪蟲（Brachionus plicatilis）。馴養(yǎng)期間，實(shí)驗(yàn)用水為經(jīng)過(guò)砂濾和活性碳處理的自然海水，鹽度變化在32.6～35.3之間，pH變化在7.9～8.4之間，為保證培養(yǎng)箱中溶氧充足，用氣泵24 h充氣。光照和水溫與室內(nèi)自然節(jié)律一致，不進(jìn)行人為控制，水溫變化在 20.8℃ ～26.2℃之間。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

Cu2+急性毒性實(shí)驗(yàn)設(shè)置了8個(gè) Cu2+濃度水平，為0.012、0.021、0.035、0.06、0.102、0.173、0.294和0.5mg/L，分別以 C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7和C8表示；5個(gè)不同日齡，為4、8、12、16和20 d，分別以D4、D8、D12、D16和D20表示，二者交叉形成了40個(gè)組合，每個(gè)組合設(shè)4個(gè)重復(fù)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，按照6、12、24、48、72和96 h的時(shí)間間隔觀察計(jì)數(shù)仔魚的存活數(shù)。

SDS急性毒性實(shí)驗(yàn)設(shè)置了7個(gè)SDS濃度水平，為0.078、0.156、0.312、0.625、1.25、2.5和5 mg/L，分別以S1、S2、S3、S4、S5、S6和S7表示，每個(gè)處理設(shè)四個(gè)重復(fù)，實(shí)驗(yàn)用魚為4日齡，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，按照24、48、72和 96 h的時(shí)間間隔觀察計(jì)數(shù)仔魚的存活數(shù)。

1.4 實(shí)驗(yàn)管理

實(shí)驗(yàn)用養(yǎng)殖容器為1 L的玻璃燒杯，將馴養(yǎng)的裸項(xiàng)櫛蝦虎魚仔魚按照隨機(jī)撈取的方式由自然海水轉(zhuǎn)入以上各處理組，每杯放魚10尾，實(shí)驗(yàn)期間保持正常換水，日換水量為1/3，換水前1 d將實(shí)驗(yàn)用水24 h充氣。每天多次投喂褶皺臂尾輪蟲（經(jīng)小球藻和50 DE微囊輪蟲強(qiáng)化餌料強(qiáng)化），密度為10 ind/m L左右。水溫與光照條件與馴養(yǎng)期相同，不進(jìn)行人為控制，實(shí)驗(yàn)期間各燒杯均不充氣。

1.5 存活率的統(tǒng)計(jì)

按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)間點(diǎn)記錄各燒杯仔魚的存活數(shù)，并及時(shí)吸出死魚。仔魚死亡以魚體發(fā)白、心臟停止跳動(dòng)為準(zhǔn)。

1.6 計(jì)算與數(shù)據(jù)分析

Cu2+急性毒性實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)用方差分析及Duncan多重比較進(jìn)行分析處理，以 P ＜0.05作為差異顯著水平。所有數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析以 SPSS10.0軟件進(jìn)行。

SDS的急性毒性試驗(yàn)的數(shù)據(jù)處理采用概率單位法，根據(jù)死亡率查百分比與概率單位對(duì)照表得經(jīng)驗(yàn)概率單位，以經(jīng)驗(yàn)概率單位和濃度對(duì)數(shù)值作圖，根據(jù)回歸方程計(jì)算LC50［13］。

2 結(jié)果

2.1 Cu2+對(duì)裸項(xiàng)櫛鰕虎魚仔魚存活率的影響

不同濃度下，不同日齡裸項(xiàng)櫛鰕虎魚仔魚的存活率情況見表1，從中可以看出，Cu2+濃度對(duì)仔魚的存活率有顯著性影響（P＜0.05），隨濃度的升高，各組仔魚存活率顯著降低（P＜0.05），當(dāng)Cu2+濃度達(dá)到0.5 mg/L時(shí)，在實(shí)驗(yàn)開始6 h內(nèi)，各組仔魚均全部死亡。整體上，仔魚的存活率隨實(shí)驗(yàn)時(shí)間的延長(zhǎng)而下降，而隨日齡的增大存活率升高，其中96 h時(shí)S7處理組4 d仔魚存活率為0，而此時(shí)相同Cu2+濃度下20 d組仔魚的存活率高達(dá)42.5％。

表1 Cu2+對(duì)裸項(xiàng)櫛鰕虎魚仔魚存活率的影響Tab.1 The effect of Cu2+on survival rate of Bareneck goby larva

2.2 Cu2+對(duì)不同日齡裸項(xiàng)櫛鰕虎魚仔魚96 h的急性毒性影響

圖1為96 h不同日齡裸項(xiàng)櫛鰕虎魚仔魚在不同Cu2+濃度下的存活率，可以看出，各處理組仔魚存活率隨Cu2+濃度的升高而顯著降低（P ＜0.05），0.060 mg/L～0.500 mg/L處理組尤為明顯。整體上看，相同Cu2+濃度下，裸項(xiàng)櫛鰕虎魚仔魚存活率隨日齡的升高而升高，其中4日齡處理組存活率在各 Cu2+濃度下均比20日齡處理組低40％左右。

