朱赤紅 杜靈彬 高 赟 錢麗娟 顧琳慧 浙江省腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所 杭州 310222曹明富 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院

油菜花粉脂溶性提取物對前列腺癌細(xì)胞生長抑制的實(shí)驗(yàn)研究

朱赤紅 杜靈彬 高 赟 錢麗娟 顧琳慧 浙江省腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所 杭州 310222曹明富 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院

目的：研究油菜花粉脂溶性提取物（BPE）對體外培養(yǎng)的人前列腺癌細(xì)胞的殺傷效應(yīng)。方法：以人前列腺癌細(xì)胞PC-3和DU-145為研究對象，光鏡觀察用藥前后細(xì)胞形態(tài)，透射電鏡觀察細(xì)胞凋亡的形態(tài)變化；CCK-8法測定油菜花粉脂溶性提取物對細(xì)胞生長抑制率，流式細(xì)胞術(shù)檢測BPE對PC-3和DU-145細(xì)胞周期的影響。結(jié)果：不同濃度油菜花粉脂溶性提取物（BPE）對兩株前列腺癌細(xì)胞有明顯的抑制作用；形態(tài)學(xué)觀察BPE處理后的前列腺癌細(xì)胞出現(xiàn)顯著改變；流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示:PC-3及DU-145細(xì)胞在油菜花粉脂溶性提取物處理48h后，細(xì)胞周期出現(xiàn)變化，G0/G1期比例上升，S期和G2-M期比例下降。結(jié)論：油菜花粉脂溶性提取物對兩株前列腺癌細(xì)胞的生長有明顯的抑制作用。

油菜花粉脂溶性提取物 人前列腺癌細(xì)胞 生長抑制 腫瘤

研究表明，花粉及其組分具有抗腫瘤、抗氧化性、治療前列腺疾病、降血脂及增強(qiáng)機(jī)體免疫能力等多種生理功能。本研究選用純度較高的油菜花脂溶性提取物，作用于兩株人激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞，觀察其對前列腺癌細(xì)胞的抑制效應(yīng)和形態(tài)學(xué)變化，為后續(xù)進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究打下基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 細(xì)胞株 非激素依賴型前列腺癌細(xì)胞PC-3和DU-145（中國科學(xué)院上海細(xì)胞所）。

1.2 藥 物 花粉脂溶性提取物（Brassica campestris pollen extract,BPE）（浙江康恩貝制藥公司提供）；F-12培養(yǎng)基（Gibco公司）；新生小牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）；碘化丙啶（PI）（Sigma公司）；CCK-8試劑盒（株式會(huì)社同仁化學(xué)研究所DOJI NDO）；DNA REAGENT KIT試劑盒（美國BD公司）。

1.3 主要儀器 CO2培養(yǎng)箱（德國HERAEUS B5060EU公司）；流式細(xì)胞儀FAC SCailibur（美國BD公司）；萬能倒置顯微鏡OLYMPUS JMT-2和H-600型電子顯微鏡（日本OLYMPUS）；全波長酶標(biāo)儀MSS（美國Thermo公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人前列腺癌細(xì)胞PC-3和DU-145用F-12培養(yǎng)基培養(yǎng)，內(nèi)含15%新生小牛血清，100U/mL青霉素、100U/mL鏈霉素、10μg/mL氫化考的松以及0.01U/mL胰島素。置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)時(shí)選用對數(shù)生長期細(xì)胞。

2.2 藥物配制方法 臨用時(shí)稱取油菜花粉脂溶性提取物（030401 AA08）適量，DMSO助溶，DMSO最高濃度為0.08%。再用F-12培養(yǎng)液稀釋成不同濃度藥液組。

2.3 BPE對PC-3和DU-145細(xì)胞增殖抑制作用的影響 實(shí)驗(yàn)采用CCK-8的方法，取對數(shù)生長期的PC-3和DU-145細(xì)胞，制成1×105/mL的細(xì)胞懸液，以每孔100μL細(xì)胞懸液接種于96孔板上，約1×104/孔，另外每孔加100μL新鮮F-12培養(yǎng)液，總量200μL/孔。每個(gè)濃度組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。置于37℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，按組別換入不同濃度的藥液，最高濃度為4000μg/mL，以2倍濃度稀釋，共8個(gè)濃度梯度。對照組換入等體積F-12培養(yǎng)液。待藥物作用48h后，加入CCK-8 10μL/孔,37℃培養(yǎng)箱孵育3h后，在酶聯(lián)免疫測定儀上檢測吸光度（OD值），采用雙波長測定，檢測波長450nm，參比波長630nm。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。抑制率（IR）按下列公式計(jì)算：細(xì)胞增殖抑制率（IR）＝（陰性對照組平均OD值－處理組平均OD值）/陰性對照組平均OD值×100%。

