亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        水生實(shí)驗(yàn)動(dòng)物劍尾魚的DNA指紋圖譜構(gòu)建

        2011-02-01 09:28:38全迎春劉宇飛白俊杰
        關(guān)鍵詞:實(shí)驗(yàn)

        全迎春,劉宇飛,2,白俊杰

        (1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所,廣州 510380;2.上海靖麗信息科技有限公司,上海 200235)

        劍尾魚(Xiphophorus hellerii)又名青劍、劍魚,屬花鳉科(Opecilidae),是小型熱帶淡水魚。具有食性雜、繁殖周期短、適應(yīng)性強(qiáng),容易飼養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)[1,2]。研究調(diào)查結(jié)果顯示劍尾魚對(duì)多種農(nóng)藥、重金屬等毒物較敏感,還對(duì)某些魚類病原體敏感性強(qiáng),以及存在盲眼、畸形等諸多突變性狀,適合作為動(dòng)物模型[1-3]。1987年,珠江水產(chǎn)研究所開始了劍尾魚實(shí)驗(yàn)動(dòng)物化研究,通過定向培育和系統(tǒng)研究,育成RRB(紅眼紅體)、RW-H(紅眼白體)、BY-F(黑眼橘紅體)三個(gè)品系[1,3]。其中代表品系RR-B系劍尾魚近交達(dá)30代,通過了全國(guó)水產(chǎn)原種和良種審定委員會(huì)審定,農(nóng)業(yè)部第348號(hào)公告公布:劍尾魚RR-B系是適用于水環(huán)境監(jiān)測(cè)[4]、水產(chǎn)藥物安全性評(píng)價(jià)[5]、化學(xué)品毒性檢測(cè)[6]、動(dòng)物疾病檢驗(yàn)?zāi)P停?]及遺傳生物學(xué)研究[8]等領(lǐng)域的水生實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。

        傳統(tǒng)的品種鑒定方法存在很多不足,且易受環(huán)境影響、不能鑒定基因混雜程度等,而DNA指紋圖譜直接反映品種之間以及個(gè)體之間基因組序列的差異,具有多位點(diǎn)性、高變異性、簡(jiǎn)單而穩(wěn)定的遺傳性,近年來引起人們的重視,表現(xiàn)出巨大的實(shí)用價(jià)值[9]。劍尾魚作為一種重要的水生實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,其種質(zhì)資源的鑒定方法仍有待完善,因此,本研究應(yīng)用擴(kuò)增穩(wěn)定、清晰的46個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn),對(duì)RR-B系(紅眼紅體)、RW-H系(紅眼白體)、野生種三個(gè)品系劍尾魚進(jìn)行DNA指紋圖譜構(gòu)建,并將形成的數(shù)字化指紋輸入珠江水產(chǎn)研究所魚類種質(zhì)鑒定軟件V1.0形成種質(zhì)鑒定數(shù)據(jù)庫(kù)。該圖譜不僅能呈現(xiàn)出劍尾魚的遺傳概貌,用于劍尾魚選育系及其野生品種的鑒定,而且也為水生實(shí)驗(yàn)動(dòng)物劍尾魚的品種選育和知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)提供理論依據(jù)。

        1 材料和方法

        1.1 實(shí)驗(yàn)魚

        RR-B系劍尾魚30尾(雌雄各15尾),從珠江水產(chǎn)研究所水生實(shí)驗(yàn)動(dòng)物培育基地隨機(jī)抽?。籖WH系劍尾魚30尾(雌雄各15尾),取自珠江水產(chǎn)研究所水生實(shí)驗(yàn)動(dòng)物培育基地,已選育至15代;野生型劍尾魚(非選育群體)購(gòu)自廣州觀賞魚市場(chǎng)。

        1.2 基因組DNA樣品的制備

        取劍尾魚背鰭約10 mg,參考《分子克隆試驗(yàn)指南》[10]方法提取基因組DNA。0.8%瓊脂糖電泳檢測(cè)DNA的完整性和純度并用紫外分光光度計(jì)(Eppendorf BioPhotometer)檢測(cè)其濃度,-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