2.3 SDS對(duì)裸項(xiàng)櫛鰕虎魚仔魚的LC50及95％置信限

圖1 96 h時(shí)不同日齡裸項(xiàng)櫛鰕虎魚仔魚在各Cu2+濃度下的存活率；圖中同一日齡中帶有不同字母的數(shù)據(jù)表示差異顯著（P＜0.05）Fig.1 The survival rate of different daily age Bareneck goby larva at different Cu2+at 96 h；The data with different letter in the same daily agemeans significant difference each other（P＜0.05）

對(duì)裸項(xiàng)櫛鰕虎魚仔魚SDS毒性處理結(jié)果列于表2，24、48、72和96 h的SDS半致死濃度分別為1.278、1.116、0.783和0.432 mg/L，95％的置信區(qū)間分別為0.737～2.215 mg/L、0.626～1.987 mg/ L、0.383～1.603 mg/L和0.292～0.637 mg/L。

3討論

表2 SDS對(duì)裸項(xiàng)櫛鰕虎魚仔魚24 h、48 h、72 h和96 h的LC50及95％置信限Tab.2 LC50 and 95％confidence limits of Bareneck goby larva at different SDS at 24 h、48 h、72 h and 96 h

3.1 Cu2+對(duì)裸項(xiàng)櫛鰕虎魚仔魚存活率的影響

魚類的早期生活史階段是對(duì)污染物比較敏感的階段［14］。關(guān)于重金屬對(duì)魚類早期生活史階段的毒害效應(yīng)，已有學(xué)者作了一定的工作［15-18］。了解重金屬對(duì)海洋魚卵孵化和仔稚魚成活的毒性規(guī)律，對(duì)于防止海洋污染，保護(hù)水產(chǎn)資源和發(fā)展綠色健康海水養(yǎng)殖業(yè)具有重要的意義。重金屬對(duì)小型魚類的毒性影響研究主要集中在斑馬魚、綿羊頭鰷魚、月銀漢魚、日本青鳉（Oryzias latipes）及黑頭軟口鰷（Pimephales promelas）上，這幾種魚都是毒性試驗(yàn)方法中常用的受試魚，研究證明這些魚在早期階段對(duì)重金屬的敏感性普遍都高于成魚期［19-24］。

國(guó)內(nèi)外學(xué)者在Cu2+對(duì)魚類的致毒機(jī)理方面進(jìn)行過(guò)相關(guān)研究。Mazon等［25］指出 Cu2+可引起美洲熱帶魚Prochilodus scrofa鰓的扁平上皮細(xì)胞和氯細(xì)胞增生肥大，血-水屏障增厚，而導(dǎo)致魚的呼吸困難甚至死亡。由于Cu2+抑制鰓Na+-K+-ATPase活性或者是殺死鰓上的起離子傳輸作用的成熟氯細(xì)胞群［26］從而破壞了魚體水氣交換機(jī)制［27］。Laurén等［28］報(bào)道 55μg/L Cu2+會(huì)使得虹鱒魚（Sa lmon gairdneri）鰓絲 Na+-K+-ATPase酶活性下降33％，鰓的能量利用和酸調(diào)節(jié)功能喪失或受阻。Nemcsók等［29］報(bào)道虹鱒魚在2mg/L Cu2+溶液中暴露24 h后，血液中 ASAT（天門冬氨酰轉(zhuǎn)氨酶）和ALAT（丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶）和AChE（乙酰膽堿酯酶）活力分別增加2倍、4.5倍和1.2倍，肝糖水平增加3.2倍，表明鰓、腎臟和肝臟受到損傷。Gail等［30］報(bào)道莫桑比克羅非魚（Oreochrom is mossambicus）在0.4mg/L Cu2+暴露28d后，血液白細(xì)胞數(shù)量增加而紅細(xì)胞數(shù)量減少，且滲透調(diào)節(jié)能力受到抑制，說(shuō)明Cu2+對(duì)其代謝過(guò)程產(chǎn)生了毒性作用。霓紅魚（Paracheirodom innesi）對(duì)Cu2+的吸收與環(huán)境暴露濃度呈線性關(guān)系，環(huán)境暴露濃度越高，進(jìn)入魚鰓、肌肉、肝臟中的重金屬離子量越多［31］。不同形態(tài)的Cu2+在彩虹方頭魚魚體和魚鰓中的積累量均隨水相游離 Cu2+濃度增高、暴露時(shí)間增長(zhǎng)而增加［32］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在本實(shí)驗(yàn)條件下裸項(xiàng)櫛鰕虎魚仔魚的存活率受 Cu2+影響顯著，對(duì) Cu2+的毒性具有很高的敏感性。毒性敏感性與仔魚的日齡負(fù)相關(guān)：日齡愈小，敏感性愈高。