2.4 光鏡和透射電鏡觀察細(xì)胞形態(tài) PC-3和DU-145細(xì)胞前期處理同前。1000μg/mL藥物作用48h后，取對照和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的培養(yǎng)瓶，顯微鏡下觀察并攝影。藥物作用后收集，2.5%戊二醛固定、1%鋨酸固定、丙酮梯度脫水、環(huán)氧樹脂浸透、包埋、超薄切片、以鈾、鉛雙重染色法染色，在H-600型電子顯微鏡下觀察形態(tài)并攝影。

2.5 流式檢測 取BPE刺激過的PC-3和DU-145細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)本處理，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×106/ml的單細(xì)胞懸液。800rpm/min離心5min，去上清后加PBS 2mL，混勻離心洗滌2次，棄上清，邊震蕩邊滴入70%乙醇固定，再離心去上清后，按DNA REAGENT KIT試劑盒操作說明進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。流式細(xì)胞儀采集窗內(nèi)10 000個(gè)細(xì)胞，用Modfit LT 2.0軟件分析細(xì)胞周期。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 不同濃度BPE對前列腺癌細(xì)胞抑制率的影響隨著BPE濃度的升高，細(xì)胞的抑制率（IR）皆呈上升趨勢，在一定濃度范圍內(nèi)（0～1000μg/mL）隨著BPE濃度的增大，細(xì)胞的抑制率越高（F=22.33～197.32,P均＜0.01）。在BPE濃度為1000μg/mL時(shí)，PC-3、DU-145細(xì)胞的抑制率均達(dá)到最高，分別為74.19%、72.77%。但當(dāng)濃度繼續(xù)升高時(shí)，前列腺癌細(xì)胞的抑制率反而下降。抑制率下降的程度隨腫瘤細(xì)胞株的不同而不同，在BPE濃度為4000μg/mL時(shí)，PC-3及DU-145細(xì)胞的抑制率分別下降至28.95%和38.47%。不同濃度的BPE處理對腫瘤細(xì)胞的抑制率的影響結(jié)果表明，兩株前列腺癌細(xì)胞對BPE的敏感性略有不同，PC-3和DU-145細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（IC50）分別為386μ g/mL和545μg/mL，見圖1。

圖1 不同濃度油菜花粉提取物作用48h后前列腺癌細(xì)胞的抑制率

3.2 藥物作用后的前列腺癌細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 PC-3與DU-145細(xì)胞的對照組細(xì)胞細(xì)胞增殖旺盛，排列緊密，邊界清楚，有的細(xì)胞重疊生長，折光度好，胞質(zhì)飽滿；實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞與對照組相比，由于濃度的作用，細(xì)胞數(shù)量銳減，細(xì)胞排列稀疏、胞膜有破損現(xiàn)象，胞漿內(nèi)有空泡變性，見圖2～5。

PC-3對照組細(xì)胞膜完整，細(xì)胞胞漿中有豐富的細(xì)胞器，細(xì)胞膜表面?zhèn)巫恪⑽⒔q毛結(jié)構(gòu)豐富，核膜完整；經(jīng)1000μg/mL濃度BPE作用48h的PC-3細(xì)胞可見線粒體腫脹變性，線粒體嵴消失，核結(jié)構(gòu)破壞，細(xì)胞表面微絨毛減少，部分脫落。DU-145對照組細(xì)胞膜完整，細(xì)胞核大，染色質(zhì)豐富。DU-145經(jīng)1000μg/mL濃度 BPE作用48h后可見胞膜破，胞漿流失，未見明顯的細(xì)胞器，見圖6～9。

圖2 PC-3對照組（×100）

圖3 PC-3實(shí)驗(yàn)組48h（×200)

圖4 DU-145對照組（×100)

圖5 DU-145實(shí)驗(yàn)組48h（×200)

圖6 PC-3對照組

圖7 PC-3實(shí)驗(yàn)組48h

圖8 DU145對照組

圖9 DU-145實(shí)驗(yàn)組48h

3.3 BPE對PC-3、DU-145細(xì)胞周期的影響 PC-3及DU-145細(xì)胞在油菜花粉提取物（濃度為1000ug/mL）處理48h后，G0/G1期比例上升，分別為67.33%和68.15%。S期、G2-M期比例下降，PC-3分別下降16.66%和16.01%，DU-145分別下降21.22%和10.63%。油菜花提取物可能通過調(diào)控各腫瘤周期來發(fā)揮其對各腫瘤細(xì)胞的生長抑制作用，其可通過阻止前列腺癌細(xì)胞在G0/G1期，抑制細(xì)胞增殖。