        1.3 微衛(wèi)星引物合成、PCR擴(kuò)增及電泳

        參考已報(bào)道的文獻(xiàn)[11-12]及劍尾魚中心網(wǎng)站中有關(guān) 微 衛(wèi) 星 的 數(shù) 據(jù) (www.xiphophorus.org/-m icrosats/microsat.htm),選取有多態(tài)性的微衛(wèi)星引物50對(duì),由上海英駿公司合成。PCR反應(yīng)總體系為10μL,含有10×Buffer 1.0μL,MgCl2(25 mmol/L) 0.3~0.6μL,dNTPs(10 mmol/L)0.2μL,上、下游引物(20 mmol/L)各 0.5μL,Taq酶 0.5 U,模板DNA 50 ng左右。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性3 m in后進(jìn)入循環(huán)體系,94℃變性30 s,各引物退火溫度48~60℃,退火時(shí)間30 s,72℃延伸45 s,25個(gè)循環(huán),最后72℃延伸7 min。以8%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,取3μL產(chǎn)物電泳,硝酸銀染色,染色方法參照文獻(xiàn)[13]。

        1.4 微衛(wèi)星位點(diǎn)的篩選

        以8尾野生劍尾魚的 DNA樣本為模板,調(diào)節(jié)PCR的溫度(48℃ ~60℃)、鎂離子濃度(終濃度0.5~1.5 mmol/L),使PCR達(dá)到最佳擴(kuò)增效果。挑選擴(kuò)增效果穩(wěn)定,電泳條帶清晰的微衛(wèi)星位點(diǎn)用于劍尾魚DNA指紋圖譜的構(gòu)建。

        1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

        PCR產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳,銀染顯帶后用掃描儀掃描,根據(jù)凝膠上DNA泳動(dòng)距離,用Gel-pro analyzer 4.5軟件分析條帶大小。統(tǒng)計(jì)劍尾魚個(gè)體在各個(gè)位點(diǎn)的條帶大小,用Excel軟件繪制散點(diǎn)圖,從而形成3個(gè)群體的指紋圖譜模式圖。選取在3個(gè)劍尾魚品系中具有特異擴(kuò)增條帶的5對(duì)微衛(wèi)星引物形成數(shù)字化指紋,以便于3個(gè)品系及其雜交種的鑒定。

        2 結(jié)果

        2.1 劍尾魚RR-B系、RW-H系及野生群體的微衛(wèi)星擴(kuò)增結(jié)果

        用8尾劍尾魚個(gè)體進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn),篩選合成的50對(duì)引物,經(jīng)PCR條件優(yōu)化,選取擴(kuò)增結(jié)果穩(wěn)定、條帶清晰的引物,共篩選出46對(duì)引物。然后使用這些微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)劍尾魚RR-B系、RW-H系及野生群體進(jìn)行基因組掃描,46個(gè)位點(diǎn)在3個(gè)群體中共找到等位基因106個(gè),平均每個(gè)位點(diǎn)2.3個(gè),部分?jǐn)U增結(jié)果見圖1。

        微衛(wèi)星標(biāo)記遵循孟德爾遺傳法則,呈共顯性遺傳,因此能很好的區(qū)分純合子和雜合子。如圖1中,微衛(wèi)星位點(diǎn)Msc036具有3種等位基因型,純合個(gè)體僅擴(kuò)增出其中一條帶型,雜合個(gè)體則可擴(kuò)增出其中二條帶型,圖中RR-H系劍尾魚在位點(diǎn)Msc036為純合。結(jié)果發(fā)現(xiàn)劍尾魚 RR-B系在42個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)上表現(xiàn)為純合、單態(tài)性,等位基因純合率為91.3%; RW-H系則為43個(gè)位點(diǎn)純合、單態(tài)性,等位基因純合率為且為93.5%;而這些野生群體在這些位點(diǎn)(除位點(diǎn)Msb030外)則表現(xiàn)為雜合,反映出這2個(gè)選育系已經(jīng)具有了很高的遺傳純度。