3.2 SDS對(duì)裸項(xiàng)櫛鰕虎魚仔魚存活率的影響

作為為美國(guó)試驗(yàn)材料協(xié)會(huì)推薦的生物毒性試驗(yàn)方法中常用標(biāo)準(zhǔn)毒物之一，SDS對(duì)魚類具有一定的毒性。SDS對(duì)魚類的96 hLC50通常都在0.59～38 mg/L［33-35］。值得注意的是，檢測(cè)條件不同，可能導(dǎo)致SDS的毒性數(shù)據(jù)出現(xiàn)明顯的差異。例如，在Fogels［33］的試驗(yàn)中，SDS對(duì)虹鱒的96hLC50為4.62 mg/L，而Buhl等［34］測(cè)的數(shù)值則為24.9 mg/L，遠(yuǎn)高于前者，Vijayan等［35］測(cè)得的數(shù)據(jù)甚至達(dá)到38 mg/ L。這種差異主要?dú)w因于測(cè)定溫度和魚類發(fā)育階段的不同。另外，實(shí)驗(yàn)中采用的觀測(cè)指標(biāo)不同也會(huì)對(duì)SDS的毒性數(shù)據(jù)產(chǎn)生影響。例如，Chen等［36］在用日本青鳉（Oryzias latipes）評(píng)估電鍍廢水的毒性時(shí)，將SDS作為參比毒物，獲得SDS對(duì)幼魚的96h LC50為12.5 mg/L。SDS對(duì)草魚（Ctenopharyngodon idellus）的48 h和96 hLC50分別為11.8 mg/L和5.2 mg/L，且 SDS對(duì)草魚抗氧化酶有顯著影響，對(duì)草魚鰓、血清和腎臟等細(xì)胞組織有明顯的毒性效應(yīng)［37］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果 24 h～96 h的 LC50變化在0.4315～1.2777 mg/L之間，低于上述各魚的SDSLC50濃度，這可能與實(shí)驗(yàn)對(duì)象的種間差異有關(guān)，本實(shí)驗(yàn)對(duì)象裸項(xiàng)櫛鰕虎魚為海水性魚類，且均為初孵仔魚，故相對(duì)具有更高的敏感性，這也正是新國(guó)標(biāo)選用其作為標(biāo)準(zhǔn)生物的原因之一。根據(jù)化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則［38］，本實(shí)驗(yàn)SDS對(duì)裸項(xiàng)櫛鰕虎魚的毒性屬于高毒性～中毒性。有研究表明國(guó)標(biāo)GB/T 18420.2-2001海洋石油勘探開發(fā)污染物的生物毒性檢驗(yàn)方法中選用的標(biāo)準(zhǔn)物種中，鹵蟲（Artem ia parthenogenetica）對(duì)SDS 96h的 LC50為13.9 mg/L，蒙古裸腹蚤（Moina mongolica Daday）對(duì) SDS 72 h的 LC50為 3.5 mg/L［39］，脊尾白蝦（Palaemon carincauda）仔蝦對(duì) SDS 96 h的 LC50為14.3 mg/L［40］。本實(shí)驗(yàn)對(duì)象裸項(xiàng)櫛鰕虎魚仔魚與上述標(biāo)準(zhǔn)生物相比具有更高的生物敏感性，且隨日齡的變化其耐受力增長(zhǎng)，故裸項(xiàng)櫛鰕虎魚仔魚被用于生物毒性檢測(cè)，具有更寬的適用范圍。

3.3 裸項(xiàng)櫛鰕虎魚仔魚對(duì)標(biāo)準(zhǔn)毒物耐受性的評(píng)價(jià)

裸項(xiàng)櫛鰕虎魚被選為國(guó)標(biāo)“海洋石油勘探開發(fā)污染物的生物毒性檢驗(yàn)方法”修訂版中的新增物種，用于生物毒性檢測(cè)，需要其對(duì)相關(guān)毒性物質(zhì)具有較寬的敏感性，以便對(duì)多種不同毒性程度的海洋石油勘探開發(fā)污染物進(jìn)行毒性評(píng)估。本實(shí)驗(yàn)條件下，裸項(xiàng)櫛鰕虎魚仔魚恰恰對(duì)標(biāo)準(zhǔn)毒物顯示出了很高的敏感性，驗(yàn)證了不同日齡仔魚用于海洋生物毒性檢測(cè)的適宜性。即，選用不同日齡的裸項(xiàng)櫛鰕虎魚仔魚就能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)不同毒性污染物的生物毒性檢測(cè)。因此，裸項(xiàng)櫛鰕虎魚仔魚用于海洋石油勘探開發(fā)污染物生物毒性檢測(cè)是切實(shí)可行且適宜的。

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