隋東江，李偉生，王蓉美，陳燕俠，王肇源，李鳳芝，李洪霞

（1.空軍總醫(yī)院干部病房東樓3區(qū)，北京 100142；2.吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院中心研究室，吉林 長春 130033）

轉(zhuǎn)染GML基因提高肺癌A549細胞對順鉑殺傷的敏感性

隋東江1，李偉生1，王蓉美1，陳燕俠1，王肇源1，李鳳芝1，李洪霞2*

（1.空軍總醫(yī)院干部病房東樓3區(qū)，北京 100142；2.吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院中心研究室，吉林 長春 130033）

目的 探討轉(zhuǎn)染GML基因?qū)樸K殺傷肺癌A549細胞敏感性的影響。方法 應(yīng)用脂質(zhì)體將GML基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染入肺癌A549細胞。應(yīng)用RT-PCR測定GML基因的表達。應(yīng)用MTT法測定GML基因?qū)τ贏549生長的影響，以及不同濃度順鉑對細胞的殺傷率，以此計算出順鉑殺傷細胞的IC50。結(jié)果 RT-PCR結(jié)果顯示，在GML基因轉(zhuǎn)染的A549細胞有GML基因的表達，而在轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒以及正常A549細胞未見GML基因的表達。轉(zhuǎn)染GML基因的A549細胞生長數(shù)目明顯低于未轉(zhuǎn)染組。順鉑對于轉(zhuǎn)染GML基因的A549細胞殺傷效率明顯高于未轉(zhuǎn)染組，轉(zhuǎn)染GML基因細胞與為未轉(zhuǎn)染基因細胞相比其IC50降低4倍。結(jié)論 轉(zhuǎn)染GML基因可以顯著提高肺癌A549細胞對順鉑的敏感性。

GML基因；A549細胞；順鉑；化療敏感性

順鉑是迄今為止治療肺癌最有效的化學藥物之一，但其治療的療效仍維持在20%～30%。因此如何提高化療藥物的治療效果是肺癌治療過程中急需解決的問題。近幾年的一些研究表明腫瘤細胞的某些基因的表達可以影響順鉑對腫瘤治療的敏感性，因此通過提高或減少這些基因的表達可以有效提高腫瘤針對順鉑治療的敏感性[1-5]。

GML（glycosylphosphatidylinositol-anchoredmoleculelikeproteingene）蛋白是由p53分子誘導表達的一種糖基化磷脂酰肌醇（GPI）錨定分子樣蛋白，參與細胞周期與細胞凋亡的0控[6]，NaamuraY等在體外對非小細胞肺癌患者的腫瘤細胞進行化療藥物的體外敏感性實驗中發(fā)現(xiàn)，高表達GML基因的腫瘤細胞具有對順鉑較高的敏感性。這說明了GML基因的高表達可能提高肺癌細胞對于順鉑的敏感性[7]。因此本研究擬將GML基因轉(zhuǎn)導入肺癌A549細胞內(nèi)，觀察導入的GML基因是否可以提高肺癌細胞對順鉑殺傷的敏感性，從而進一步明確GML基因在順鉑治療肺癌中的作用，為提高順鉑治療肺癌效果提供新的方案。

1 資料與方法

1.1 一般資料

人肺腺癌A549細胞株購自中國科學院上海生命科學院細胞所，胎牛血清購自杭州四季青，高糖DMEM培養(yǎng)基、G418均購自Gibco公司，質(zhì)粒pcDNA3.1（+），以及pcDNA3.1（+）-GML由本科室保存與構(gòu)建，轉(zhuǎn)染試劑LipfectinAmina2000購自invitrogen公司，細胞RNA提取試劑盒與RT-PCR試劑盒均購自北京天根公司，MTT購自sigma公司，化療藥物順鉑購自齊魯制藥，設(shè)計的引物由上海生工合成。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與GML基因細胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染將人肺腺癌A549細胞株接種于10%FCS的DMEM培養(yǎng)液中（添加青鏈酶素的終濃度為100 U/mL），置37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。用0.25%胰蛋白酶消化對數(shù)生長期腫瘤細胞，吹打成單細胞懸液，以1×104/孔接種于24孔培養(yǎng)板，待細胞長至孔板的70%～80%時應(yīng)用Lipfectinamine2000分別進行質(zhì)粒pcDNA3.1（+）與pcDNA3.1（+）-GML的轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48 h后按1：3傳代，用篩選培養(yǎng)基培養(yǎng)（400 ug/mL G418），每3～4 d換液1次，直至出現(xiàn)成團生長的轉(zhuǎn)染細胞集落。挑選單個集落，接種于6孔板中，培養(yǎng)至第10代開始，G418濃度降半量維持，至第15-20代建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞株。其中轉(zhuǎn)染pcDNA3.1（+）質(zhì)粒的A549細胞記作A549-vector，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1（+）-GML質(zhì)粒的A549細胞記作A549-GML，而未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的A549細胞記作A549。