        圖1 劍尾魚3個(gè)群體在微衛(wèi)星位點(diǎn)Msc036的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoregram of locus Msd036 in three swordtail fish populations

        2.2 劍尾魚微衛(wèi)星DNA指紋圖譜模式圖構(gòu)建

        采用Excel軟件,根據(jù)46對(duì)微衛(wèi)星引物在3個(gè)劍尾魚群體中PCR擴(kuò)增條帶的大小,繪制劍尾魚微衛(wèi)星DNA指紋圖譜模式圖(見圖2~4)。

        圖2 劍尾魚RR-B系的微衛(wèi)星DNA指紋圖譜Fig.2 DNA fingerprinting of RR-B strain of Xiphophorus helleri using Microsatellites

        圖3 劍尾魚RW-H系的微衛(wèi)星DNA指紋圖譜Fig.3 DNA fingerprinting of RW-H strain of Xiphophorus helleri using M icrosatellites

        圖4 劍尾魚非選育系的微衛(wèi)星DNA指紋圖譜Fig.4 DNA fingerprinting of wild Xiphophorus helleri using Microsatellites

        2.3 劍尾魚品系鑒定標(biāo)記及其數(shù)字化指紋

        選取在劍尾魚RR-B系、RW-H系和非選育系中具有特異擴(kuò)增條帶的5對(duì)微衛(wèi)星引物,根據(jù)擴(kuò)增條帶的大小,有帶的記為1,無帶的記為0,形成每個(gè)品系對(duì)應(yīng)的數(shù)字化指紋,具體數(shù)據(jù)見表1。

        表1 劍尾魚特異微衛(wèi)星標(biāo)記的數(shù)字化指紋Tab.1 The digital fingerprint of Xiphophorus helleri on strain-specialm icrosatellite loci

        2.4 劍尾魚DNA指紋圖譜鑒定數(shù)據(jù)及軟件應(yīng)用

        珠江水產(chǎn)研究所魚類種質(zhì)鑒定軟件 V1.0 (PRIFRI1.0)是由珠江水產(chǎn)研究所根據(jù)魚類 DNA指紋數(shù)據(jù)特點(diǎn)開發(fā)的魚類種質(zhì)鑒定軟件,已獲得軟件著作權(quán)(證書號(hào)2010SR026776)。將劍尾魚數(shù)字化指紋數(shù)據(jù)根據(jù)軟件要求整理成DNA指紋圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)(如圖5所示),該軟件可從已建立的劍尾魚指紋圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)中挑選任意幾個(gè)位點(diǎn)所形成的數(shù)字化指紋作為標(biāo)準(zhǔn),以EXCEL形式導(dǎo)入軟件,應(yīng)用軟件中已嵌入的計(jì)算公式,經(jīng)基因頻率、遺傳相似度等計(jì)算,快速準(zhǔn)確的鑒定的某一未知個(gè)體與各已知品系的相似度并確定其種群分類歸屬。

        以劍尾魚RR-B系的第一個(gè)個(gè)體在其中5個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)(Msa007、Msa008、Msa010、Msa012和Msa014)的數(shù)據(jù)“11000 010 01 010 10000”為例,輸入該軟件后,運(yùn)行軟件,結(jié)果如下圖所示:

        圖5 劍尾魚DNA指紋數(shù)據(jù)庫(kù)示意圖Fig.5 Part of the DNA fingerprinting database of Xiphophorus helleri

        圖6 劍尾魚種質(zhì)資源鑒定軟件的運(yùn)行示意圖Fig.6 The software operation schematic of Xiphophorus germplasm resources appraisal software,PRIFRI1.0

        3 討論

        實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是醫(yī)學(xué)、生命科學(xué)研究的基礎(chǔ)和重要支撐條件,在疾病模型的構(gòu)建、藥物安全性評(píng)價(jià)、環(huán)境污染監(jiān)測(cè)、發(fā)育生物學(xué)、分子生物學(xué)等眾多領(lǐng)域發(fā)揮著越來越重要的作用,劍尾魚在應(yīng)用中具有明顯的特色與優(yōu)勢(shì),具有廣闊的應(yīng)用前景。近交系動(dòng)物中微衛(wèi)星長(zhǎng)度變化發(fā)生率很低,近交系實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的顯著特征是基因純合性及遺傳穩(wěn)定性,用于實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好,可比性強(qiáng),微衛(wèi)星位點(diǎn)的等位基因則可成為某一近交系動(dòng)物的恒定參數(shù)[14-15]。