4 討 論

高增殖性是惡性腫瘤的重要生物學(xué)特性之一，也是臨床腫瘤患者死亡的主要原因。目前，對腫瘤生長抑制的研究已經(jīng)成為腫瘤治療學(xué)研究的主要內(nèi)容[1]。非激素依賴性前列腺癌（hormone refractory prostate cancer,HRPC）是前列腺癌發(fā)展的最后階段，除少數(shù)局限于前列腺包膜內(nèi)的早期前列腺癌患者可行根治性前列腺切除術(shù)外，患者往往死于激素非依賴性細(xì)胞的增殖擴(kuò)散[2]。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用CCK-8法檢測BPE對PC-3和DU-145細(xì)胞增殖的抑制作用。CCK-8是一種新型的活細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑,可用于簡便而準(zhǔn)確的細(xì)胞增殖和毒性分析,與MTT等其它四唑鹽相比具有操作簡便、靈敏度高、可重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn),已經(jīng)開始被廣泛應(yīng)用[3]。研究結(jié)果表明，在一定范圍內(nèi)隨著BPE濃度的增加，其對PC-3和DU-145細(xì)胞增殖的抑制作用越明顯,呈典型的劑量依賴性，PC-3和DU-145細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（IC50）分別為386μg/mL和545μg/mL，當(dāng)濃度繼續(xù)升高時(shí)，對前列腺癌細(xì)胞的抑制率反而下降，具體的原因和機(jī)制，需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)和探討其原因和機(jī)制。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，BPE對前列腺癌PC-3和DU-145細(xì)胞有明顯殺傷作用，電鏡攝片中可見BPE作用細(xì)胞后，線粒體腫脹變性，線粒體嵴消失，提示線粒體可能是BPE作用的靶細(xì)胞器之一。線粒體為細(xì)胞各種生命活動(dòng)提供能量，線粒體參與細(xì)胞凋亡，在細(xì)胞凋亡過程中關(guān)鍵作用的Bcl-2家族蛋白分布在線粒體外膜，核膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，該家族成員通過操控線粒體膜間隙蛋白的釋放對細(xì)胞凋亡加以調(diào)控。BPE是否通過Bcl-2/Bax蛋白通路來調(diào)控細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞增殖有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，BPE作用后兩株前列腺癌細(xì)胞大多被阻滯在G0/G1期，這說明BPE主要作用在DNA合成前期，為BPE與其他細(xì)胞周期特異性化療藥物聯(lián)合使用提供了理論依據(jù)，這一結(jié)果與石柱等[4]研究天花粉蛋白對小鼠前列腺癌細(xì)胞RM21的實(shí)驗(yàn)結(jié)果類似。細(xì)胞周期調(diào)控異常是細(xì)胞癌變的重要機(jī)制之一，通過藥物對細(xì)胞周期干預(yù)或調(diào)控使腫瘤細(xì)胞周期停滯，避免腫瘤細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂期，從而可阻抑其進(jìn)一步增殖，這也是治療腫瘤的有效手段之一。對BPE具體抗腫瘤機(jī)制及其安全有效地給藥方式深入研究，將為應(yīng)用于臨床治療前列腺癌提供更多理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Suppression Effect of Brassica Campestris Pollen Extract on the Growth of Prostate Cancer Cell in vitro

ZHUChihong,DULingbin,GAOYun,et al.Cancer Research Institute,Zhejiang Cancer Hospital,Hangzhou(310003),China

Objective:To study the effects ofBrassica campestris pollen extract(BPE)on prostate cancer cell line in vitro. Methods:PC-3 and DU-145 cell line from prostate cancer were treated with various concentrations of BPE.Morphologic change was observed with light microscope and apoptosis change by electron microscope.The suppression rate of the growth of prostate cancer cell was evaluated by using CCK-8 assay.Changes in prostate cancer cell cycle were observed by FAC SCailibur.Result:The growth of prostate cancer cells were markedly inhibited after being treated with BPE.After the treatment,obvious morphological change was observed;FCMshowed that the rate ofG0/G1 phase was increased and that the rate of S and G2-Mphase was decreased in the cell cycle.ConclusionBPE may have remarkable effect on inhibitingthe growth ofPC-3 and DU-145 cell line fromprostate cancer.

Brassica campestris pollen extract prostate cancer cell line growth suppression anti-tumo

浙江省科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目（No.2005C33005）

曹明富E-mail:mfcao@hztc.edu.cn

2010-08-04