1.2.2 RT-PCR測定GML基因的表達依據(jù)引物設(shè)計的原則，參照人β-actin基因cDNA序列設(shè)計一對引物，上游引物為5’CTCCATCCTGGCCTCGCTGT3’；下游引物：5’GCTGTCACCTTCACCGTTCC3’，PCR產(chǎn)物長度為268bp。參照人GML基因的cDNA序列（NM_002066）設(shè)計一對引物，上游引物為5’ATGC GCGCTCAGTGGACTTACAG3’；下游引物為：5’CCAGCCTCACAGTTCCTTCT3’PCR產(chǎn)物長度為358bp.應(yīng)用細胞RNA提取試劑盒分別提取A549、A549-vector，A549-GML細胞的總RNA，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄，生成各組細胞的cDNA，以各組細胞的cDNA為模板，應(yīng)用設(shè)計的合成的β-actin與GML基因引物進行PCR。應(yīng)用瓊脂糖凝膠電泳觀察PCR結(jié)果。

1.2.3 化療藥物作用培養(yǎng)細胞分別將處于對數(shù)生長期的A549、A549-vector、A549-GML細胞以5×103/孔接種于96孔板中，常規(guī)培養(yǎng)24 h后細胞進行換液。將作用細胞的化療藥物順鉑按照血藥峰值濃度（ppc）進行配置，其保存濃度為血藥峰值濃度的200倍，順鉑血藥峰值濃度為3.6 ug/mL，藥物作用細胞的濃度為ppc濃度的200%，100%，50%，25%，12.5%以及6.25%。每種藥物濃度做3個平行孔。同時設(shè)定各組細胞的未加藥孔為對照孔。

1.2.4 細胞存活檢測以及藥物敏感性判定應(yīng)用MTT法測定不同時間細胞的A549、A549-vector、A549-GML細胞增殖。應(yīng)用MTT法測定順鉑作用三種細胞48 h后的細胞存活。根據(jù)測定的OD值計算化療藥物對細胞的殺傷率。計算公式為：細胞的殺傷率=（對照孔OD值-實驗孔OD值）/對照孔OD值。應(yīng)用細胞的殺傷率與對應(yīng)的藥物濃度建立曲線方程，計算出化療藥物針對該細胞的IC50即使半數(shù)細胞死亡的藥物濃度。

1.3 統(tǒng)計學分析

所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 10.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料采用“”表示，多組均數(shù)間的比較采用單因素方差分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 實驗結(jié)果

2.1 GML基因在A549細胞內(nèi)的表達

提取A549.、A549-vector與A549-GML細胞的RNA，應(yīng)用RT-PCR分別測定GML基因在三組細胞的mRNA表達水平。凝膠電泳結(jié)果顯示：在268bp處，三組細胞都有電泳條帶，說明三組細胞都有人β-actin基因mRNA的表達。在358bp處在A549-GML細胞組可見明顯的DNA條帶，而A549與A549-vector細胞組未見DNA條帶，說明只有GML基因轉(zhuǎn)染的A549細胞內(nèi)才有GML基因的表達。上述結(jié)果表明GML基因已被成功轉(zhuǎn)染入A549細胞（圖1）。

圖1 RT-PCR檢測GML基因mRNA表達的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

2.2 GML基因?qū)549細胞生長的影響

應(yīng)用MTT法測定不同時間內(nèi)三組細胞的生長情況。結(jié)果顯示三組細胞隨著時間的延長，細胞數(shù)目多有所增加，但在第4天，A549-GML細胞其細胞數(shù)目增多的水平明顯低于其他兩組細胞，說明GML基因可以抑制A549細胞的生長（圖2）。

圖2 三組A549細胞的生長曲線

2.3 順鉑對三組細胞殺傷結(jié)果

應(yīng)用MTT法測定順鉑對于三組A549細胞的殺傷功能。結(jié)果顯示隨著藥物濃度的下降，對細胞的殺傷率也逐漸下降，其中A549-GML組下降幅度低于其他兩組。順鉑對于三組細胞殺傷的IC50分別為：A549細胞為41.1（%ppc），A549-VECTOR細胞為40.3（%ppc），A549-GML為11.5（%ppc）。上述結(jié)果說明轉(zhuǎn)染GML基因明顯提高了A549細胞對于順鉑的敏感性（圖3）。