        劍尾魚種質(zhì)資源監(jiān)測(cè)及近交系純度鑒定是劍尾魚作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的基礎(chǔ)。微衛(wèi)星DNA是對(duì)DNA的直接反應(yīng),要比生化標(biāo)記更準(zhǔn)確、可靠,已經(jīng)廣泛應(yīng)用到大小鼠、倉(cāng)鼠、沙鼠、家兔、犬、猴和豬等常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的遺傳監(jiān)測(cè)當(dāng)中[16-17]。本研究構(gòu)建的微衛(wèi)星DNA指紋圖譜可以用作劍尾魚品種鑒定,這幾個(gè)品系間具有特異擴(kuò)增條帶的5個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記將較好的用于區(qū)分劍尾魚的不同品系,同時(shí)PRIFRI1.0軟件的應(yīng)用也將簡(jiǎn)化種質(zhì)鑒定步驟。另一方面微衛(wèi)星DNA指紋也可用于劍尾魚品系的純度檢測(cè)。歐陽(yáng)兆和等[18]用14個(gè)微衛(wèi)星DNA對(duì)10個(gè)近交系小鼠多態(tài)分析表明,這些微衛(wèi)星DNA在同一品系不同個(gè)體間表現(xiàn)為單態(tài)性,在不同品系間表現(xiàn)為多態(tài)性,可快速、經(jīng)濟(jì)的對(duì)近交系小鼠進(jìn)行遺傳檢測(cè)和純度鑒定。本研究中46個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記擴(kuò)增的結(jié)果顯示,在野生型劍尾魚中表現(xiàn)為多態(tài)性的46個(gè)微衛(wèi)星DNA標(biāo)記,在RR-B系和RW-H系中分別有42和43個(gè)標(biāo)記表現(xiàn)為單態(tài),基因純合率為91.3%、93.5%。這與李凱彬用生化標(biāo)記方法檢測(cè)出結(jié)果一致[8],也證明了微衛(wèi)星標(biāo)記在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物遺傳監(jiān)測(cè)中應(yīng)用的可行性。

        [1]吳淑勤,黃志斌.水生實(shí)驗(yàn)動(dòng)物——?jiǎng)ξ掺~[M].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,2005.

        [2]黃志斌,吳淑勤,石存斌,等.劍尾魚的若干生物學(xué)特性研究[J].中國(guó)水產(chǎn)科學(xué),2000,7(3):107-109.

        [3]Wu S,Huang Z,Yu R,et a1.Approach for the app lication of Xiphophorus helleri as experiment anima1[C].Proceeding of the Fourth Asian Fisheries Forum,1995.101-107.

        [4]王春鳳,方展強(qiáng).汞和硒對(duì)劍尾魚的急性毒性及其安全濃度評(píng)價(jià)[J].環(huán)境科學(xué)與技術(shù),2005,28:32-35.

        [5]聶湘平,王翔,李凱斌,等.抗生素藥物環(huán)丙沙星對(duì)劍尾魚的毒性效應(yīng)[J].中山大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2007,46(5):70 -73.

        [6]常藕琴,石存斌,潘厚軍,等.劍尾魚硫酸銅急性中毒的病理學(xué)研究[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2005,26(7):82-85.

        [7]潘厚軍,吳淑勤,李凱彬,等.劍尾魚在檢測(cè)細(xì)菌毒力方面的應(yīng)用[J].水產(chǎn)學(xué)報(bào),2000,24(5):467-471.

        [8]李凱彬,姜蘭,潘厚軍,等.RR-B系劍尾魚LDH和GDH同工酶的分析[J].中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志,2004,13(3):46-50.

        [9]王忠華.DNA指紋圖譜技術(shù)及其在作物品種資源中的應(yīng)用[J].分子植物育種,2006,4(3):425-430.

        [10]薩姆布魯克,弗里奇,曼尼阿蒂斯.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南:第2版[M].北京:科學(xué)出版社,1999.

        [11]李霞,白俊杰,吳淑勤,等.劍尾魚RW-H近交系的遺傳結(jié)構(gòu)分析[J].水產(chǎn)學(xué)報(bào),2004,28(4):365-370.

        [12]李霞,白俊杰,吳淑勤,等.劍尾魚微衛(wèi)星DNA的篩選[J].中國(guó)水產(chǎn)科學(xué),2004,11:196-201.

        [13]張春雷,佟廣香,匡友誼,等.微衛(wèi)星產(chǎn)物變性與非變性PAGE-銀染方法比較[J].水產(chǎn)學(xué)雜志,2010,23(1):11-14.

        [14]Dallas JF.Estimation of microsatelite mutation rates in recombinant inbred strains ofmouse[J].Mammalian Genome,1992,3:452-456.

        [15]Martinez AM ,Delgado JV,Roder A.Genetic structure of the Ibereian pig breed using microsatellites[J].Animal Genetics,2000,31:295-301.

        [16]李瑞生,胡娟峰,曾林,等.微衛(wèi)星DNA標(biāo)記在常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物遺傳多態(tài)性的研究進(jìn)展[J].中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志,2008,10:81 -81.

        [17]李瑞生,陳振文,李曉娟,等.微衛(wèi)星DNA標(biāo)記在常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物遺傳監(jiān)測(cè)中的分析[J].中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志,2010,10:75 -76.

        [18]歐陽(yáng)兆和,陳振文,李瑞生等.微衛(wèi)星DNA多態(tài)性在十種近交系小鼠遺傳監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用研究[J].中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志,2004,14(2):71-74.

        猜你喜歡
        實(shí)驗(yàn)
        我做了一項(xiàng)小實(shí)驗(yàn)
        記住“三個(gè)字”,寫好小實(shí)驗(yàn)
        我做了一項(xiàng)小實(shí)驗(yàn)
        我做了一項(xiàng)小實(shí)驗(yàn)
        記一次有趣的實(shí)驗(yàn)
        有趣的實(shí)驗(yàn)
        微型實(shí)驗(yàn)里看“燃燒”
        做個(gè)怪怪長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)
        NO與NO2相互轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)的改進(jìn)
        實(shí)踐十號(hào)上的19項(xiàng)實(shí)驗(yàn)
        太空探索(2016年5期)2016-07-12 15:17:55
        国产爆乳美女娇喘呻吟久久| 国产丝袜无码一区二区三区视频| 亚洲最大天堂无码精品区| 国产伦码精品一区二区| 中文字幕色资源在线视频| 国产乡下妇女做爰| 亚洲精品无码mv在线观看 | 一本一道av无码中文字幕| 中文字幕亚洲精品第1页| 国产情侣自拍偷拍精品| 亚洲av无码乱码国产麻豆| 亚洲精品字幕| 日本a在线免费观看| 一本到亚洲av日韩av在线天堂| 亚洲av午夜成人片精品电影| 97se亚洲国产综合自在线| 亚洲熟妇大图综合色区| 精品国产亚洲av高清日韩专区 | 永久免费人禽av在线观看 | 日韩无码无播放器视频| 日本一区不卡高清在线观看| 亚洲av无一区二区三区| 中出人妻中文字幕无码| 欧美成人在线A免费观看| 国产午夜在线观看视频| 欧美日韩午夜群交多人轮换| 精品人妻一区二区三区四区| 97av在线播放| 国产交换精品一区二区三区| 人人妻一区二区三区| 国产91成人精品亚洲精品| 成人影院免费视频观看| 少妇精品亚洲一区二区成人| av香港经典三级级 在线| 久久夜色精品国产亚洲噜噜| 91九色熟女潮喷露脸合集| 国产成人精品白浆久久69| 激情五月天伊人久久| 91精品蜜桃熟女一区二区| 99麻豆久久久国产精品免费| 全免费a级毛片免费看视频|