圖3 順鉑對三組細胞的殺傷率曲線

3 討論

肺癌是嚴重威脅人類健康與生命的惡性腫瘤，在非小細胞肺癌治療仍以手術(shù)治療為主，而術(shù)后的化學治療作為重要輔助手段。順鉑是進行非小細胞肺癌化療的主要藥物之一。但單純藥物的應(yīng)用效果仍然有限。因此通過多種治療手段的聯(lián)合應(yīng)用以期提高肺癌治療的效果。

GML基因是一種糖基化磷脂酰肌醇（GPI）錨定分子樣蛋白，其表達受到P53基因的調(diào)控。幾個研究表明，該基因的表達與腫瘤細胞針對某些化療藥物的敏感性有關(guān)。TakashiTokino等在對GML基因生物活性研究的過程中發(fā)現(xiàn)該基因與食管癌化療藥物的敏感性相關(guān)，將GML基因轉(zhuǎn)染入喉癌細胞株后，明顯提高了喉癌細胞對紫杉醇的敏感性[8-9]。HashimotoY等研究認為GML基因在腸癌細胞系的高表達與腫瘤細胞對化療藥物絲裂霉素與氟尿嘧啶的敏感性相關(guān)[10]。NakamuraY等在體外對非小細胞肺癌患者的腫瘤細胞進行化療藥物的體外敏感性實驗中發(fā)現(xiàn)，腫瘤細胞高表達GML基因的患者對順鉑具有的敏感性[7]。在這些研究的基礎(chǔ)上，本實驗將GML基因轉(zhuǎn)染肺癌細胞株A549細胞，探討了GML基因的高表達是否能夠提高肺癌細胞對順鉑的敏感性。

本實驗結(jié)果表明轉(zhuǎn)染GML基因明顯降低了A549細胞的生長的速度，說明GML本身可以抑制A549細胞的生長，其抑制的機制需要進一步研究。轉(zhuǎn)染GML基因的A549細胞與未轉(zhuǎn)染的GML基因的A549細胞相比，顯著提高了對順鉑殺傷的敏感性。其IC50減少了將近4倍。通過本研究進一步證實了GML基因的表達與非小細胞肺癌對于順鉑化療的敏感性具有密切關(guān)系。檢測該基因在肺癌組織內(nèi)的表達情況，可以作為判定肺癌針對順鉑化療的敏感性指標之一。同時可將GML基因治療與化療相結(jié)合，提高肺癌治療效果。

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Transfer of GML Gene Increase the Chemosensitivity of Cisplatin to A549 Cell In Vitro

SUI Dong-jiang,LI Wei-sheng,WANG Rong-mei,CHEN Yan-xia,WANG Zhao-yuan,LI Feng-zhi,LI Hong-xia
(Air Force General Hospital,PLA,BeiJing 100142,China)

Objective To investigate the effect of GML gene on the chemosensitivity of cisplatin to A549 cell In vitro.Methods The GML gene was transfected stably into A549 cells by lipofectamin.The GML gene mRNA levels at A549 cell were measured by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR).The effect of GML gene on cell growth and In vitro cytotoxicity of cisplatin at various concentrations were analyzed with MTT.IC50 of cisplatin that defined as the drug concentration required to produced 50% inhibition of cell growth was calculated for judging the chemosensitivity of drug to A549 cell.Results The RT-PCR result showed increased obviously of GML gene mRNA levels in A549 cells with transfected GML gene when compared with A549 cells without transfected GML gene.The MTT results show GML gene transfered A549 cells exhibited marked declines in proliferation when compared to the parental A549 cells.IC50 of cisplatin is also decreased four times for GML transfection A549 cells compared A549 cells.Conclusion GML gene can increase the chemosensitivity of cisplatin to A549 cells.

GML gene;A549 cells;Cisplatin;Chemosensitivity

R734.2

A

10.3969/j.issn.1674-070X.2011.04.007.019.03

2010－12－08

隋東江（1975－），男，長春人，主治醫(yī)師，主要從事老年呼吸病研究。

*李洪霞（1972－），女，長春人，副主任醫(yī)師，主要從事腫瘤分子機理研究。

馬宏宇）